Teşhis edilmesi için kullanılan ilişkili Viral ve hücresel proteinler Viral DNA'ın arıtma
Summary
Bu iletişim kuralı, özellikle etiket ve seçmeli olarak viral genom ilişkili proteinler karakterizasyonu için virüslü hücrelerinden viral DNA izole etmek için hedeftir.
Abstract
Bu iletişim kuralı kimliği için enfekte hücreleri DNA’dan (HSV-1) ilişkili herpes simplex virüsü tip 1 yalıtmak için viral ve hücresel proteinler tarafından kütle spektrometresi hedefidir. Her ne kadar viral genom ile etkileşim proteinler enfeksiyon sonucu belirlemede önemli rol oynarlar, viral genom ilişkili proteinler kapsamlı bir analiz daha önce mümkün değildi. Burada biz HSV-1 genleri enfekte hücreleri doğrudan arıtma sağlayan bir yöntem göstermek. Viral DNA çoğaltılıyor seçerek bir ALKİN fonksiyonel grup içeren değiştirilmiş nükleotit ile etiketlenir. Etiketli DNA sonra özellikle ve geri dönüşümsüz tagged biotin azid bir bakır (I) ile kovalent eki ile-katalize azid ALKİN reaksiyon cycloaddition ya da tıklayın. Biotin öğesini DNA streptavidin kaplı boncuk saflaştırılmış ve ilişkili protein eluted ve kütle spektrometresi tarafından tanımlanan. Bu yöntem seçici hedefleme ve yalıtım HSV-1 çoğaltma çatal veya karmaşık biyolojik ortamlardan bütün genleri etkinleştirir. Ayrıca, bu yaklaşım adaptasyon herpesviral enfeksiyon, çeşitli yönlerinin yanı sıra diğer DNA virüsleri genleri incelenmesi incelenmesi için izin verir.
Introduction
Virüs temel işlevlerini gerçekleştirecek ve bu nedenle enfeksiyon viral gen ekspresyonu, çoğaltma, tamir, Rekombinasyon ve ulaşım dahil olmak üzere önemli yönlerini kolaylaştırmak için ana bilgisayar etkenlere bağlı için sınırlı bir kapasiteye sahip. Bu ana faktörler faaliyetleri genellikle virally kodlanmış proteinler tarafından artar. Ayrıca, virüs algılama ve girişim tarafından hücresel yanıt için viral enfeksiyon kaçınmak gerekir. Bu nedenle, virüs ana etkileşimler enfeksiyon sonucu dikte. Büyük önem nasıl virüs viral işlemleri kolaylaştırmak için hücresel makine adapte hücresel ortamı alter anlaşılmasıdır. Özel ilgi hangi faktörler ve süreçleri viral genom bulaşıcı döngüsü boyunca hareket tespitidir.
Herpes simplex virüsü tip 1 (HSV-1) bir çift DNA virüs bulaşan insan nüfusunun önemli bir kısmı mahsur olduğunu. Enfeksiyonun ilk bir saat içinde nerede viral DNA (vDNA) çoğaltma1ile koordineli olarak viral gen ekspresyonu sıralı bir çağlayan ensues çekirdeği, viral genom girer. Çekirdek, genleri tabi epigenetik düzenleme, onarım ve rekombinasyon geçmesi ve öyle ki ilk döl virions 6 saat içinde üretilen capsids paketlenir. Viral genom ilişkili proteinler enfeksiyon seyri boyunca kapsamlı değerlendirme viral genom hareket ve hangi viral ve hücresel faktörler görmemizi sağlayacak süreçleri moleküler ayrıntılarını araştırmak için zemin enfeksiyon çeşitli aşamalarında yer alırlar.
