דימות ברזולוציה קונאפוקלית של מחסום הדם - מוח: הדמיה, שחזור תלת-ממד, כימות של Transcytosis
Summary
כאן אנו מציגים פרוטוקול מבוסס מיקרוסקופיה דימות ברזולוציה, שחזור תלת מימדי של העכבר נוירו-וסקולריים יחידה, מחסום הדם – מוח באמצעות סעיפים לתרשים המוח. שיטה זו מאפשרת הפריט החזותי, ניתוח של כימות של organelles תאיים-BBB.
Abstract
מחסום הדם – מוח (BBB) הוא ממשק multicellular דינמי המסדירה את התעבורה של מולקולות בין את זרימת הדם למוח. Transcytosis על פני BBB מסדיר את המסירה של הורמונים, מטבוליטים נוגדנים טיפולית parenchyma המוח. כאן, אנו מציגים פרוטוקול שמשלב immunofluorescence סעיפים לתרשים סריקת מיקרוסקופיה קונפוקלית וניתוח תמונה להמחיש organelles subcellular בתוך תאי אנדותל-BBB לייזר. שילוב זה הנתונים-קבוצה עם תוכנת ניתוח תמונה תלת-ממדית מאפשרת פילוח חצי אוטומטית את כימות של נפח נימי, השטח, כמו גם מספר ואת עוצמת תאיים organelles ב BBB. הגילוי של העכבר אנדוגני אימונוגלובולינים (IgG) בתוך שלפוחית תאיים, כימות שלהם ב BBB משמש להמחשת שיטת. פרוטוקול זה פוטנציאל ניתן להחיל את החקירה של מנגנוני השליטה BBB transcytosis של מולקולות שונות בתוך vivo.
Introduction
מחסום הדם – מוח (BBB) היא רציפה הסלולר מחסום שנוצר על ידי האסטרוציטים, pericytes, נוירונים, תאי אנדותל המפריד את מערכת העצבים המרכזית (CNS) זרימת הדם1. ויסות תעבורה על פני BBB ממלא תפקיד מכריע בשמירה על הומאוסטזיס המוח, מתווך על ידי מאפיינים מיוחדים של תאי אנדותל של המוח (בקס). הנוכחות של צמתי המערכת צר בין בקס קצב הבסיס נמוך של transcytosis להגביל את התעבורה paracellular ו- transcellular של מולקולות נישא בדם, בהתאמה2. לאחרונה, מסלול transcytosis ב בקס לרתום כדי לשפר את המסירה של מולקולות גדולות טיפולית עד3,המוח4. עם זאת, המנגנון של transcytosis על פני BBB טרם אושרו במלואו מאופיין5,6.
עבודה נרחב נעשה במבחנה כדי לפענח את המנגנונים תאית ומולקולרית ויסות תעבורה תאיים על פני בקס7,8,9,10, 11, אבל מערכות כאלה להיכשל כדי לסכם את אדריכלות מורכבים ופיזיולוגיה של היחידה נוירו-וסקולריים (NVU). מצד שני, מחקרים ויוו12,13 לספק מידע מפורט כמותית על תעריפי התחבורה ברחבי BBB אך אינם מספקים תובנות מנגנונים תאיים תחבורה. לכן, חוקרים מרכיבי NVU הסלולר, תאיים ויוו ו- ex-vivo נשאר מאוד מאתגר14. רק מספר מצומצם של טכניקות נתונות לנתח subcellular מבנים בתוך התאים של NVU. רוב המחקרים להשתמש מיקרוסקופ אלקטרונים אבל בטכניקה זו הוא מוגבל על ידי הפרוטוקולים המורכבים הדרושים עבור הכנת הרקמה הנכונה וטיפול הדגימה. לכן, הקמנו מתודולוגיה בהתבסס על רזולוציה גבוהה מיקרוסקופיה קונפוקלית שתאפשר עיבוד מוחי לדוגמאות הניתוח, כימות של תאי subcellular בתוך התאים NVU.
