Одношаговая протокол для оценки режима радиационно индуцированных колониеобразования клеточной смерти по микроскопии флуоресцирования
Summary
Исследования по ионизирующего излучения (IR)-смерть клетки искусственного колониеобразования имеет важное значение для понимания воздействия ИК на злокачественные опухоли и нормальных тканей. Здесь мы описываем одношаговый assay для оценки основных видов ИК индуцированной колониеобразования смерти клетки основанный на словотолковании по 4′, 6-diamidino-2-phenylindole дигидрохлорид (DAPI)-окрашенных ядер, Визуализация по микроскопии флуоресцирования.
Abstract
Исследования по ионизирующего излучения (IR)-смерть клетки искусственного колониеобразования имеет важное значение для понимания воздействие ИК на злокачественные опухоли и нормальных тканей. Здесь мы описываем быстрый и экономически эффективный одношаговый пробирного одновременно оценки основных видов колониеобразования клеточной смерти, вызванных ИК, т.е., апоптоз, митотической катастрофе и клеточного старения. В этом методе клетки, выращенных на крышку выскальзования облученного с рентгеновским излучением и витражи с 4′, 6-diamidino-2-phenylindole дигидрохлорид (DAPI). С помощью микроскопии флуоресцирования, апоптоз, митотической катастрофе и клеточного старения определяются на основании характерных морфологии DAPI-окрашенных ядер. Апоптоз определяется наличием apoptotic тела (то есть, конденсированной и фрагментации ядер). Митотической катастрофе определяется наличие ядер, которые демонстрируют два или более отдельных лепестков и микроядер. Клеточного старения определяется наличием очагов старение связанные гетерохроматиновые (т.е., ядерной ДНК, содержащие 30-50 яркие, плотные очаги). Этот подход позволяет экспериментатору легко экран для режимов смерти клетки колониеобразования с использованием различных клеточных линий, параметры лечения и/или моменты времени, с целью выяснения механизмов гибели клеток в клетки-мишени и условий, представляющих интерес.
Introduction
Ионизирующего излучения (IR) индуцирует несколько режимов колониеобразования клеточной смерти. Исследование на ИК индуцированной колониеобразования клеточной смерти имеет важное значение для понимания токсичность ИК для нормальных тканей, а также для разработки методов повышения эффективности лечения лучевой терапии рака. Основные режимы колониеобразования клеточной смерти, вызванных ИК1апоптоз, митотической катастрофе и клеточного старения. Апоптоз — это регулируется режим смерти клетки, которое инициируется ДНК повреждения1. Митотической катастрофе — смерть клетки, происходит из-за ошибочной митоз, обусловленных неустраненный двухнитевые разрывы ДНК1. Клеточного старения определяется как состояние необратимых клеток роста арест2; Обратите внимание, что сотовой старение не является смерть клетки per se, но это режим колониеобразования клеточной смерти, потому что он отменяет колониеобразования выживания стареющей клетки.
Различные анализы на основе ячеек были разработаны индивидуально оценить апоптоза, митотической катастрофе и клеточного старения. Апоптоз может оцениваться терминала deoxynucleotidyl трансферазы dUTP Ник конце маркировки (TUNEL) окрашивание, annexin V окрашивание, анализов фрагментация ДНК и суб G1 клеточного цикла этап определения потока цитометрии1. Митотической катастрофе может оцениваться иммунофлюоресценции, пятнать для митотическая маркеров, в том числе MPM2, TUNEL окрашивание и электронной микроскопии1. Клеточного старения можно оценить путем пятнать связанные старения β-галактозидазы (SA-β-Gal), роста арест анализов и электронной микроскопии1. Важно отметить, что преобладающим режим смерти клетки колониеобразования отличается среди клеточных линий и лечения параметры3,4. Таким образом чтобы разъяснить общий профиль колониеобразования клеточной смерти для данной экспериментальной установки, несколько анализов, охватывающий все эти режимы смерти должны проводиться вместе, которая является трудоемким и стоимости.