Benzeşme arıtma ilişkili hücresel proteinler2,3,4,5 analizi için viral proteinlerin ana faktörler viral enfeksiyon katılan incelenmesi için önceki yöntemleri içerir , 6 , 7 , 8 , 9. bu deneyleri ana bilgisayar antiviral yanıt yanı sıra viral Kromatin değişiklik, gen ekspresyonu, enstrümantal hücresel faktörler katılan tanımlanması için edilmiş ve DNA tamir. Ancak, vDNA ilişkilendirmesiyle etkileşimleri bağlıdır ve proteomik yalnızca belirli bir viral faktör bir fonksiyonu olarak oluşan etkileşimleri içgörü sağlamak olup olmadığını tespit etmek zordur. Kromatin immunoprecipitation (ChIP) nerede belirli viral ve hücresel proteinler viral genom10,11,12,13,14 ‘ e bağlamak tanımlamak için kullanılan , 15 ve immunocytochemistry ile kombine floresan In situ hibridizasyon (balık) vDNA16,17,18ile, colocalize hücresel faktörler görselleştirme sağladı 19 , 20. bu deneyleri kayma ve temporal analiz için izin. Ancak, çok özel antikorlar, sınırlı hassasiyet ve virüs ana bilgisayar etkileşimleri önceki fikir ihtiyacını ihtiyacını sınırlamaları içerir. Bu nedenle bir yöntemi iPOND (yalıtım doğmakta olan DNA üzerinde proteinlerin)21 tarihinde göre geliştirilen ve seçmeli olarak etiket ve vDNA üzerinden arındırmak için aniPOND (hızlandırılmış yerli iPOND)22 viral genom tarafsız tanımlanması için hücreleri enfekte Kütle spektrometresi ile ilişkili proteinler. iPOND hücresel çoğaltma çatal dynamics soruşturma için vesile olmuştur.
Enfekte hücreleri üzerinden viral genom seçici arıtma için vDNA çoğaltılıyor modifiye ethynyl nükleozitler, 5-ethynyl-2´-deoxyuridine (EdU) veya 5-ethynyl-2´-kovalent tarafından takip deoxycytidine (EdC) (Resim 1), taşır konjugasyon için biotin azid viral genom ve ilişkili proteinler streptavidin kaplı boncuk (şekil 2B) üzerinde tek adım arıtma kolaylaştırmak için kimya’ı tıklatın. Önemlisi, enfeksiyonlar hücresel DNA ikileşmesi belirli vDNA etiketleme etkinleştirmek için nişanlı değil sabit hücrelerde, devam etmektedir. Ayrıca, HSV-1 enfeksiyonu hücre döngüsü tutuklama nedenleri ve hücresel DNA çoğaltma23,24engeller. Virüs önce gelen viral genom (şekil 1A) ile ilişkili protein analizi için enfeksiyon prelabeled ya da yeni sentezlenmiş vDNA (şekil 1B) ile ilişkili protein analizi için DNA ikileşmesi sırasında etiketli 25. Ayrıca, nabız chase analiz doğa viral çoğaltma çatal (şekil 1 c)26ile ilişkili proteinlerin araştırmak için kullanılabilir. Buna ek olarak, vDNA ethynyl-modified kovalent protein dinamiği (şekil 2A ve şekil 3) kayma soruşturma için bir fluorophore için Birleşik. Görüntüleme vDNA doğrudan görselleştirme için sağlar ve vDNA-protein etkileşimleri doğrulama için ücretsiz bir yaklaşımdır ve viral genom enfeksiyon boyunca izlemek için adapte edilebilir. Biz bu yaklaşımlar daha da herpesviral enfeksiyon, gecikme süresi ve yeniden etkinleştirme, dahil olmak üzere herhangi bir yönünü çalışmaya ve diğer DNA virüsleri çalışmaya değiştirilebiliyordu tahmin. Ayrıca, 5-ethynyl üridin ile etiketleme (AB) RNA viral genom analizi için izin verebilir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu iletişim kuralı, değilse dikkatle takip önemli ölçüde azaltılmış protein verim veya kirlenme hücresel DNA ile sonuçlanabilir birden çok adım içerir. Bu sabit hücre hücresel DNA etiketli saf ve değil emin olmak için tüm deneyler için kullanılır önemlidir. HSV-1 genomu sentez için hücresel DNA polimeraz kullanmaz çünkü bu hücresel DNA polimerazlar protein örnek yokluğunda tarafından onaylanabilir. EdC etiketleme ve çekirdekleri adımları hasat sırasında örnekleri her eşit işlenir …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu yazının hazırlanmasında yardım için Hannah Fox anıyoruz. Bu eser NIH tarafından desteklenen R01AI030612 verin.