כאן, אנו מתארים את פרוטוקול אשר מנצל את העכבר המוח מקטעים לתרשים כדי לבצע הדמיה כמותית של BBB ו- NVU ברמות סלולרית ו- subcellular. אנחנו נבדק ואומת מספר נוגדנים תמונה, לשחזר את NVU בשלושה ממדים. יתר על כן, פרוטוקול זה מאפשר דימות ברזולוציה מירבית מוגבלת עקיפה אופטי של organelles בתוך המוח נימים. יחד עם ניתוח תמונות, פרוטוקול זה יכול לשמש כדי לחקור את העברת מקרומולקולות תאיים על פני BBB בתנאים שונים ניסיוני, למשל במודלים של העכבר המחלה של הקשורים ניוון מוחיים.
Protocol
Representative Results
Discussion
פרוטוקול שפורטו לעיל מתאר את ההכנות של מקטעים לתרשים המוח, צביעת immunofluorescent, ייבוא תמונות ניתוח הפרמטרים מיקרוסקופ ברזולוציה גבוהה של BBB. בשיטה זו נעשה שימוש לאחרונה לחקור הלוקליזציה של נוגדן משלוח פלטפורמות3, התעבורה של IgG אנדוגני על פני ה-BBB17, והטרוגניות של BBB על אובדן pericyte18. שלבים שונים בפרוטוקול יכול להיות שונה כדי להתאים למטרה ספציפית של הניסוי. ראשית, השימוש של מקטעים (100 מיקרומטר) עבה מקלה על טיפולם במהלך ההליכים immunostaining, הרכבה. זה גם מאפשר שחזור תלת-ממד של הרשת נימי, יחידת נוירו-וסקולריים, ועל הדור של נימי וחתכי NVU. אולם, חדירה של נוגדנים בתוך המקטעים רקמות עשוי להשתנות, צביעת נוגדנים מסוימים יכול להיות מוגבל לשכבה שטחית של הרקמה קרוב coverslip. ניתן לשנות את הפרוטוקול על ידי הגדלת הריכוז של דטרגנט במהלך השלב permeabilization ו/או את אורך הצעד permeabilization כדי לשפר את הנוגדן חדירה לתוך הרקמה. שנית, איכות התמונה אולי התגלה כאשר מנסים לרכוש תמונות עמוק בתוך הרקמה (בד כ 20 עד 30 מיקרומטר מתחת לפני השטח) בשל פיזור אור, כמו גם סטייה אופטית של אי-התאמה של שבירה. כדי להתגבר על בעיה זו, ניתן לשלב שיטות חדשות עבור ניקוי רקמות ונוגדנים פעילים חדירה20 עם פרוטוקול זה כדי אחסון גדולים יותר תמונות של רקמה. שלישית, deconvolution מתבצע לאחר ייבוא תמונות כדי לשפר את הרזולוציה צירית של התמונה. הבחירה של האלגוריתם deconvolution עיוור בשימוש פרוטוקול זה היה מבוסס על (i) קלות השימוש, כפי אין חישוב מראש של הפונקציה בנקודה-התפשטות נדרשת, (ii) שלה חוסן לשיפור איכות התמונה21, ו- (iii) חוסר חפצי אמנות ב- mIgG מבנים תאיים לאחר יישום. בהתאם המבנים תאיים דמיינו במדגם, אלגוריתמים deconvolution אחרים עלולים לגרום איכות תמונה גבוהה יותר. 21,הפניות הבאות22 מספקים דיון מקיף היתרונות ואת המגבלות של אלגוריתמים נוספים deconvolution התמונה. לבסוף, השימוש של חבילת התוכנה של ניתוח תמונה מותרת את פילוח של נימים ומבנים תאיים בשלושה ממדים. בבירור וניתוח תמונות אינה מוגבלת התוכנה תיאר את הפרוטוקול ואת חבילות חלופיים, לדוגמה אלה דנו הפניה23, יכול לשמש לתמונות מקטע. ההתאמה של תוכנות שונות לניתוח של מבנים תאיים על פני BBB צריך לאמת מדעית על-ידי הערכת הדיוק של סגמנטציה.