В этой статье мы опишем быстрый и экономически эффективный одношаговый пробирного одновременно оценки апоптоза, митотической катастрофе и клеточного старения, вызванного ИК3,4. В этом методе клетки, выращенных на крышку выскальзования облученного с рентгеновским излучением и витражи с 4′, 6-diamidino-2-phenylindole дигидрохлорид (DAPI). С помощью микроскопии флуоресцирования, апоптоз, митотической катастрофе и клеточного старения каждый определяются на основании соответствующих характерных морфологии DAPI-окрашенных ядер. Этот подход будет полезен для приложений, включая скрининг колониеобразования клеток смерть профилей в различных клеточных линий, обработки параметров и моменты времени, с целью изучения механизмов гибели клеток в клетки-мишени и условий интерес.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ниже приводятся важнейшие шаги в рамках протокола. Во-первых клетки следует выращивать на культуры блюдо как монослоя потому что морфологической оценки DAPI-окрашенных ядер трудно для многослойных клеток. С этой целью, в шаге 2.9 рекомендуется тщательное передачи культуры блюдо в инкубаторе; сотрясение культуры блюдо генерирует вихрем подвесной клетки, что приводит к концентрации клеток в центре культуры блюдо. Кроме того следует избегать overconfluence, ведущих к многослойных клетки. С этой целью, в шаге 2.7 количество клеток посеян на культуры блюдо может быть изменен на основании населения, удвоение время и интервал между облучения и фиксации. Рекомендуется слияния приблизительно 80 в момент фиксации. Во-вторых скорость имеет важное значение в фиксации и DAPI окрашивание (то есть, шаги 4 и 5). Между образец непоследовательность в отношении времени, необходимого для этих шагов может привести к неоднородности в DAPI интенсивности сигнала в ядрах, которые будет затушевывать морфологической оценки.
В шаге 2.2 можно увеличить количество скользит крышка в одной культуры блюдо; максимум четыре скользит крышка может быть помещен в 35 мм блюдо, и число можно увеличить с помощью больших блюда. Размещение нескольких скользит крышка в каждой культуры блюдо позволяет эффективного функционирования время курса оценки для данного обращения (т.е., Обложка, который скользит могут быть собраны из культуры блюдо по одному в нескольких точках времени интерес).
В шаге 3.2 доза облучения может быть изменен согласно интерес исследователей. Применение последовательного доза в несколько клеточных линий позволяет сравнения чувствительности для каждого режима колониеобразования клеточной смерти среди клеточных линий. С другой стороны использование iso колониеобразования выживания доз для каждой ячейки строки позволяет Сравнение профилей смерти клетки колониеобразования среди клеточных линий. Iso колониеобразования выживания доза может определяться колониеобразования выживания пробирного12. D10 , доза, которая обеспечивает выживание колониеобразования 10%, значение общей конечной точки для iso колониеобразования выживания дозы.
В шаге 3.3 время от излучения до фиксации могут быть изменены согласно интерес исследователей; Это важно, потому что пиковое время для ИК индуцированного апоптоза, митотической катастрофе и сотовой старение зависит от линии клеток и лечения. В этой статье мы использовали 72 ч после облучения, как момент времени, который будет наиболее полезным для первоначальной проверки колониеобразования клеток смерти профили, основанные на нескольких исследований нашей группой и другие описанные следующим1,2, 3 , 4 , 8 , 9: (i) рентген-индуцированной апоптоз в клетках, создана из солидных опухолей основном происходит через несколько дней после облучения. (ii) X-рентген-индуцированной митотической катастрофе в раковых клетках происходит наиболее видное место на второй или третий митоз после освобождения из-под ареста временного цикла клетки под воздействием облучения. Выпуск обычно происходит примерно 24 часа после облучения, а затем путем неоднократных митозов интервалами около 24 ч. (iii) X-Рэй индуцированной сотовой старение становится очевидным после интервала зависит от линии клеток в вопрос: через 2 дня после облучение для некоторых ранних случаев и через 7 дней после облучения для большинства клеточных линий. После получения общую картину колониеобразования ячейки смерти профили от первоначальных скрининг, время экспериментов курс обеспечит более подробное разъяснение пиковое время для каждого режима колониеобразования клеточной смерти в конкретной ячейке строки или состояние 4интерес.
