Изменение ролик трубки метод для точно локализованы и повторяющиеся прерывистый изображений во время долгосрочного культуры срезы мозга в замкнутой системе
Summary
Представлены здесь метод трубки модифицированных ролика для культивирования и прерывистый с высоким разрешением изображений грызунов мозга ломтики в течение многих недель с точное перемещение на photoetched coverslips. Нейрональных жизнеспособность и морфология срез хорошо поддерживаются. Приложения полностью замкнутой системы с использованием вирусов для конкретного выражения типа клеток предоставляются.
Abstract
Искусственный мозг грызунов фрагменты полезны для изучения поведения клеточном и молекулярном нейронов и глии в среде, которая поддерживает многие из их обычной в естественных условиях взаимодействия. Фрагментов, полученных от различных линий трансгенные мыши или использование вирусных векторов для выражения дневно тегами белки или Репортеры в срезах мозга дикого типа позволяют с высоким разрешением изображений по микроскопии флуоресцирования. Хотя несколько методов были разработаны для визуализации мозга ломтиками, объединяя культуры срез с возможностью выполнения повторяющихся с высоким разрешением изображений конкретных клеток в живых фрагменты течение длительного времени создает проблемы. Это особенно верно, когда вирусных векторов используются для выражения экзогенных белков, так как лучше всего это делается в замкнутой системе для защиты пользователей и предотвращения перекрестного загрязнения. Как сообщается, простые изменения, внесенные метод культуры фрагмента ролика трубки мозга, которые позволяют для повторяющихся с высоким разрешением изображения срезов в течение многих недель в замкнутой системе. Культивирование срезы на photoetched coverslips позволяет использовать величинам точно и быстро переместить на сцену, чтобы идентичные поле изображения со временем до и после различных методов лечения. Для использования этого метода в сочетании с специфического окрашивания нейронов и выражение наблюдать изменения в архитектуре гиппокампа срез, вирусный опосредованной нейрональных выражение флуоресцентных белков и развития Кофилин патологии, приводятся примеры которая ранее наблюдалось в гиппокампе болезни Альцгеймера (AD) в ответ на лечение срез с олигомеров пептида амилоид β (значения).
Introduction
Первичной культуре диссоциированных нейронов из регионов грызунов мозга является важным инструментом, используемым исследователями наблюдать ответы на патологически замешан раздражителей. Однако такие исследования имеют недостаток глядя на нейроны в только 2D и без их глиальных системы поддержки. Кроме того если выросли в условиях очень высокой плотности (640 нейронов/мм2 или около 16% от площади поверхности), в которой она становится невозможным следовать случайных нарост дендритов или аксона для более чем на расстоянии короткой прогулки от его клетки тела, гиппокампа нейрональных жизнеспособность более 4 недель значительно снижается1, ограничивая использование диссоциированных культур для расширенного исследования возрастных патологий. Культивирование ломтиками, приготовленный из грызунов мозга является привлекательным вариантом, который преодолевает эти ограничения, поддерживая организованной клеток архитектуры и жизнеспособности для недель или месяцев. Условия для поддержания многих различных регионах грызунов мозга в ломтик культуры были описаны2.
Две основные методы широко используются для долгосрочных культуры срезы мозга: культивирования на мембраны на интерфейс воздуха жидкость3 или культивирования на coverslips в герметичных труб допускается для поворота в инкубаторе ролика предоставлять аэрации4. Ломтики, культивируемых на мембраны может быть непосредственно imaged с высоким разрешением флуоресцентной микроскопии с помощью вертикально микроскоп и воды погружение цели5. Кроме того фрагменты, культивируемых на мембраны были переданы стекла дно блюда для достижения хорошего разрешения с помощью инвертированного микроскопа6дендритных шипиков. Однако оба метода визуализации ломтиками, выращенных на мембраны являются открытые системы, которые требуют среднего изменения и часто используют антибиотики или противогрибковые для предотвращения или уменьшения загрязнения5,6. Ломтики на мембрану в воздушной среде интерфейса поддерживают отличные морфологии и выживания, но возвращение в строго определенные места во время повторяющихся изображений с высоким увеличением является чрезвычайно сложной, если эксперимент следит только небольшие группы клеток выражая флуоресцентных маркеров. Хотя ломтиками, выращенных на мембраны были использованы с вирусный опосредованной выражением трансгенов5,6, протоколы биобезопасности может потребовать систему закрытых культуры использоваться для некоторых вирусных векторов, которые используются для выражая дневно tagged белков и Репортеры физиологии клетки. Кроме того погружение цели требуют очистки между образцами, последовавших в культуре5. Один из основных приложений мембраны интерфейс культур является объединение с высоким разрешением изображения с электрофизиологии на один раз точки7.
