アビジン-ビオチン システムと非遺伝の表面装飾を介してウシ結核BCG ワクチンの外因性抗原の発現
Summary
迅速抗原細菌表面に表示のための新たな手法を提示することで、単量体のアビジンとの融合に興味の蛋白質への暴露に続いて表面ビオチン化が含まれます。選択した抗原と BCG を正常に読み込み表面加飾が従来の遺伝的アプローチを置き換えることができますを示唆して、その免疫原性が向上します。
Abstract
結核 (TB)、深刻な感染症のみ利用可能なワクチンウシ細菌カルメットゲラン桿菌 (BCG) 安全かつ効果的なは、子供の深刻な TB の髄膜炎と播種性結核のいくつかのフォームの保護が保護するために失敗しました。肺の結核に対する病気の最も流行する形態であります。現在 BCG を改善する有望な戦略は結核 (Mtb)主要抗原遺伝子とその変換のいずれかを依存して-特定の抗原および/または抗原刺激する共同因子をコードする遺伝子と相補提示細胞。これらのアプローチの主要な制限には、低効率、低安定性、発現ベクターの安全性の不確実性のレベルが含まれます。本研究では対応する遺伝子をプラスミドに変換ではなく、細菌の表面に興味の外因性蛋白質と BCG の相補性から成っているワクチン改善する方法を提案する.標準的なエシェリヒア属大腸菌の単量体のアビジンと融合に興味の蛋白質を表現するまず、式システム、ビオチン化 BCG の表面を飾るために使用します。サロゲート卵白アルブミン抗原で飾られた BCG 表面を用いた動物実験では、変更された細菌は完全に免疫原性と特異的 T 細胞反応を誘導することができることを示しています。完全に、強くここに示すデータは外因性核酸を補完の面倒な従来の手法に代わる現在の BCG ワクチンは整形のため小説と効率的な方法をサポートします。
Introduction
現在の結核ワクチン BCG、遺伝子を導入する遺伝子組み換え BCG 株、弱毒ライブM.tb 、ウイルスのベクトル化技術タンパク質補助システムをどちらかなどを交換する様々 な戦略が提案されています。感染1またはMtbの中に十分に表されない BCG 抗原発現-BCG2に特定の抗原が存在しません。遺伝子工学、しかし、安全、時間のかかるプロセス、および式ベクトル4、5の低効率の不確実性のレベルを含む多くの障壁に直面しています。BCG を改善に関して不確かな遺伝的交替を必要とせず免疫原性を改善するために別のアプローチが必要です。
本研究では BCG 細胞表面ビオチンとよく知られている高親和性アビジン相互作用に基づく利息の組換え蛋白質の表示のための新たな戦略を紹介します。このアプローチにより、BCG は、その優れた安全性を維持しながら有効性の最大の改善を達成するために BCG の広範な操作を容易にビオチン化の表面に組換えアビジン融合蛋白質の迅速かつ再現可能な添付ファイル使用の十年にわたって観察を記録します。
ビオチンにアビジンの親和性が非常に高い (Kd = 10− 15 M) と構成、ビオチン-アビジン複合体は非常に安定と変化の条件6の下でのみ破壊することが。ただし、この種類の相互作用遺伝子転送メソッドの代替方法として、組換えタンパク質の長期的なリバーシブルの表示が必要です。したがって、我々 はここで低親和性単量体アビジンを紹介 (Kd = 10−7 M) 表面からのタンパク質の可逆的なリリースにリードがいったん抗原提示細胞内に取り込まれた BCG を装飾。コンセプトの証明を提供するために、我々 は卵白アルブミン (OVA)7,8から派生したサロゲート抗原に対応する単量体アビジン キメラ蛋白質を使用してこのメソッドをテストしました。結果は、BCG 細胞表面飾ることができる簡単かつ迅速に単量体アビジン融合蛋白質と BCG の表面にこのバインドは安定して細菌の増殖や生存に検出可能な変更することがなく再現できることを示した。また、わかった OVA (AviOVA) と融合した単量体アビジンで飾られた BCG が類似する BCG による免疫反応を引き起こすことができる同じ抗原を遺伝子発現の in vitroとin vivoの両方。細菌の表面に興味の蛋白質の元に戻せる状態表示のこの技術は伝統的な遺伝子移転手法の効果的な代替と BCG の広範な操作とワクチンでさらにアプリケーションのプラットフォームを提供することができます。開発。
Protocol
Representative Results
Discussion
私たちはこの研究で BCG 面上特異抗原または細菌の免疫原性を効率的に改善するために期待される機能の特定のプロパティを追加する外因性タンパク質の迅速かつ効果的なディスプレイのための非遺伝的アプローチを報告しました。BCG 細胞表面ができる簡単にビオチン標識アビジン融合蛋白質と瞬時の表面装飾のデモンストレーションを行った。形質転換と肯定的なクローンの選択 2 ~ 3ヶ月?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
BCG のパスツール株博士 R ストークスと A. Talal のテクニカル サポートに感謝します我々 はまた遺伝子合成を助け GenScript を感謝します。
Materials
| Endotoxin-free RPMI 1640 | StemCell Technologies | 36750 | |