מאז בשיטה זו מבוסס על דגימות קבוע, הוא אינו מספק מידע ישיר על הדינמיקה של transcytosis על פני BBB. עם זאת, ניתן לשלבו עם הזמן-קורס ניסויים24, לדוגמה על-ידי הזרקת המולקולה עניין ומדידת שלה הצטברות בתוך בקס בנקודות זמן שונות לאחר ההזרקה, לשחזר את קינטיקה של דרך הווריד תחבורה תאיים. היתרון של גישה זו הוא שהיא מאפשרת לניתוח של אזורים מוחי עמוק, כפי שמוצג18, אשר אינם נגישים כעת גישות intravital הדמיה בשידור חי. שלב קריטי במהלך הפרוטוקול הוא פיקוח קפדני על קיבוע הרקמה. קיבוע עם 4% PFA מפחיתה באופן דרמטי את immunogenicity של organelles תאיים ושל immunoglobulins אנדוגני או המנוהלת באופן עקיף17 (איור 1B). מגבלה של פרוטוקול זה היא הדרישה שלו באיכות גבוהה נוגדנים (קרי, צביעת שאינם ספציפיים נמוך, נמוך אשיג) מתאים immunofluorescence. ובלבד ריאגנטים כאלה זמינים, ניתן להחיל את שיטת לחקור לוקליזציה תאיים של חלבון בכל עניין. לדוגמה, הפרוטוקול שימש לזיהוי lysosomes המוח תאי אנדותל17. בנוסף יש לציין כי מאז פרוטוקול זה מבוסס על מיקרוסקופיה קונפוקלית, הרזולוציה לרוחב מוגבל על ידי עקיפה, אין אפשרות לזהות מבנים קטנים יותר כ 175 ל-250 ננומטר (איור 2).
מחקרים קודמים יש לבצע ניתוח מפורט של הרכב הסלולר של יחידת נוירו-וסקולריים באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית25,26. עם זאת, חוקרים תחבורה תאיים-BBB מסתמך בעיקר על השימוש הילוכים מיקרוסקופ אלקטרונים19,27,28. שיטה זו מציעה לרוחב הרזולוציה הגבוהה ביותר של מבנים תאיים, מיקרוסקופ אלקטרונים נותר טכניקה מאתגר עם תפוקה נמוכה. יתר על כן, מספר מטרות מולקולריות שונות אשר ניתן לאבחן על ידי EM מצומצמת מאוד. פרוטוקול זה מציע חלופה נגישה לחקור תחבורה תאיים-BBB. הנוהל המלא, מאוסף המוח כדי ניתוח תמונות, ניתן לבצע 5 עד 6 ימים. אם נוגדנים המתאימים זמינים, immunofluorescence מאפשר זיהוי בו זמנית של מספר תאים סוגים/מולקולות בתוך באותה דגימת זרע. יתר על כן פרוטוקול זה יכול להיות משולב עם סופר-רזולוציה טכניקות במיקרוסקופ כדי להתגבר על המגבלות רזולוציה מרחבית29. בסך הכל, הפרוטוקול המתואר לעיל מאפשר כימות של שינויים תאיים לוקליזציה של חלבונים עניין בתוך יחידת נוירו-וסקולריים. היישום שלה על שונות גנטית או תרופתי לפליטת יאפשר חוקרים את הפונקציות מבנה ותעבורה תאיים של ה BBB ויוו.
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
קראוון עבודה נתמכה על ידי מלגת פוסט-דוקטורט רושה (2014-2017).