Следует отметить, что DAPI окрашивание пробирного и колониеобразования assay выживаемости, метод золотой стандарт для оценки чувствительности излучения, не являются взаимозаменяемыми. Апоптоз и митотической катастрофе только в течение часа. Таким образом DAPI пятнать assay для точки заданного времени обнаруживает апоптоз и митотической катастрофе, которая происходит на этапе оценки. С другой стороны результаты выживания колониеобразования пробирного в данный момент точки включают общее количество апоптоза и митотической катастрофе, которые имели место во время инкубационного периода, обычно 10-14 дней после облучения. Отличается от апоптоза и митотической катастрофе, стареющей клетки остаются на культуры блюдо; они накапливаются постепенно с течением времени после облучения. Таким образом результаты обоих DAPI окрашивание пробирного и assay выживаемости колониеобразования отражают общее количество старения, которые произошли во время инкубационного периода. Важно отметить, что доля апоптоза, митотической катастрофе и старения, вызванного облучением широко варьируется в зависимости от клеток линии и облучения доза. Вместе взятые, теоретически, результаты одного анализа нельзя быть переведены непосредственно на те из других assay.
Пятнать пробирного DAPI имеет несколько ограничений. Во-первых она остается спорным ли митотической катастрофе — это собственный режим смерти клетки. В области радиационной биологии митотической катастрофе считается основной режим IR-индуцированной клеточной смерти, которая отличается от других механизмов колониеобразования клеток смерти1. С другой стороны другие утверждают, что митотической катастрофе это не собственный режим смерти клетки, а скорее процесс, предшествующий смерти клетки, включая некроз и апоптоз13,14. Таким образом в определенной степени могут перекрываться апоптоз и митотической катастрофе. Во-вторых, предыдущие исследования показывают, что сотовой старение может произойти в отсутствие SAHF в некоторых клеточных линий и лечения параметры2. В настоящее время, другие анализы, специально предназначенные для каждой ячейки колониеобразования смерти режим должен использоваться для повышения надежности выводов данного эксперимента. В-третьих DAPI пятнать пробирного нельзя оценить режимы колониеобразования клеточной смерти помимо апоптоза, митотической катастрофе и клеточного старения (например, некроз и autophagy). В-четвертых не выяснен утилита DAPI пятнать пробирного как предсказатель реакции опухоли на лучевой терапии в клинике. С этой точки зрения пробирного колониеобразования выживания, которая оценивает общее количество колониеобразования клеточной смерти, превосходит DAPI пятнать пробирного потому, что была установлена корреляция между SF2, сохранившихся часть клеток облучали с 2 гр Рентген и опухоль ответ радиотерапии15. Тем не менее стоит отметить, что колониеобразования assay выживаемости не используется широко в клинике, главным образом из-за требование высокой степени компетентности и длительного периода времени (например, 14 дней) для сбора данных. Для сравнения процедура для окрашивания пробирного DAPI проще и занимает значительно меньше времени, примерно 3-4 дня, для получения результатов. Утилита DAPI окрашиванияпробирного как предсказатель реакции опухоли на лучевой терапии будет испытываться в клинике в ближайшем будущем.
В резюме DAPI пятнать пробирного является экономически одношаговый пробирного одновременно оценить три основных режима ИК индуцированной колониеобразования клеточной смерти. Этот подход позволяет легко экран для режимов колониеобразования клеточной смерти для различных клеточных линий, параметры лечения и моменты времени, с целью выяснения механизмов гибели клеток в клетки-мишени и условий, представляющих интерес.
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарим г-жа Акико Сибата для оказания технической помощи. Эта работа была поддержана дотаций от министерства образования, культуры, спорта, науки и технологии Японии для программ для ведущих выпускник школы, выращивание глобальных лидеров в тяжелых ионов клинической медицины и техники.