Materials
| MRC-5 cells | ATCC | CCL-171 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | 26140-179 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Gibco | 12800-082 | substituted with 10% FBS, 2 mM L-glutamine, 12 mM (for growth in flasks) or 30 mM (for growth in dishes) sodium-bicarbinate |
| 600 cm2 tissue culture dish | Thermo Fisher Scientific | 166508 | |
| Tris Buffered Saline (TBS), pH 7.4 | 137 mM NaCl, 5 mM KCl, 491 mM MgCl, 680 mM CaCl, 25.1 mM Tricine | ||
| HSV-1 stock | stocks with titers greater than 1×109 PFU/mL work best | ||
| Sephadex G-25 column (PD-10 Desalting Column) | GE Healthcare | 17085101 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Fisher Scientific | D128-1 | |
| 5´-Ethynyl-2´-deoxycytidine (EdC) | Sigma-Aldrich | T511307 | Dissolve in DMSO to prepare 40 mM stock, aliquot, and store at -20 °C |
| 2´-deoxycytidine (deoxyC) | Sigma-Aldrich | D3897 | Dissolve in water to prepare 40 mM stock, aliquot, and store at -20 °C |
| Nuclear Extraction Buffer (NEB) | prepare fresh (20 mM Hepes pH 7.2, 50 mM NaCl, 3 mM MgCl2, 300 mM Sucrose, 0.5% Igepal) | ||
| Cell scraper | Bellco glass | 7731-22000 | Autoclave before use |
| Trypan blue solution | Sigma-Aldrich | T8154 | |
| PBS, pH 7.2 (10x) | 1.37 M NaCl, 27 mM KCl, 100 mM Na2HPO4, 18 mM KH2PO4 (dilute to 1x in sterile water before use) | ||
| Copper (II) sulfate pentahydrate (CuSO4-5H2O) | Fisher Scientific | C489 | Prepare 100 mM stock and store at 4 °C for up to 1 month |
| (+) Sodium L-ascorbate | Sigma-Aldrich | A4034 | Freshly prepare 100 mM stock and store on ice until use |
| Biotin azide | Invitrogen | B10184 | Prepare 10 mM stock in DMSO, aliquot, and store at -20 °C for up to 1 year |
| Click Reaction Mix | prepare immediately before use by adding reagents in the indicated order (10 mL: 8.8 mL 1x PBS, 200 mL 100 mM CuSO4, 25mL 10 mM Biotin Azide, 1 mL 100 mM sodium ascorbate) | ||
| cOmplete Protease Inhibitor Cocktail | Roche | 11697498001 | Dissolve in 1 mL water to prepare 50x stock, can store at 4 °C for up to 1 week, or directly add 1 pill to 50 mL buffer |
| freezing buffer | prepare fresh (7 mL 100% glycerol, 3 mL NEB, 200 μL 50x protease inhibitor) | ||
| Buffer B1 | prepare fresh (25 mM NaCl, 2 mM EDTA, 50 mM Tris-HCl pH 8, 1% Igepal, 1x protease inhibitor) | ||
| Buffer B2 | prepare fresh (150 mM NaCl, 2 mM EDTA, 50 mM Tris-HCl pH 8, 0.5% Igepal, 1x protease inhibitor) | ||
| Buffer B3 | prepare fresh (150 mM NaCl, 2 mM EDTA, 50 mM Tris-HCl pH 8, 1x protease inhibitor) | ||
| Vibra Cell Ultra Sonic Processer equipped with a 3 mm microtip probe | Sonics | VCX 130 | |
| Cell strainer | Falcon | 352360 | |
| Dynabeads MyOne Streptavidin T1 | Life Technologies | 65601 | |
| DynaMag-2 Magnet | Life Technologies | 12321D | |
| Mini-Tube Rotator | Fisher Scientific | 260750F | |
| 2X Laemmli sample buffer | Mix 400 mg of SDS, 2 mL 100% glycerol, 1.25 mL of 1 M Tris (pH 6.8), and 10 mg of bromophenol blue in 8 mL water. Store at 4 °C for up to 6 months. Before use add 1 M DTT to a final concentration of 200 mM. | ||
| cap locks for 1.5 mL tube | Fisher Scientific | NC9679153 | |
| Standard western blotting reagents | |||
| NOVEX Colloidal Blue Staining Kit | Invitrogen | LC6025 | |
| 12-well tissue culture dish | Corning | 3513 | |
| Coverslips | Fisher Scientific | 12-545-100 | Autoclave before use |
| Microscope slides | Fisher Scientific | 12-552-5 | |
| 16% paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | dilute to 3.7% in 1x PBS before use |