Materials
| Rat monoclonal antibody clone ER-MP12 against CD31/PECAM | Novus Biologicals | MCA2388 | Labels Brain Endothelial Cells Use at dilution 1:100 detect with donkey polyclonal anti-rat IgG (H+L) coupled with suitable AlexaFluor dye, used at dilution 1:400 |
| Rat monoclonal antibody against Podocalyxin | R&D Systems | MAB1556 | Labels Lumen of capillaries Use at dilution 1:100 detect with donkey polyclonal anti-rat IgG (H+L) coupled with suitable AlexaFluor dye, used at dilution 1:400 |
| Rabbit polyclonal antibody against CollagenIV | Biotrend | BT21-5014-70 | Labels Basement membrane of capillaries Use at dilution 1:100 detect with donkey polyclonal anti-rabbit IgG (H+L) coupled with suitable AlexaFluor dye, used at dilution 1:400 |
| Goat polyclonal antibody against CD13 | R&D Systems | AF2335 | Labels pericytes Use at dilution 1:100 detect with donkey polyclonal anti-goat IgG (H+L) coupled with suitable AlexaFluor dye, used at dilution 1:400 |
| Mouse monoclonal antibody clone G-A-5 against GFAP coupled to Cy3 | Abcam | ab49874 | Labels Astrocytes Use at dilution 1:100 |
| Rabbit polyclonal antibody against Iba-1 | Wako | 019-19741 | Labels Microglia Use at dilution 1:100 detect with donkey polyclonal anti-rat IgG (H+L) coupled with suitable AlexaFluor dye, used at dilution 1:400 |
| Rat monoclonal antibody ABL93 gainst LAMP2 | Fitzgerald | 10R-CD107BBMSP | Labels Lysosomes Use at dilution 1:100 detect with donkey polyclonal anti-rat IgG (H+L) coupled with suitable AlexaFluor dye, used at dilution 1:400 |
| donkey polyclonal antibody against mouse IgG (H+L) AlexaFluor594 | LifeTechnologies | A21203 | Use at dilution 1:400 |
| donkey polyclonal antibody against mouse IgG (H+L) AlexaFluor488 | LifeTechnologies | A21202 | Use at dilution 1:400 |
| goat polyclonal antibody against mouse IgG (H+L) AlexaFluor555 | LifeTechnologies | A21422 | Use at dilution 1:400 |
| Filter paper | Sigma-Aldrich | WHA10334347 | Whatman prepleated qualitative filter paper Grade 0858 1/2, grained |
| Cyanoacrylate glue | Roth Carl | 258.1 | Roti Coll 1 |
| Fluorescent Mounting medium | Dako | S3023 | Dako fluorescent mounting medium |
| Adult mice | The Jackson Laboratory | 000664 | C57BL/6J male or female mice between 9 and 19 months of age |
| Vibratome | Leica Biosystems | 14047235612 | Leica VT100S vibrating blade microtome |
| Laser Scanning Confocal microscope | Leica Microsystems | NA | Leica TCS SP8 X with HyD detectors and White light laser |
| Image processing software | Leica Microsystems | NA | Leica Application Suite AF version 3.1.0 build 8587 |
| Image analysis software | Bitplane scientific software | NA | Imaris version 7.6.5 build 31770 for x64 |
| Fluorescence SpectraViewer | ThermoFisher Scientific | NA | https://www.thermofisher.com/ch/en/home/life-science /cell-analysis/labeling-chemistry/fluorescence-spectraviewer.html |
Referências
- Blanchette, M., Daneman, R. Formation and maintenance of the BBB. Mech Dev. 138, 8-16 (2015).
- Chow, B. W., Gu, C. The Molecular Constituents of the Blood-Brain Barrier. Trends Neurosci. 38 (10), 598-608 (2015).
- Niewoehner, J., et al. Increased Brain Penetration and Potency of a Therapeutic Antibody Using a Monovalent Molecular Shuttle. Neuron. 81 (1), 49-60 (2014).
- Yu, Y. J., et al. Therapeutic bispecific antibodies cross the blood-brain barrier in nonhuman primates. Sci Transl Med. 6 (261), 154 (2014).
- Preston, J. E., Joan Abbott, N., Begley, D. J. Transcytosis of macromolecules at the blood-brain barrier. Adv Pharmacol. 71, 147-163 (2014).