Метод трубки ролик с coverslips внутри пластиковой трубки не разрешают любой электрофизиологии или высоким разрешением изображений без удаления coverslip. Таким образом этот метод чаще всего применяется для долгосрочных исследований, в которых после фиксации замечания были сделаны8. Описанные здесь является метод, который использует техника культура трубки ролика, но на пробуренных из трубы с кусочками на coverslips, которые могут быть многократно imaged для покуда культуры сохраняются. Замкнутые системы требует не среднего изменения для обработки изображений и использует photoetched coverslips предоставлять величинам, которые позволяют изображений с высоким увеличением, дней или недель, точные ранее отображаемого поля.
Мы применяем этот метод для изучения изменений в грызунов гиппокампа, основных мозга региона, участвующих в память и обучение. Грызунов гиппокампа часто рассматривается как модель для патологических или возрастные изменения, наблюдаемые в ходе развития когнитивных нарушений9, например те, которые происходят в AD. Наш метод особенно хорошо подходит для изучения патологические изменения, которые развиваются в один срез с течением времени в ответ на экологические изменения, такие как увеличение значения пептиды, который является характеристикой AD8. Один патологии, связанные с AD мозга человека и грызунов является наличие Кофилин актина агрегатов и стержней, последний содержащие пучки нитей в котором Кофилин и актина находятся в молярное соотношение 1:110,11, 12. стержни наблюдались в фиксированных срезах гиппокампа крысы, после Aβ лечения, а также в пределах кусочек живой грызунов мозга выразив Кофилин GFP подвержены гипоксии8, и они могут способствовать синаптических дисфункции, видели в AD и инсульта. Здесь мы используем этот новый метод культивирования соблюдать время курс и распределения в рамках ломтики выраженной экзогенных химерных флуоресцентных белков, представленный различных вирусов. Затем мы используем нейрональных конкретное выражение конструкцию репортер Кофилин следить за развитием Кофилин стержня и совокупных патологии в срезах гиппокампа в ответ на лечение с растворимых значения олигомеров (oAβ).
Protocol
Representative Results
Discussion
Ролик трубки метод, описанный здесь позволяет для долгосрочного культивирования и высоким разрешением живой изображений нарезанный мозговой ткани. Одной из основных проблем с техникой фрагмент как применяется здесь находится в монтаж и обслуживание ломтиками. Coverslip покрытия, которые…
Materials
| Bottoms from 15 cm culture dishes | VWR Scientific | 25384-326 | |
| Phillips Head Machine Screws (#10-32) | Ace Hardware | 2.5" long and 3/16" in diameter | |
| Flat Washers #10 | ACE Hardware | ||
| Machine Screw Nuts (#10-32) | ACE Hardware | ||
| Rubber Grommets | ACE Hardware | 5/16", thick; 5/8", hole diameter; 1.125", OD | |
| Polyethylene tubing (5/16"; OD, 3/16"; ID) | ACE Hardware | Cut to 1.8" length | |
| Lock Washer #10 | ACE Hardware | ||
| Drill Press, 5 speed | Ace Hardware | ProTech Model 1201 | |
| Nunclon Delta Flat-Sided Tubes | VWR | 62407-076 | |
| Drill bits, 3 mm, 6 mm and 15 mm | Ace Hardware | Diablo freud brand | Drill bits for cutting plastic. |
| Drill bits for wood, 1.5 cm and 1 mm | Ace Hardware | ||
| Wood file, 1/4" round | Ace Harware | ||
| Spring clips, 16 mm snap holder | Ace Hardware | ||
| Swivel Head Deburring Tool, 5" | Ace Hardware | 26307 | |
| Adhesive Silicone Sheet (Secure Seal) | Grace Bio-Labs | 666581 | 0.5 mm Thickness |
| 6 mm hole punch | Office Max | ||
| 12 mm hole punch | thepunchbunch.com | ||
| 70% Ethanol | |||
| Phototeched Coverslips, 12 mm diameter | Bellco Glass, Inc. | 1916-91012 | |
| Bunsen Burner | |||
| Absolute Ethanol | |||
| Nanopure Water | |||
| 3-aminopropyltriethoxylane | Sigma-Aldrich | A3648 | |
| Acetone | Sigma-Aldrich | 179124 | |
| #5 Dumont Forceps | Fine Science Tools | 11251-30 | |
| McIlwain Tissue Chopper | Ted Pella, Inc. | 10180 | |
| Double Edge Razor Blades | Ted Pella, Inc. | 121-6 | |
| Whatman Filter Paper | VWR | 28450-182 | Cut into 5.8 cm diameter circles |