| Sulfo-NHS SS biotin | Thermo Fisher | 21328 | |
| FITC-conjugated streptavidin | Sigma-Aldrich | S3762 | |
| Phycoerythrin (PE)-conjugated I-Ab-OVA323-339 tetramer | MBL International | TS-M710-1 | |
| 7-AAD | BD Pharmingen | 559925 | |
| TALON polyhistidine-Tag purification resin | Clontech | 635501 | |
| Alexa Fluor (AF) 647 conjugated rat anti-mouse CD4 | BD Bioscience | 557681 | |
| AF647 rat anti-mouse IFN-g | BD Bioscience | 557735 | |
| AF647 rat anti-mouse I-A/I-E | BD Bioscience | 562367 | |
| PeCy7 rat anti-mouse CD4 | BD Bioscience | 552775 | |
| PE rat anti-mouse CD8 Ab | BD Bioscience | 561095 | |
| AF 647 rat anti-mouse H-2kb | BD Bioscience | 562832 | |
| FITC-conjugated goat anti rabbit antibody | Thermo Fisher | 31635 | |
| AF 647 rat anti-mouse CD4 | BD Bioscience | 557681 | |
| Ultra-small gold-conjugated goat anti-rabbit IgG | Electron Microscopy Sciences | 25100 | |
| Middlebrook 7H9 broth | BD Diagnostic Systems | 271310 | |
| OADC | BD Diagnostic Systems | B11886 | |
| Tween 80 | Sigma-Aldrich | P1379 | |
| RAW 264.7 murine macrophage cell lines | American Type Culture Collection | ||
| pDEST17 plasmid | Invitrogen | 11803012 | |
| pUC57-OVA plasmid | GenScript | SD1176 | |
| BP clonase | Invitrogen | 11789020 | |
| LR clonase | Invitrogen | 11791043 | |
| pDONR221 plasmid | Invitrogen | 12536017 | |
| Ni-NTA columns | Qiagen | 31014 | |
| Pierce protein concentrators | Thermo Fisher | 88527 | |
| Flurosave | Calbiochem-Novabiochem | 345789 | |
| Axioplan II epifluorescence microscope | Carl Zeiss Inc | ||
| CCD digital camera | Retiga EX, QImaging | ||
| Tecnai G2 200kV electron microscope | FEI Company | G2 200Kv | |
| 70μm Falcon cell strainer | Thermo Fisher | 87712 | |
| EasyStep mouse biotin positive selection kit | StemCell | 18556 | |
| biotin-Ter119/Ertyroid cells antibody | BioLegend | 116203 | |
| Brefeldin A | BD Pharmingen | 555029 | |
| Cytofix/Cytoperm kit | BD Pharmingen | 554714 | |
| Bright-Glo Luciferase assay system | Promega | e2620 | |
| Turner Biosystem luminometer | Promega | TD-20/20 | |
| Leica EM UC6 microtome | Leica Microsystems | UC6 | |
| Novalyphe NL 500 freeze dryer | Savant Instruments | NL 50 | |
| Wheaton boroscilicate glass vials | Wheaton | VWR 66011-675 |
Referências
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