Structurele karakterisering van Mannan celwand polysacchariden in installaties die gebruikmaken van tempo

1. oogsten van plantmateriaal oogst verse plantmateriaal (~ 20 mg) en onmiddellijk het onderdompelen in ethanol 96% (v/v) en Incubeer bij 70 ° C gedurende 30 minuten; dit deactiveert een celwand vernederende enzymen aanwezig. Voor droog materiaal, begin bij stap 2. Let op: Ethanol is ontvlambaar. Opmerking: Een enkele stengel of rozet blad zorgt voor genoeg materiaal voor analyse. Maar, minder fouten ontstaan als een grotere hoeveelheid weefsel is samengebracht en geanalyseerd omdat dit gemakkelijker is te weeg en behandelen. Zorgvuldig opnemen weefseltype en ontwikkelingsstadium, zoals polysacharide structuur varieert met beide. Bijvoorbeeld met Arabidopsis thaliana (gebruikte hier), de fase van het weefsel volgens de methoden van Boyes et al. 15 Opmerking: In dit protocol hebben we gebruikt de onderste helft van de steel van de bloeiwijze, waar de eerste Hauw is volledig langwerpige maar niet vergeling. 2. voorbereiding van Alcohol onoplosbare residu (lucht) voorbereiden lucht, volgens de methode van Mortimer et al. 9 of een andere vergelijkbare methode, om te produceren een poeder ontbreekt oplosbare suikers, zoals sucrose en zetmeel. 3. Aliquoting en voorbehandeling van AIR Opmerking: de exacte hoeveelheid lucht nodig voor elk monster van (a) de overvloed aan de polysacharide van belang in het materiaal en (b) de gemiddelde grootte van oligosacchariden uitgebracht afhangen zal door de GH. De methode wordt een enkel fluorescerende molecuul toegevoegd aan de vermindering van elke oligosaccharide, zodat het aantal oligosacchariden de gevoeligheid van het experiment bepaalt. Als richtsnoer geldt voor glucomannaan in Arabidopsis stengel verteerd met GH5-/ GH26 (zoals beschreven), 500 µg wordt aanbevolen 11, overwegende dat voor Xylaan in Arabidopsis stengel verteerd met GH11, 100 µg is aanbevolen zoals Mortimer ' s studie 3. weeg AIR (10-15 mg) in een centrifugebuis van 15 mL en H 2 O toevoegen aan een definitieve concentratie van 2 mg/mL. Vortex te bereiken een zelfs schorsing. Als dit problematisch is, gebruikt om te helpen dit proces een glas homogenizer. Aliquoot 500 µg in microfuge buizen. Droog aliquots met behulp van een vacuüm centrifuge (Zie de Tabel van materialen) overnachting op 30 ° C. Pre-Treat lucht met 1 M NaOH (20 µL) gedurende 1 uur bij kamertemperatuur; dit-acetylates de polysacchariden en zwelt de cellulose microvezels, verstoren de biomassa structuur en toegang van GH. Opmerking: Deze stap kan worden overgeslagen voor gezuiverde polysacchariden. Let op – sterk zuur/base. Omvatten een aliquoot gedeelte voor de luchtverkeersleiding van een neen-enzym (op dezelfde wijze behandeld als alle monsters, met uitzondering van stap 4.1. wordt uitgesloten). Toevoegen 200 µL van H 2 O en 20 µL 1 M HCl te neutraliseren. Test dat de pH ~ 6-7 is door het verwijderen van 1 µL en spotten het op papier pH-indicator strips. Toevoegen 50 µL 1 M ammonium acetaat buffer, pH 6.0 (of welke pH is geschikt voor het GHs gebruikt in de studie) en H 2 O te geven van een totaal volume van 500 µL. Opmerking: Ammoniumacetaat wordt gebruikt omdat het sublimeert bij het drogen, en dus het voegt geen extra zout toe aan het monster. Een overmaat aan zout kan leiden tot slechte band-vorm en resolutie op het tempo gel. 4. Hydrolyse van lucht met Glycosyl Hydrolases (GHs) Opmerking: zoals vermeld in de discussie, de zuiverheid van het GHs is van cruciaal belang. Gebruik alleen geïnfecteerd uitgedrukt, affiniteit gezuiverd enzymen. Na ontvangst van elke partij van de fabrikant, gehydrolyseerd gedefinieerde aliquots van substraat (bijvoorbeeld 500 µg lucht) met toenemende hoeveelheden van GH’s nachts (bijvoorbeeld 0,5, 1, 2, 5, 10, 15, 20 µL) (3 eenheden/µL). Wanneer een overmaat van GH aanwezig is, zal de tempo-vingerafdruk identiek kijken. Een overmaat van enzym is vereist voor het leveren van een reproduceerbaar resultaat omdat het moet er zeker van zijn dat de hydrolyse-reactie het eindpunt nadert. Toevoegen een vooraf bepaald bedrag (zie hierboven) van mannanases (GH5 en GH26 11) om de lucht aliquots in de buffer uit stap 