Ett enkelt sätt att framkalla experimentella autoimmuna neurit i C57BL/6 möss för funktionella och neuropatologiska bedömningar
Summary
Denna rapport beskriver en enkel metod för att framgångsrikt framkalla experimentella autoimmuna neurit (EAN) med hjälp av myelin protein noll (P0)180-199 peptid i kombination med Freunds kompletta adjuvans och kikhosta toxin. Vi presenterar en sofistikerad paradigm kan korrekt bedöma omfattningen av funktionella underskott och neuropatologi som förekommer i denna EAN.
Abstract
Experimental autoimmune neurit (EAN) är en väl uppskattad experimentell modell för autoimmuna perifera demyeliniserande sjukdomar. EAN-sjukdomen framkallas av immuniseringsämnet möss med neurogen peptider direkt en inflammatorisk attack mot komponenter i det perifera nervsystemet (PNS). Senaste framstegen har aktiverat induktion av EAN i relativt resistent C57BL/6 mus linjen med hjälp av myelin protein noll (P0)106-125 eller P0180-199 peptider levereras i adjuvant kombinerat med injektion av kikhosta toxin. Förmågan att inducera EAN i C57BL/6 stam möjliggör användningen av de talrika genetiska verktyg som finns på denna mus bakgrund, och därmed tillåter sofistikerade studien av sjukdomspatogenes och förhör i den mekanistiska åtgärden av romanen therapeutics i kombination med transgena metoder. I denna studie visar vi ett enkelt tillvägagångssätt för att framgångsrikt inducera EAN använder P0180-199 peptiden i C57BL/6 möss. Vi beskriver också ett protokoll för bedömning av funktionella underskott som uppstår i denna modell, åtföljs av en mängd neuropatologiska funktioner. Således, denna modell är en kraftfull experimentell modell att studera patogenesen av människans perifera demyeliniserande neuropatier, och att avgöra effekten av potentiella terapier som syftar till att främja myelin reparation och skydda mot nervskador i autoimmuna neurit.
Introduction
Perifera neuropatier kan vara genetiska ursprung eller förvärvade, med förvärvade neuropatier har antingen metabola, ischemisk, inflammatoriska eller giftiga precipitants. Dessa sjukdomar klassificeras också med fördel som antingen axonal eller demyelinative ursprung. Den vanligaste förvärvade demyeliniserande perifera neuropatier är akut inflammatorisk demyeliniserande polyneuropati (AIDP, även känd som Guillain-Barrés syndrom, GBS) och kronisk inflammatorisk demyeliniserande polyneuropati (CIDP)1, 2 , 3 , 4. båda kännetecknas pathogenetically av en autoimmun reaktion riktad mot den myelinskidan, orsakar demyelinisering av perifera nerver. I dessa sjukdomar, aktiverade T-celler korsa blod nerv barriären och generera en immunreaktion i PNS. Aktivering av makrofager i nerven sedan orsakar demyelinisering antingen direkt via fagocytos attack eller indirekt via utsöndrade inflammatoriska mediatorer, vilket resulterar i kliniska funktionshinder såsom förlamning och sensorisk dysfunktion5. Medan demyeliniserade axoner behåller förmågan att vara remyelinated efter demyelinisering, remyelination är ofta försenad eller ofullständig, vilket leder till känslighet av nakna axoner till irreversibla skador, vilket är den största orsaken till permanent kliniska funktionshinder. För närvarande är de mest effektiva behandlingarna är immunmodulerande, men trots sin effekt, i många fall återhämtning ofta långsam och ~ 25% patienter kommer att uppleva kvarstående funktionella underskott som avsevärt minska deras livskvalitet6, 7.
EAN är en allmänt använd djurmodell av demyeliniserande neuropati som har gett värdefulla insikter om patogenes och ett sätt att bedöma nya terapeutiska medel4. Denna modell kan induceras hos olika arter såsom kaniner, råttor, möss och marsvin, och framkallas av immunisering med neurogen antigener. Ytterst beror framgångsrika EAN induktion emellertid på ett lämplig immunsvar för sjukdom inträffar. Med tanke på de arter (och inter-djurarter/stam) variationerna i immunförsvaret, har flera kombinationer av antigener och adjuvans utvecklats för att framgångsrikt inducera EAN. När det gäller murina genetiska verktyg är den C57BL/6 den mest använda; den traditionella P2 protein peptiden 57-81 (P257-81) som resulterar i sjukdom i mottagliga SJL mus stam8 är dock inte att olaglig patogenes leder till funktionella underskott i C57BL/6 stam. Lyckligtvis, sensibilisering paradigm med P0106-125 eller P0180-199 peptider, levereras i adjuvant kombinerat med injektion av kikhosta toxin kan övervinna detta hinder, aktivera avancerade genetiska verktyg för att utnyttjas i de murina EAN modell.