| Bovine serum albumin (BSA) | Fisher Scientific | BP1605 | prepare 3% in 1x PBS |
| Permeabilization buffer (0.5% Triton-X 100) | Sigma-Aldrich | T8787 | prepare 0.5% Triton-X 100 in 1x PBS |
| Click reaction cocktail – Click-iT EdU Alexa Fluor 488 Imaging Kit | Molecular Probes | C10337 | prepare according to manufactorer's protocol |
| Hoechst 33342 | Life Technologies | H1399 | prepare 10 mg/mL in water, can store at 4 °C for up to 1 year |
| mouse anti-ICP8 primary antibody | Abcam | ab20194 | Use a 1:200 dilution in 1x PBS |
| mouse anti-UL42 primary antibody (2H4) | Abcam | ab19311 | Use a 1:200 dilution in 1x PBS |
| Goat anti-mouse 594-conjugated secondary antibody | Life Technologies | a11005 | Use a 1:500 dilution in 1x PBS |
| Immu-mount | Thermo Fisher Scientific | 9990402 | |
| 2x SDS-bicarb solution | 2% SDS, 200 mM NaHCO3 | ||
| Phenol:chloroform:isoamyl alcohol | mix 25:24:1 at least 1 day before use, store at 4 °C in the dark | ||
| chloroform:isoamyl alcohol | mix 24:1 at least 1 day before use, store at room temperature in the dark | ||
| 10x Tris EDTA (TE), pH 8.0 | 100 mM Tris, 10 mM EDTA (dilute to 1x before use) | ||
| Qiaquick PCR purification kit | Qiagen | 28104 | |
| 3 M sodium acetate pH 5.2 | |||
| Qubit 2.0 Fluorometer | Invitrogen | Q32866 | |
| Qubit dsDNA HS Assay Kit | Invitrogen | Q32851 | |
| Qubit assay tubes | Invitrogen | Q32856 | |
| Fluorescence microscope equipped with imaging software | |||
| Microcentrifuge for 1.5 mL tubes | |||
| Tabletop centrifuge for 15 and 50 mL tubes | |||
| Cell culture incubator | |||
| Biosafety cabinet | |||
| Heat blocks | 65 °C and 95 °C |
Referências
- Knipe, D. M., Howley, P. M. . Fields virology. , (2013).
- Engel, E. A., Song, R., Koyuncu, O. O., Enquist, L. W. Investigating the biology of alpha herpesviruses with MS-based proteomics. Proteomics. 15, 1943-1956 (2015).
- Wagner, L. M., DeLuca, N. A. Temporal association of herpes simplex virus ICP4 with cellular complexes functioning at multiple steps in PolII transcription. PloS One. 8, e78242 (2013).
- Taylor, T. J., Knipe, D. M. Proteomics of herpes simplex virus replication compartments: association of cellular DNA replication, repair, recombination, and chromatin remodeling proteins with ICP8. J Virol. 78, 5856-5866 (2004).
- Fontaine-Rodriguez, E. C., Taylor, T. J., Olesky, M., Knipe, D. M. Proteomics of herpes simplex virus infected cell protein 27: association with translation initiation factors. Virology. 330, 487-492 (2004).
- Greco, T. M., Diner, B. A., Cristea, I. M. The Impact of Mass Spectrometry-Based Proteomics on Fundamental Discoveries in Virology. Annu Rev Virol. 1, 581-604 (2014).
- Conwell, S. E., White, A. E., Harper, J. W., Knipe, D. M. Identification of TRIM27 as a novel degradation target of herpes simplex virus 1 ICP0. J Virol. 89, 220-229 (2015).
- Suk, H., Knipe, D. M. Proteomic analysis of the herpes simplex virus 1 virion protein 16 transactivator protein in infected cells. Proteomics. 15, 1957-1967 (2015).
- Balasubramanian, N., Bai, P., Buchek, G., Korza, G., Weller, S. K. Physical interaction between the herpes simplex virus type 1 exonuclease, UL12, and the DNA double-strand break-sensing MRN complex. J Virol. 84, 12504-12514 (2010).
- Sampath, P., Deluca, N. A. Binding of ICP4, TATA-binding protein, and RNA polymerase II to herpes simplex virus type 1 immediate-early, early, and late promoters in virus-infected cells. J Virol. 82, 2339-2349 (2008).
