等离子体医学基础研究--从液体到细胞的吞吐量方法

在这项研究中, 一个简化的工作流程被描述为医学研究对血浆的作用。本文采用的多学科方法分析了等离子体射流的基本光学发射剖面、液体中的主要活性成分以及等离子体处理后细胞的生物反应 (图 1)。 要执行此工作流, 需要一些组件来正确设置等离子体源 (图 2)。不同的气体 (这里主要氩, 氧气和氮气) 被提供了并且由几个质量流量控制器控制。一个中央面板被用来对质量流量控制器进行数字调整, 以确定进料气体通量。为了产生特定的饲料气体成分, 气体是物理混合使用的一个小组的阀门, 组合气体从几个质量流量控制器 (图 2a)。等离子体源被打开, 并且血浆流出物在一个 USB 分光光度计 (图 2B) 前面设置了以200毫微米的光学范围到1000毫微米。为处理液体和细胞, 一个有效的工作流程用96井板描述。多好的菜肴是使用一个塑料框架, 固定在基板上, 插入与其印迹孔匹配 (图 2C)。整个安装被放置在层流罩 (图 2D) 下。此设置包括一个 xyz 表, 其中等离子射流的 hand-held 片安装。马达控制元件可以位于工作台的外面, 如果后者有足够大的电缆端口从和到 xyz 表。重要的是, 该表是由计算机控制的, 可以编程, 在每个井的中心上空盘旋的喷气机与微米精度的期望量的时间。此外, 开始位置 (如在我们的设置, 以及 A1) 是自由选择的 (图 2E)。与塑料板持有人一起, 这允许一个可再生的等离子处理与任何日常的变化完全有关的设置的液体和生物实验。 在不同的进气条件 (图 3A) 中, 使用光学发射光谱仪跟踪与反应等离子体元件相连接的不同峰值。例如, 第二个正系统的氮与峰值从 330 nm 到 380 nm 代表活性氮物种, 峰值在 309 nm 代表羟基自由基 (箭头在图 3A)。与单独的氩气相比, 氮的存在增加了与氮气的混合物入饲料气体, 而氧气或湿气的加法减少了或减少了它, 分别。相反, 羟基自由基的存在随着氧或氮的增加而降低, 但如果用湿化氩作为饲料气体, 则明显增大。对于液体的等离子体处理, 首先确定氩气和氩等离子体引起的蒸发 (图 3B)。重要的是, 这两种情况都没有产生相似的结果, 因为等离子体也会对温度产生影响。根据羟基自由基的发射光谱结果, 过氧化氢沉积物随氧或氮外加剂的增加而明显降低, 但随加湿的进气量增大 (图 3C)。此外, 与氩等离子体处理的液体 (图 3D) 相比, 在饲料气体中添加氮气导致亚硝酸盐浓度明显增高。这一工作流程也可能被用来研究等离子体对不同成分的液体的影响。例如, 过氧化氢浓度似乎是独立的存在胎儿小牛血清在 PBS 和 RPMI1640 细胞培养基 (图 3E)。在相同的样本中, 血清中亚硝酸盐浓度在 PBS 和细胞培养基中的存在降低, 与含有对应物的 non-serum (图 3F) 相比较。大多数超氧化物是在干氩气条件下产生的氧和/或氮外加剂显著淬火超氧化物生成, 除湿式氩氧等离子体 (图 3G)。 对于井皿中细胞的等离子体处理, 前一天被播种的含有细胞的平板被从孵化器中取出并添加到塑料支架上。采用程序化处理模式, 对蒸发进行补偿, 并将钢板放回孵化器20小时. 注意, 在这种孵化后, 细胞培养清可能被收集到一个新的, 空的96孔板和存储在-80° c 用于评估感兴趣的蛋白质。接下来, 天青被添加到每个井的细胞中。荧光天青到荧光卤的营业额只由活性的生成酶产生, 并与整体代谢活性相关 (图 4A)。荧光强度与平板的视觉感知相似, 并显示长时间血浆治疗的细胞毒作用 (图 4B)。湿气条件比干气条件更有害。板中的相同细胞被用于进一步的下游化验。显微镜下研究了平板中的细胞 (图 4C)。利用成像软件, 检查了板的几个井进行定性比较 (图 4D)。软件允许对每个井中所获得的视图字段中的单元格所覆盖的总面积进行量化, 结果数据被规范化为各自的控件 (图 4E)。在等离子体处理样品中, 特别是在湿化饲料气体条件下, 总细胞面积减少。成像后, 细胞洗净, 染色 anti-mouse 钙抗体, 分离, 并分析流式细胞仪 (图 4F)。平均荧光强度的钙染色在可行的细胞 (图 4G) 是计算和比较之间的样本 (图 4H)。等离子体治疗诱导小鼠黑色素瘤细胞表面钙上调, 与干饲料气条件下的等离子体处理时间相对应。对于湿化饲料气体的条件, 二十年代和四十年代的治疗导致更强的钙暴露比更致命的六十年代治疗时间。这表明, 对于钙暴露在细胞中的氧化剂数量, 有一个非线性的调节。 