Här presenteras en enkel metod för induktion av EAN i C57BL/6 möss. Dessutom finns en omfattande detaljerad strategi som ska utvärderas de funktionella och neuropatologiska underskotten som förknippas med sjukdomen. P0180–199 peptid9 valdes framför de P057-81 alternativa10. P0180–199 modellen har beskrivits för att producera mindre allvarliga kliniska tecken jämfört med P057-81 alternativa10, och är därför sannolikt att stå emot införandet av potentiellt skadliga genetiska störningar, återhämta sig från kirurgiska ingrepp (såsom osmotisk pump implantation), och är mottagliga för löpband gait funktion testning4. Dock kan de löpband gait funktionstester och histologiska protokoll som beskrivs här enkelt appliceras när man studerar sjukdomen i en P057-81 inducerad variant.
Protocol
Representative Results
Discussion
Denna rapport beskriver en enkel metod för att framkalla EAN använder P0180-199 peptiden i C57BL/6 möss, vilket möjliggör kvantifiering av viktiga neuropatologiska och funktionella underskott hos möss inducerad med EAN. Distinkta i EAN induktion-protokollet som beskrivs här är användning av anestesi medan du utför immunisering injektionerna. Användning av isofluran anestesi förbättrar förmågan att säkerställa att den totala volymen av inokulatet injiceras subkutant på önskad plats med minima…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
DGG är en NHMRC Peter Doherty och multipelskleros forskning Australien (MSRA) tidiga karriär Fellow. JLF stöds av en MSRA postdoktorsstipendium. Detta arbete stöds av Australian National Health och medicinsk forskning rådet (NHMRC) projektet bevilja JX #APP1058647.
Materials
| C57BL/6, male, 6-8 weeks old | Australian Bioresources Cenre, WA, Australia | ||
| Pertussis toxin | List Biological Laboratories, Inc., CA, USA | #181 | |
| 0.1M mouse-isotonic phosphated buffered salined (MT-PBS) | Laboratories will have their own protocol. | ||
| Isoflurane | Pharmachem, QLD, Australia | Laboratories will have their own protocol for administration. | |
| P0180–199 peptide | Wuxi Nordisk Biotech Co. Lt. SHG, CHN | P0180–199, sequence S–S–K–R–G–R– Q–T–P–V–L–Y–A–M–L–D–H–S–R–S | |
| Heat killed Mycobacterium tuberculosis (strain H37RA) | Difco, MI, USA | #231141 | |
| Freund's complete adjuvant (FCA) | Difco, MI, USA | #263910 | |
| 16% Paraformaldehyde (PFA) | Electron Microscopy Services | #15710 | Dilute to 4% PFA day of tissue collection. |
| 25% glutaraldheyde | ProSciTech Pty Ltd, QLD, Australia | #11-30-8 | Dilute to 2.5% glutaraldehyde day of fixation. |
| Sodium azide | Chem-Supply Pty Ltd, SA, Australia | SL189 | Create 10% (w/v) stock in 0.1M MT-PBS. Use at 0.03% (v/v). |
| Sucrose | Chem-Supply Pty Ltd, SA, Australia | SA030 | Use at 30% (w/v). |
| Optimum cutting temperature (OCT) medium | Sakura Finetek, CA, USA | #4583 | |
| Normal donkey serum | Merck Millipore, MA, USA | #S30-100 | Use as antibody diluent at 10% (v/v) or other concentration determined by own laboratory. |
| Triton-X 100 | Sigma Aldrich, MI, USA | #90o2-31-1 | Use in antibody diluent at 0.3% (v/v) or other concentration determined by own laboratory. |
| rabbit anti-amyloid precursor protein (APP) | Invitrogen (Life Technologies), CA, USA | S12700 | Used at 1:400 or titrate in own lab. |
| rabbit anti-contactin-associated protein-1 (Caspr) | Gift from Prof Elior Peles, Wiezmann Institute of Science, Israel | Used at 1:500 or titrate in own lab. | |