3.5, evenals een positieve controle (30 µg konjacglucomannaan), en een neen-AIR negatieve controle (enzym mix in een lege buis). Vortex en vervolgens draai kort voor het verzamelen van het reactiemengsel in de onderkant van de buis. Na een nacht bebroeden bij 37 ° C (of de juiste temperatuur voor de GH van keuze) met zachte agitatie (~ 100 rpm). Zet de reactie stop door broeden bij 95 ° C gedurende 20 min. Opmerking: Cap sluitingen kunnen worden gebruikt voor het afdichten van flip-top microfuge buizen. Centrifugeer met behulp van een bank top microfuge op maximale snelheid gedurende 10 minuten, en behouden van supernatant. Resuspendeer de pellet in 250 µL H 2 O, centrifuge zoals hierboven, en behouden van supernatant. Combineren beide supernatant en drogen in een vacuüm centrifuge (Zie de Tabel van materialen) bij 30 ° C (~ 3 h of ‘s nachts zonder verwarming). 5. Opstelling van Oligosaccharide normen voorbereiden 1 mM voorraad oplossingen in H 2 O van mannose (Man), mannobiose (Man 2), mannotriose (Man 3), mannotetraose (Man 4), mannopentaose (Man 5) en mannohexaose (Man 6), alle β, 1-4 gekoppeld. Aliquot en opslag bij-20 ° C tot vereist. 3 verschillende concentraties van een Man 1-6 mengsel te bereiden door het combineren van 1 µL (standaard S1), 2 µL (S2) of 5 µL (S3) van alle zes. Droog in een vacuüm centrifuge (Zie Tabel van materialen) bij 30 ° C (~ 1 h). 6. Derivitization van oligosacchariden voorbereiden een stamoplossing van 0,2 M MIEREN (8-Aminonaftaleen-1,3,6-trisulfonic zuur) in H 2 O: azijnzuur 17:3. Warme voorraad naar 60 ° C tot het volledig los van de vaste stof. Opslag bij-20 ° C, beschermd tegen licht, voor 2-3 maanden. Bereiden een 0,2 M stockoplossing van 2-Methylpyridine boraan (2-PB) in DMSO. Dit is zeer hygroscopisch, resuspendeer dus onmiddellijk alle poeder na ontvangst in DMSO. Aliquot, en winkel bij-20 ° C gedurende 1-2 jaar. Ontdooien aliquots als vereist (winkel bij 4 ° C gedurende 2 weken, en vervolgens ontdoen). Bereiden de buffer van de bewerking van H 2 O: acetic acid: DMSO op 17:3:20. Aan elk monster, voeg 5 µL van MIEREN, 5 µL van 2-PB en 10 µL van bewerking buffer. Spin kort te verzamelen in de onderkant van de buis, vortex grondig, en draai vervolgens kort opnieuw. Zie afbeelding 1 voor reactie beschrijving. Incubate monsters overnachting bij 37 ° C, beschermd tegen licht. Droog in een vacuüm centrifuge (Zie Tabel van materialen) bij 30 ° C (~ 2 h). Resuspendeer monsters en standaard in 100 µL 3 M ureum. Opslag bij-20 ° C, beschermd tegen het licht totdat vereist. 7. Voorbereiding van tempo gels Opmerking: vergadering van de gel gieten apparatuur zal afhangen van het merk. Hier wij use een verticale elektroforese-systeem (Zie Tabel of Materials), uitgerust met 18 x 24 cm glazen platen en 1,5 mm afstandhouders. Monteren gel gieten apparatuur per de fabrikant ' s instructies. Make 10 x tempo buffer (1 M Tris-boraat, pH 8.2) als volgt: Meng 121.14 g voor Tris-Base ~ 400 mL H 2 O en mix te ontbinden. Breng de pH op 8.2 door toevoeging van solide boorzuur (ongeveer 60 g) en breng op volume maximaal 1 L. Maak een 10% (m/v) ammonium persulfate (APS) voorraad in H 2 O. Aliquot eenmaal opslaan bij-20 ° C. dooi aliquots bewaren bij 4 ° C en, na 2 weken negeren. Maken en giet het oplossen gel. Voor de bovengenoemde apparatuur 1 gel gelijkstaan aan 50 mL. In een centrifuge tube van 50 mL, meng H 2 O (20.2 mL), 5 mL 10 x tempo buffer, 24.6 mL 40% acrylamide/Bis-acrylamide (29:1 acrylamide:Bis). (Let op: giftig). 200 µL van APS en 20 µL van N, N, N, N´-tetramethyl-ethyleendiamine (TEMED) toevoegen. Omkeren voorzichtig te mengen (om te voorkomen dat de invoering van luchtbellen). Giet de gel met een serologische of andere groot volume Pipet, ~ 4 cm onder de bovenkant van de glasplaten. Aandacht besteden aan de mogelijkheid van luchtbellen krijgen gevangen in de gel. Als ze doen, stop gieten en tilt/kraan de gel om hen vrij te geven. De gel met isopropanol (Let op : brandbaar) of, zorgvuldig, met H 2 O. toestaan gel te polymeriseren (20-30 minuten), dan giet af de bovenste laag bedekken. Als isopropanol werd gebruikt, daarna wassen 2 x met H 2 O. droog iedere overtollige vloeistof met behulp