图 1: 等离子体医学研究的工作流程从物理到生物学.对常压氩等离子体射流的反应种输出进行了调节。利用光谱学对等离子体气相中的选定分子进行监测。等离子体用于处理液体和研究氧化剂沉积。在板培养的细胞是等离子体处理的, 并进行生物学读数。请单击此处查看此图的较大版本. 图 2: 等离子研究台的设置.(A) 不锈钢管道中的不同气体被驱动成几个通过中央面板控制的质量流量控制器。单独的饲料气体组成混合后, 使用一个面板的阀门。(B) 可以使用光学发射光谱对等离子体中的一些活性成分进行监测, 以研究各种气体成分之间的差异。(C) 用于高通量等离子体研究, 使用96井板。为了确保可编程和自动等离子处理的恒定起点, 该板被添加到一个框架, 保证相同的绝对位置的板材从每天。(D) 等离子射流固定在计算机控制的 xyz 表中, 位于层流罩下。所有96确切的位置和血浆的居住时间在每个井被写入程序文件引导血浆来源的运动。等离子体射流装置的主壳体以及马达控制器位于接近附近。(E) 96 井板的自动等离子处理。请单击此处查看此图的较大版本. 图 3: 等离子射流和液体分析.(A) 显示不同的进气条件的光发射谱。第二正系统的氮 (330 nm 至 380 nm) 增加了氮的混合物, 没有在氧气混合的情况下, 并显着减少湿化氩 (左手板)。309 nm (箭头) 的羟自由基峰值在氮气和氧气条件下下降, 但与氩气相比, 湿化氩明显增加。(B) 液体的气体暴露导致蒸发。在使用等离子和氩气处理的情况下, 在96well 板上的每井蒸发量是通过在处理前和治疗后用一个精细的刻度来确定的。与氩 gastreated 样品相比, plasmatreated 样品中的蒸发更高。(C) plasmatreated 液体中过氧化氢的生成与 (A) 中羟自由基的 309 nm 峰值有一定程度的相关。加湿 (5%) 氩等离子体增加过氧化物浓度约4fold。(D) 在将氮气添加到进料气中时, 亚硝酸盐升高, 而这种作用随加湿氩等离子体而增加。氧的加入减少了亚硝酸盐的生成, 但不显著。(E, F)过氧化氢和亚硝酸盐浓度显示在不同类型的液体, 即 RPMI1640 细胞培养基与 (R10F) 和没有 (R0F) 以及 PBS 与和没有胎儿小牛血清 (FCS)。过氧化物水平在不同培养基 (E) 之间没有差别, 而血清中亚硝酸盐水平则明显降低。(G) 干氩气进气的超氧化物产量最高;氮气、氧气或加湿氩的混合物使液体中的超氧化物沉积物更低。显示的数据 (B-G) 是两到三实验的平均值 + SEM。进行了统计分析 (C, D), 采用 one-way 分析的方差比较了整组的干湿进气条件对各自控制的影响 (** p < 0.01; ** < 0.001)。另外, 用全组平均值和 t 检验 (## < 0.001) 对氩气等离子体条件进行了比较。进一步的统计分析 (F) 采用 t 检验比较了样品中的每种等离子体处理和培养基条件的值与 fcs 和无 fcs (* p < 0.05; ** < 0.01);此外, 使用 t 检验 (# p < 0.05; ## < 0.001), 在每个血浆治疗时间内对 fcs 或非 fcs 的溶液进行了比较。请单击此处查看此图的较大版本. 图 4: 等离子体处理及其对细胞的影响(A) 细胞暴露于血浆, 天青在20小时后增加, 以评估代谢活动。(B) 与气体控制相比, plasmatreated 样品的活性显著降低。气体加湿会明显减少, 而氧气和/或氮气的增加会导致干燥和潮湿的氩气条件的毒性。(C) 添加含有碘碘化物 (PI) 的培养基。(D) 概述了带有数字相衬 (橙色) 的板的井, 该板块代表每个细胞和 PI (绿色) 的胞浆分数来识别死细胞。成像工具允许定量的总面积在视野内的每个井覆盖的细胞。(F) 细胞随后用抗体或其他细胞标记进行冲洗和孵育, 以利用流式细胞仪表征生物等离子体的作用。(G) 采用了浇注策略, 并对样品进行了标记分析和比较。显示的数据 (B、E、H) 表示三独立实验的一个代表的平均 + SEM。缩放条形图 = 200 µm (D)。统计比较是使用 two-way 分析方差 (B, H) 进行比较, 对每个气体条件, 每个等离子体处理其各自的气体控制 (* p < 0.05; ** < 0.01; ** p < 0.001)。另外, 对氮气和/或氧外加剂的每个条件的值分别与氩气等离子体的值进行了比较 (two-way 的方差分析; < 0.001)。请单击此处查看此图的较大版本.