| Appropriate Alexa Fluor conjugated secondary antibodies | Molecular Probes (Life Technologies), OR, USA | Various | Use at 1:200 or titrate in own lab. Choice of species the antibody was raised in and Alexa Fluor chosen is at the discretion of each laboratory. |
| Aqueous mounting solution | Dako (Agilent), CA, USA | #S3023 | Each laboratory will have their own preference. |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| 0.5 mL syringe with 301/2 g needles | BD | #326105 | |
| 23 g needles | BD | #305143 | |
| Red ink pad | Any red ink pad or red food dye could be used to mark the animals' feet. | ||
| DigiGate apparatus (includes treadmill) | eMouse Specifics Inc. Framingham, MA | ||
| DigiGate Imaging System | eMouse Specifics Inc. Framingham, MA | ||
| Stopwatch | Any timer may be used. | ||
| DigiGait 8 Software | eMouse Specifics Inc. Framingham, MA | ||
| Dissecting microscope | Zeiss | Any appropriate dissecting microscope may be used. | |
| Charged slides | Superfrost Plus, Lomb Scientific Pty Ltd | SF41296SP | |
| Cyrostat | Leica | Any suitable cyrostat may be used. | |
| Perfusion equipment and dissecting instruments | Labs will have their own perfusion protoctols. | ||
| Opaque humified chamber | Labs may produce their own using an opaque plastic container. | ||
| PAP pene | GeneTex (USA) | Wax pencil, or surface tension may also be used to create a well around the tissue section. | |
| Confocal microscope | Zeis LSM780 | Any confocal microscope with appropriate laser lines may be used. | |
| FIJI/Image J | National Institues of Health | Available from www.fiji.sc |
Referências
- Newswanger, D. L., Warren, C. R. Guillain-Barre syndrome. Am Fam Physician. 69 (10), 2405-2410 (2004).
- Ruiz, E., Ramalle-Gomara, E., Quinones, C., Martinez-Ochoa, E. Trends in Guillain-Barre syndrome mortality in Spain from 1999 to 2013. Int J Neurosci. 126 (11), 985-988 (2016).
- Walling, A. D., Dickson, G. Guillain-Barre syndrome. Am Fam Physician. 87 (3), 191-197 (2013).
- Gonsalvez, D. G., et al. A Functional and Neuropathological Testing Paradigm Reveals New Disability-Based Parameters and Histological Features for P0180-199-Induced Experimental Autoimmune Neuritis in C57BL/6 Mice. J Neuropathol Exp Neurol. 76 (2), 89-100 (2017).
- Berg, B., et al. Guillain-Barre syndrome: pathogenesis, diagnosis, treatment and prognosis. Nat Rev Neurol. 10 (8), 469-482 (2014).
- Koller, H., Schroeter, M., Kieseier, B. C., Hartung, H. P. Chronic inflammatory demyelinating polyneuropathy–update on pathogenesis, diagnostic criteria and therapy. Curr Opin Neurol. 18 (3), 273-278 (2005).
- Griffin, J. W., et al. Pathology of the motor-sensory axonal Guillain-Barre syndrome. Ann Neurol. 39 (1), 17-28 (1996).
- Taylor, W. A., Hughes, R. A. Experimental allergic neuritis induced in SJL mice by bovine P2. J Neuroimmunol. 8 (2-3), 153-157 (1985).
- Zou, L. P., et al. P0 protein peptide 180-199 together with pertussis toxin induces experimental autoimmune neuritis in resistant C57BL/6 mice. J Neurosci Res. 62 (5), 717-721 (2000).
- Miletic, H., et al. P0(106-125) is a neuritogenic epitope of the peripheral myelin protein P0 and induces autoimmune neuritis in C57BL/6 mice. J Neuropathol Exp Neurol. 64 (1), 66-73 (2005).
- Hafer-Macko, C., et al. Acute motor axonal neuropathy: an antibody-mediated attack on axolemma. Ann Neurol. 40 (4), 635-644 (1996).
- Griffin, J. W., et al. Early nodal changes in the acute motor axonal neuropathy pattern of the Guillain-Barre syndrome. J Neurocytol. 25 (1), 33-51 (1996).
