Studien av organogenesen har länge förlitat sig på observation av morphogenetic händelser i det växande embryot. Dessa studier är ofta beroende av användning av fluorescerande färgämnen eller lineage tracing reportrar i kombination med märkning av definierade referens populationer. ¹ genom att jämföra den relativa positionen av dessa etiketter, information kan utläsa på ursprung, rörelse eller ultimate bidrag i en population av intresse. Transplantation och öde mappning experiment kan du använda antingen morfologiska sevärdheter eller injektion av färgämnen i icke-rörliga härstamningar för att definiera utgångspunkten för celler i intresse, som undersöks sedan för bidrag till utvecklade embryot. ^{2 , 3 , 4 , 5} genetiska härstamning-tracing experiment använda samma koncept med väldefinierade reporter alleler som används till label cellpopulationer utan experimentella manipulation. Nyckeln till dessa synsätt är förmågan att avgöra, med hög rumslig upplösning, platser av den experimentella och referens etiketter. Dessa metoder har gett enastående framsteg i pre-implantation utveckling och explant organogenesen studier. ^{6 , 7 , 8 , 9}

De utvecklingsmässiga händelser som ligger bakom hjärtat morfogenes har beskrivits allt väl under de senaste åren. ¹⁰ en av de stora upptäckterna inom detta forskningsområde är beskrivningen av ett antal stamceller populationer som kan särskiljas genom uttryck av unika markörer. ¹¹ dessa populationer inkluderar den första och andra hjärtat fält (FHF och SHF), som finns inom hjärt månskäran på främre sidan av embryot på embryonala dag (E) 8,25 mus utveckling. ¹² dessa populationer undersöks ofta genom en kombination av wide-fältet mikroskopi, som ger vävnad-nivå information, och seriell sektionering med immunofluorescens-analyser, som erbjuder hög cellulära upplösning men bara tvådimensionell rumslig information. ¹³ således, medan dessa studier har kraftigt avancerade vår förståelse av hjärtat utveckling, tillgängliga metoder har begränsat i djup kvantitativ analys av morfogenes under dessa stadier, skapar behovet av metoder för att undersöka den organisationen av dessa populationer på hel-organismen nivå.

Den senaste tidens framsteg inom både konfokalmikroskopi och 3D-bildanalys möjliggör hög upplösning och hög genomströmning algoritmisk rekonstruktioner av celler och strukturer i situ med relativ lätthet, därigenom bereda väg för detaljerade studier av komplexa cellulära strukturer. ¹⁴ med ökningen av datorkraft och utveckling av stordata verkställande algoritmer, båda behövs för att hantera den exponentiella ökningen av storleken på imaging data-set, analyser kan nu vara fullständigt automatiserad. ¹⁵ automatiserad analys av imaging data-set har fördelen att vara opartisk, men det är bara lika tillförlitliga som kvaliteten på de ingående datamängden. sedan, är det nödvändigt att bästa praxis används under förvärv och före bildbehandling för att säkerställa högsta kvalitet, objektiv analys. ¹⁶ protokoll kan vara helt automatiserad och delade för reproducerbarhet och de algoritmer som används av proprietär programvara är lätt tillgängliga via bibliotek som ska användas av forskare som har förtrogenhet med moderna egna eller öppen källkod utvecklarverktyg. ¹⁷

Följande protokoll förklarar de åtgärder som krävs för att utföra en sådan analys på en väl definierad modell för organogenes, bildandet av hjärt crescent under hjärtat utveckling. Närmare bestämt det här protokollet beskriver hur (1) skörden och dissekera hjärt crescent scenen embryon, (2) utföra hela mount immunofluorescens för referens (Nkx2-5) och experimentell (Foxa2Cre:YFP^18,19) markörer, (3) förbereda och bild de embryon som använder konfokalmikroskopi, och slutligen (4) analysera och kvantifiera de resulterande bilderna med hjälp av avancerade tredimensionella metoder. Medan den kardiella halvmånen används som exempel här, med lämpliga ändringar, kan detta protokoll användas för analys av flera utvecklingslinjer i gastrula tidig somite arrangerar embryon.