- De Bock, M., et al. Into rather unexplored terrain-transcellular transport across the blood-brain barrier. Glia. 64 (7), 1097-1123 (2016).
- Bien-Ly, N., et al. Transferrin receptor (TfR) trafficking determines brain uptake of TfR antibody affinity variants. J Exp Med. 211 (2), 233-244 (2014).
- Sade, H., et al. A human blood-brain barrier transcytosis assay reveals antibody transcytosis influenced by pH-dependent receptor binding. PLoS One. 9 (4), 96340 (2014).
- Tian, X., et al. LRP-1-mediated intracellular antibody delivery to the Central Nervous System. Sci Rep. 5, 11990 (2015).
- Hsu, J., Rappaport, J., Muro, S. Specific binding, uptake, and transport of ICAM-1-targeted nanocarriers across endothelial and subendothelial cell components of the blood-brain barrier. Pharm Res. 31 (7), 1855-1866 (2014).
- Siupka, P., et al. Bidirectional apical-basal traffic of the cation-independent mannose-6-phosphate receptor in brain endothelial cells. J Cereb Blood Flow Metab. , (2017).
- Zlokovic, B. V., et al. A saturable mechanism for transport of immunoglobulin G across the blood-brain barrier of the guinea pig. Exp Neurol. 107 (3), 263-270 (1990).
- Deane, R., et al. IgG-assisted age-dependent clearance of Alzheimer’s amyloid beta peptide by the blood-brain barrier neonatal Fc receptor. J Neurosci. 25 (50), 11495-11503 (2005).
- Cabezon, I., et al. Serial block-face scanning electron microscopy applied to study the trafficking of 8D3-coated gold nanoparticles at the blood-brain barrier. Histochem Cell Biol. , (2017).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. J Vis Exp. (65), (2012).
- Collin, L., et al. Neuronal uptake of tau/pS422 antibody and reduced progression of tau pathology in a mouse model of Alzheimer’s disease. Brain. 137 (10), 2834-2846 (2014).
- Villasenor, R., et al. Trafficking of Endogenous Immunoglobulins by Endothelial Cells at the Blood-Brain Barrier. Sci Rep. 6, 25658 (2016).
- Villasenor, R., et al. Region-specific permeability of the blood-brain barrier upon pericyte loss. J Cereb Blood Flow Metab. , (2017).
- Armulik, A., et al. Pericytes regulate the blood-brain barrier. Nature. 468 (7323), 557-561 (2010).
- Richardson, D. S., Lichtman, J. W. Clarifying Tissue Clearing. Cell. 162 (2), 246-257 (2015).
- Sibarita, J. B. . Deconvolution Microscopy. 95, 201-243 (2005).
- Shaw, P. J. . Comparison of Widefield/Deconvolution and Confocal Microscopy for Three-Dimensional Imaging. , 453-467 (2006).
- Chenouard, N., et al. Objective comparison of particle tracking methods. Nat Methods. 11 (3), 281-289 (2014).
- Foret, L., et al. A general theoretical framework to infer endosomal network dynamics from quantitative image analysis. Curr Biol. 22 (15), 1381-1390 (2012).
- Daneman, R., Zhou, L., Kebede, A. A., Barres, B. A. Pericytes are required for blood-brain barrier integrity during embryogenesis. Nature. 468 (7323), 562-566 (2010).
- Bell, R. D., et al. Pericytes control key neurovascular functions and neuronal phenotype in the adult brain and during brain aging. Neuron. 68 (3), 409-427 (2010).
- Ben-Zvi, A., et al. Mfsd2a is critical for the formation and function of the blood-brain barrier. Nature. 509 (7501), 507-511 (2014).
- Stewart, P. A. Endothelial vesicles in the blood-brain barrier: are they related to permeability. Cell Mol Neurobiol. 20 (2), 149-163 (2000).
- Follain, G., Mercier, L., Osmani, N., Harlepp, S., Goetz, J. G. Seeing is believing – multi-scale spatio-temporal imaging towards in vivo cell biology. J Cell Sci. 130 (1), 23-38 (2017).