| Poly-chloro-trifluoro-ethylene (Aclar) | Ted Pella, Inc. | 10501-10 | Cut into 5.8 cm diameter circles |
| #21 Surgical Blade | VWR Scientific | 25860-144 | |
| #5 Dumont Forceps | Fine Science Tools | 11251-30 | |
| Spatula, stainless with tapered end | VWR | 82027-518 | |
| Gey's Balanced Salt Solution | Sigma-Aldrich | G9779 | |
| Glucose | ThermoFisher Scientific | 15023-021 | 25% (w/v) Solution, 0.2 mm filter sterilized |
| Chicken Plasma | Cocalico Biologicals | 30-0300-5L | Rehydrate in sterile water, centrifuge at 2500 x g 30 min at 4 °C, quick freeze aliquots in liquid nitrogen and store at -80 °C. |
| Thrombin, Bovine | Fisher | 60-516-01KU | 150 units /ml in GBSS/Glucose, quick freeze aliquots in liquid nitrogen and store at -80 °C. |
| Cell Roller System | Bellco Biotech | SciERA | |
| Roller Incubator | Forma | Model 3956 | |
| N21-MAX | ThermoFisher Scientific | AR008 | |
| Pen/Strep (100X) | ThermoFisher Scientific | 15140122 | |
| 200 mM Glutamine | ThermoFisher Scientific | 25030081 | |
| Glucose | ThermoFisher Scientific | 15023-021 | 25% (w/v) Solution, 0.2 mm filter sterilized |
| Neurobasal A | ThermoFisher Scientific | 10888-022 | Complete Medium: 48 mL Neurobasal A, 1 mL N21-MAX, 0.625 mL 200 mM Glutamine, 0.180 mL 25% Glucose, 0.250 mL 100x pen/strep. |
| Third generation lentivirus packaging | Life Technologies | K4975-00 | |
| 159 K cutoff centrifugal filters (Centricon) | EMD Millipore | ||
| Lentiviral cloning system (InFusion) | Clonetech | ||
| Plasmids 30323, 50856, 51279 | Addgene | ||
| Neuronal cell viability dye (NeuO) | Stemcell technologies | 1801 | Thaw once and quick freeze in 4 µL aliquots. Store at -20 °C |
| Inverted microscope | Olympus | IX83 | |
| Microscope objectives | Olympus | air: 4X, 20; oil: 40X, 60X, | |
| Spinning disc confocal system | Yokagawa | CSU22 | |
| Microscope EMCCD camera | Photometrics | Cascade II | |
| Linear encoded (x,y), piezo z flat top stage | ASI | ||
| Microscope lasers and integration | Intelligent Imaging Innovations | ||
| HEK293T cells | American Type Culture Collection | CRL-3216 | |
| Human Plasmin | Sigma Aldrich | P1867 | 0.002 U/mL in 0.1% bovine serum albumin (0.2 mm filter sterilized), quick freeze in liquid nitrogen and store at -80 °C. |
Referências
- Brewer, G. J., Torricelli, J. R., Evage, E. K., Price, P. J. Optimized survival of hippocampal neurons in B27-supplemented Neurobasal, a new serum-free medium combination. J Neurosci Res. 35 (5), 567-576 (1993).
- Humpel, C. Organotypic brain slice cultures: a review. Neurociência. 305, 86-98 (2015).
- Stoppini, L., Buchs, P. A., Muller, D. A simple method for organotypic cultures of nervous tissue. J Neurosci Methods. 37 (2), 173-182 (1991).
- Gähwiler, B. H. Organotypic monolayer cultures of nervous tissue. J Neurosci Methods. 4 (4), 329-342 (1981).
- Gogolla, N., Galimberti, I., DePaola, V., Caroni, P. Long-term imaging of neuronal circuits in organotypic hippocampal slice cultures. Nat Protoc. 1 (3), 1223-1226 (2006).
- Roo, M. D., Ribic, A. Analyzing structural plasticity of dendritic spines in organotypic slice culture. Methods Mol Biol. 1538, 277-289 (2017).
- Lee, K. F. H., Soares, C., Thivierge, J. -. P., Béīque, J. -. C. Correlated synaptic inputs drive dendritic calcium amplification and cooperative plasticity during clustered synapse development. Neuron. 89 (4), 784-799 (2016).
- Davis, R. C., Maloney, M. T., Minamide, L. S., Flynn, K. C., Stonebraker, M. A., Bamburg, J. R. Mapping cofilin-actin rods in stressed hippocampal slices and the role of cdc42 in amyloid-beta-induced rods. J Alzheimers Dis. 18 (1), 35-50 (2009).
- Clark, R. E., Squire, L. R. Similarity in form and function of the hippocampus in rodents, monkeys, and humans. Proc Natl Acad Sci U S A. 110, 10365-10370 (2013).
- Minamide, L. S., Striegl, A. M., Boyle, J. A., Meberg, P. J., Bamburg, J. R. Neurodegenerative stimuli induce persistent ADF/cofilin-actin rods that disrupt distal neurite function. Nature Cell Biol. 2 (9), 628-636 (2000).