- Amelio, A. L., McAnany, P. K., Bloom, D. C. A chromatin insulator-like element in the herpes simplex virus type 1 latency-associated transcript region binds CCCTC-binding factor and displays enhancer-blocking and silencing activities. J Virol. 80, 2358-2368 (2006).
- Cliffe, A. R., Knipe, D. M. Herpes simplex virus ICP0 promotes both histone removal and acetylation on viral DNA during lytic infection. J Virol. 82, 12030-12038 (2008).
- Herrera, F. J., Triezenberg, S. J. VP16-dependent association of chromatin-modifying coactivators and underrepresentation of histones at immediate-early gene promoters during herpes simplex virus infection. J Virol. 78, 9689-9696 (2004).
- Kent, J. R., et al. During lytic infection herpes simplex virus type 1 is associated with histones bearing modifications that correlate with active transcription. J Virol. 78, 10178-10186 (2004).
- Oh, J., Fraser, N. W. Temporal association of the herpes simplex virus genome with histone proteins during a lytic infection. J Virol. 82, 3530-3537 (2008).
- Catez, F., et al. HSV-1 genome subnuclear positioning and associations with host-cell PML-NBs and centromeres regulate LAT locus transcription during latency in neurons. PLoS Pathog. 8, e1002852 (2012).
- Everett, R. D., Murray, J., Orr, A., Preston, C. M. Herpes simplex virus type 1 genomes are associated with ND10 nuclear substructures in quiescently infected human fibroblasts. J Virol. 81, 10991-11004 (2007).
- Tang, Q., et al. Determination of minimum herpes simplex virus type 1 components necessary to localize transcriptionally active DNA to ND10. J Virol. 77, 5821-5828 (2003).
- Ishov, A. M., Maul, G. G. The periphery of nuclear domain 10 (ND10) as site of DNA virus deposition. J Cell Biol. 134, 815-826 (1996).
- Maroui, M. A., et al. Latency Entry of Herpes Simplex Virus 1 Is Determined by the Interaction of Its Genome with the Nuclear Environment. PLoS Pathog. 12, e1005834 (2016).
- Sirbu, B. M., Couch, F. B., Cortez, D. Monitoring the spatiotemporal dynamics of proteins at replication forks and in assembled chromatin using isolation of proteins on nascent DNA. Nat Protoc. 7, 594-605 (2012).
- Leung, K. H., Abou El Hassan, M., Bremner, R. A rapid and efficient method to purify proteins at replication forks under native conditions. BioTechniques. 55, 204-206 (2013).
- Hobbs, W. E., DeLuca, N. A. Perturbation of cell cycle progression and cellular gene expression as a function of herpes simplex virus ICP0. J Virol. 73, 8245-8255 (1999).
- Lomonte, P., Everett, R. D. Herpes simplex virus type 1 immediate-early protein Vmw110 inhibits progression of cells through mitosis and from G(1) into S phase of the cell cycle. J Virol. 73, 9456-9467 (1999).
- Dembowski, J. A., DeLuca, N. A. Selective recruitment of nuclear factors to productively replicating herpes simplex virus genomes. PLoS Pathog. 11, e1004939 (2015).
- Dembowski, J. A., Dremel, S. E., DeLuca, N. A. Replication-Coupled Recruitment of Viral and Cellular Factors to Herpes Simplex Virus Type 1 Replication Forks for the Maintenance and Expression of Viral Genomes. PLoS Pathog. 13, e1006166 (2017).
- Bjornberg, O., Nyman, P. O. The dUTPases from herpes simplex virus type 1 and mouse mammary tumour virus are less specific than the Escherichia coli enzyme. J Gen Virol. 77 (Pt 12), 3107-3111 (1996).
- Chiou, S. H. DNA- and protein-scission activities of ascorbate in the presence of copper ion and a copper-peptide complex. J Biochem. 94, 1259-1267 (1983).
- Kennedy, D. C., et al. Cellular consequences of copper complexes used to catalyze bioorthogonal click reactions. J Am Chem Soc. 133, 17993-18001 (2011).
- Snel, B., Lehmann, G., Bork, P., Huynen, M. A. STRING: a web-server to retrieve and display the repeatedly occurring neighbourhood of a gene. Nucleic Acids Res. 28, 3442-3444 (2000).