van vloeipapier. Maken en giet de stapelvolgorde gel. Meng 6.8 mL H 2 O, 1 mL 10 x tempo buffer, 2,8 mL acrylamide/Bis-acrylamide (Let op: giftige), 80 µL APS en 8 µL van TEMED in een centrifugebuis 15 mL. Omkeren als u wilt mengen en overlay op de top van gepolymeriseerde oplossen gel. Zachtjes invoegen kammen, het vermijden van overlapping luchtbellen onder de kam tanden. Toestaan gel om het polymeriseren (20-30 min), wikkel in vochtige weefsel en vervolgens in plastic omslag, en bewaren bij 4 ° C totdat vereist. Winkel met de kammen in plaats. Opmerking: Tempo gels kunnen worden opgeslagen voor een maximum van 2 weken (hoewel minder dan 1 week ideaal is), als ze worden gehouden vochtige. 8. Met een tempo Gel gebruik van een permanent marker op het etiket van de goed posities op het glas, die helpen zal bij het bijhouden van de volgorde van laden, en in het identificeren van waar de putten zijn zodra de kam is verwijderd. Verwijder de kam. De putjes vullen met 1 x tempo buffer. Gebruiken een 10 µL microsyringe om te laden 2 µL van normen en monsters in putten. Vermijd het gebruik van de ultraperifere rijstroken, die de neiging om voorbeelden van slecht uitvoeren. Monteren van het Hogerhuis van het gel-running-apparaat, en plaats de gel in een gekoeld (~ 10 ° C) lopende tank (10 ° C) met 1 x tempo buffer. Vul het Hogerhuis met 1 x tempo buffer. Zet de macht, en run de gel bij 200 V (constante V) voor 30 minuten, waarna de verhoging van de spanning tot 1000 V voor 1 h 40 minuten. Gels beschermen tegen licht (bijvoorbeeld door inwikkeling van tanks in zwarte vuilniszakken). Opmerking: Controleer op de gels ~ 5 min na het inschakelen van de spanning, en dan nog eens 5 minuten na een stijging van de spanning tot 1.000 V. Als het aggregaat niet in staat om de spanning dan is er waarschijnlijk een buffer lek is. De gel uit de tank te verwijderen. Monteer het Hogerhuis, zorgvuldig controleren plaatsing van alle pakkingen. Een grote chip op de bovenrand van de glasplaat kan voorkomen dat de plaat vormt een goede afdichting met de pakking. Dit kan meestal worden tijdelijk opgelost door toevoeging van een daling van 5% (m/v) gesmolten agarose aan het afgestoken deel van het glas, voordat u toevoegt het Hogerhuis. 9. Visualiseren van een tempo gel Opmerking: gebruik een gel imaging systeem uitgerust met langegolf UV lampen in de transilluminator, en een uitstoot-filter voor de camera die geschikt is voor de fluorophore, hier 530 nm. U kunt ook een laserscanner kan ook worden gebruikt, zoals beschreven in Goubet 2. Na de gel imaging systeem Stofdroog is door te vegen het met vochtige pluisvrije weefsel. Verwijderen van de gel uit de tank tempo, en kort bekijken terwijl de gel nog steeds in de glazen platen is (< 80 ms) om te bepalen als de kleurstof voorzijde nog steeds op het gel is. Opent de gel met een wig-gereedschap, en terwijl gel nog steeds op een glazen plaat is, een pizza cutter gebruiken om zowel de stapelvolgorde gel en, als de kleurstof voorzijde nog steeds op de gel, de onderkant van de gel is. ~ 5 mL H 2 O zet op het oppervlak van de transilluminator, en breng de gel rechtstreeks op de transilluminator. Het filter ingesteld op UV 605 en inschakelen van de lange golf UV-transilluminator (Zie Tabel van materialen) het softwarematig. Opmerking: De fluorophore van de MIEREN hier gebruikt heeft een excitatie/emissie van 353/520 nm. Nemen verschillende afbeeldingen op verschillende tijdstippen van de blootstelling (bijvoorbeeld 100 ms tot en met 10 s). Zorg ervoor dat het UV-licht tussen afbeeldingen door te klikken op de knop UV licht (het om uit te schakelen) om te voorkomen dat de fluorescentie vernederende is uitgeschakeld. Ervoor zorgen dat ten minste 2 van de beelden geen verzadigde bands hebben (de gel beeldbewerkingssoftware zal dit aangeven). Bestanden van het opslaan van de als beelden van de hoge-resolution.tif. Opmerking: Afbeeldingen kunnen worden geanalyseerd met behulp van de software die wordt geleverd met de gel imaging systeem, of met behulp van vrij beschikbare beeld analysesoftware, zoals ImageJ (https://imagej.nih.gov/ij/). Zie het gedeelte ‘ resultaten ‘ voor een bespreking van de kwantificatie.