- Rahman, T., et al. Cofilin rods and aggregates concur with tau pathology and the development of Alzheimer’s disease. J Alzheimers Dis. 42 (4), 1443-1460 (2014).
- Bamburg, J. R., Bernstein, B. W. Actin dynamics and cofilin-actin rods in Alzheimer disease. Cytoskeleton(Hoboken). 73 (9), 477-497 (2016).
- He, T. C., Zhou, S., da Costa, L. T., Yu, J., Kinzler, K. W., Vogelstein, B. A simplified system for generating recombinant adenoviruses. Proc Natl Acad Sci U S A. 95 (5), 2509-2514 (1998).
- Minamide, L. S., et al. Production and use of replication-deficient adenovirus for transgene expression in neurons. Methods Cell Biol. 71, 387-416 (2003).
- Kügler, S., Kilic, E., Bähr, M. Human synapsin 1 gene promoter confers highly neuron-specific long-term transgene expression from an adenoviral vector in the adult rat brain depending on the transduced area. Gene Ther. 10 (4), 337-347 (2003).
- Mi, J., et al. A genetically encoded reporter for real-time imaging of cofilin-actin rods in living neurons. PLOS ONE. 8 (12), 83609 (2013).
- Wang, L., Blouin, V., Brument, N., Bello-Roufal, M., Francois, A. Production and purification of recombinant adeno-associated vectors. Methods Mol Biol. 807, 361-404 (2011).
- Matsushita, T., et al. Adeno-associated virus vectors can be efficiently produced without helper virus. Gene Therapy. 5 (7), 938-945 (1998).
- Ward, P., Walsh, C. E. Targeted integration of rAAV vector into the AAVS1 region. Virology. 433 (2), 356-366 (2012).
- Akerboom, J., et al. Optimization of a GCaMP calcium indicator for neural activity imaging. J Neurosci. 32 (40), 13819-13840 (2012).
- Kim, J. H., et al. High cleavage efficiency of a 2A peptide derived from porcine teschovirus-1 in human cell lines, zebrafish and mice. PLOS ONE. 6 (4), 18556 (2011).
- Benskey, M. J., Manfredsson, F. P. Lentivirus production and purification. Methods Mol Biol. 1382, 107-114 (2016).
- Huang, L., Chen, C. Autoprocessing of human immunodeficiency virus type 1 protease miniprecursor fusions in mammalian cells. AIDS Res Ther. 7, 27 (2010).
- Bordat, A., Houvenaghel, M. C., German-Retana, S. Gibson assembly: an easy way to clone polyviral full-length infectious cDNA clones expressing an ectopic VPg. Virol J. 12, 89 (2015).
- Er, J. C., et al. NeuO: a fluorescent chemical probe for live neuron labeling. Angew Chem Int Ed Engl. 54 (8), 2242-2246 (2015).
- Bernstein, B. W., Chen, H., Boyle, J. A., Bamburg, J. R. Formation of actin-ADF/cofilin rods transiently retards decline of mitochondrial potential and ATP in stressed neurons. Am J Physiol Cell Physiol. 291 (5), 828-839 (2006).
- Cichon, J., et al. Cofilin aggregation blocks intracellular trafficking and induces synaptic loss in hippocampal neurons. J Biol Chem. 287 (6), 3929-3939 (2012).
- Stine, W. B., Dahlgren, K. N., Krafft, G. A., LaDu, M. J. In vitro characterization of conditions for amyloid-beta peptide oligomerization and fibrillogenesis. J Biol Chem. 278 (13), 11612-11622 (2003).
- Maloney, M. T., Minamide, L. S., Kinley, A. W., Boyle, J. A., Bamburg, J. R. Beta-secretase-cleaved amyloid precursor protein accumulates at actin inclusions induced in neurons by stress or amyloid beta: a feedforward mechanisms for Alzheimer’s disease. J Neurosci. 25 (49), 11313-11321 (2005).
- Davis, R. C., et al. Amyloid beta dimers/trimers potently induce cofilin-actin rods that are inhibited by maintaining cofilin phosphorylation. Mol Neurodegener. 6, 10 (2011).
- Walsh, K. P., et al. Amyloid-β and proinflammatory cytokines utilize a prion protein-dependent pathway to activate NADPH oxidase and induce cofilin-actin rods in hippocampal neurons. PLOS ONE. 9 (4), 95995 (2014).
- Woo, J. A., et al. RanBP9 at the intersection between cofilin and Aβ pathologies: rescue of neurodegenerative changes by RanBP9 reduction. Cell Death Disease. , 6 (2015).
- Shaw, A. E., Bamburg, J. R. Peptide regulation of cofilin activity in the CNS: a novel therapeutic approach for treatment of multiple neurological disorders. Pharmacol Ther. 175, 17-27 (2017).