Materials
| cover slip | Matsunami | C013001 | |
| paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148-1KG | |
| sucrose | Sigma-Aldrich | 84097-250G | |
| phosphate-buffered saline | Cosmo Bio | 16232000 | |
| scalpel | Kai Medical | No.20, 520-A | |
| 35 mm cell culture dish | Falcon | 353001 | |
| trypsin | Wako | 201-16945 | |
| inverted phase microscope | Shimazu | 114-909 | |
| X-ray irradiator | Faxitron Bioptics | Faxitron RX-650 | |
| square culture dish | Corning | 431110 | |
| slide glass | Matsunami | Pro-11 | |
| DAPI staining reagent | Cell Signaling | 8961S | |
| fluorescence microscope | Nikon | ECLIPSE Ni | |
| fluorescence microscope DAPI filter | Nikon | U-FUW, BP340-390, BA420IF, DM410 | |
| fluorescence microscope lens (20×) | Nikon | Plan Apo λ 20X/0.75 | |
| fluorescence microscope lens (60×, oil) | Nikon | Plan Apo λ 60X/1.40 oil | |
| oil | Olympus | N5218600 | |
| CCD camera | Nikon | DS-Qi2 | |
| digital image acquisition software | Nikon | NIS-Elements Document | |
| lens cleaner | Olympus | OT0552 | |
| chloroform | Wako | 035-02616 |
Referências
- Wouters, B. G., Joiner, M. C., van der Kogel, A. J. Cell death after irradiation: how, when and why cells die. Basic Clinical Radiobiology. 4th ed. , 27-40 (2009).
- Aird, K. M., Zhang, R. Detection of senescence-associated heterochromatin foci (SAHF). Methods Mol. Biol. 965, 185-196 (2013).
- Kobayashi, D., et al. Mitotic catastrophe is a putative mechanism underlying the weak correlation between sensitivity to carbon ions and cisplatin. Sci. Rep. 7, 40588 (2017).
- Amornwichet, N., et al. Carbon-ion beam irradiation kills X-ray-resistant p53-null cancer cells by inducing mitotic catastrophe. PLoS One. , 115121 (2014).
- Masters, J. R., Stacey, G. N. Changing medium and passaging cell lines. Nat. Protoc. 2, 2276-2284 (2007).
- Sawai, Y., et al. Effectiveness of sulforaphane as a radiosensitizer for murine osteosarcoma cells. Oncol. Rep. 29, 941-945 (2013).
- Cummings, B. S., Wills, L. P., Schnellmann, R. G. Measurement of cell death in mammalian cells. Curr. Protoc. Pharmacol. , (2012).
- Oike, T., et al. C646, a selective small molecule inhibitor of histone acetyltransferase p300, radiosensitizes lung cancer cells by enhancing mitotic catastrophe. Radiother. Oncol. 111, 222-227 (2014).
- Oike, T., et al. A synthetic lethality-based strategy to treat cancers harboring a genetic deficiency in the chromatin remodeling factor BRG1. Cancer Res. 73, 5508-5518 (2013).
- Russo, A. L., et al. In vitro and in vivo radiosensitization of glioblastoma cells by the poly (ADP-ribose) polymerase inhibitor E7016. Clin. Cancer Res. 15, 607-612 (2009).
- Di Micco, R., et al. Interplay between oncogene-induced DNA damage response and heterochromatin in senescence and cancer. Nat. Cell Biol. 13, 292-302 (2011).
- Franken, N. A., Rodermond, H. M., Stap, J., Haveman, J., van Bree, C. Clonogenic assay of cells in vitro. Nat. Protoc. 1, 2315-2319 (2006).
- Vakifahmetoglu, H., Olsson, M., Zhivotovsky, B. Death through a tragedy: mitotic catastrophe. Cell Death Differ. 15, 1153-1162 (2008).
- Imreh, G., Norberg, H. V., Imreh, S., Zhivotovsky, B. Chromosomal breaks during mitotic catastrophe trigger γH2AX-ATM-p53-mediated apoptosis. J. Cell Sci. 129, 1950 (2016).
- Torres-Roca, J. F. A molecular assay of tumor radiosensitivity: a roadmap towards biology-based personalized radiation therapy. Per. Med. 9, 547-557 (2012).
