G2-seq: En hög genomströmning sekvensering-baserad teknik för att identifiera sent replikera regioner i genomet
Summary
Vi beskriver en teknik för att kombinera flödescytometri och hög genomströmning sekvensering att identifiera sena replikerande regioner i genomet.
Abstract
Många tekniker har utvecklats för att följa utvecklingen av DNA-replikation genom den S fasen i cellcykeln. De flesta av dessa tekniker har varit riktad mot förtydligandet av platsen och tidpunkten för inledandet av genomet dubbelarbete i stället för dess slutförande. Det är dock viktigt att vi förstår regioner i genomet som är sist att slutföra replikeringen, eftersom dessa regioner drabbas av förhöjda nivåer av kromosomala brott och mutation, och de har förknippats med både sjukdom och åldrande. Här beskriver vi hur vi har förlängt en teknik som har använts för att övervaka replikering initiering för att istället identifiera de regionerna i genomet senast för fullständig replikering. Denna strategi är baserad på en kombination av flödescytometri och hög genomströmning sekvensering. Även om detta betänkande fokuserar på tillämpningen av denna teknik på jäst, kan metoden användas med celler som kan sorteras i en flödescytometer enligt DNA-innehåll.
Introduction
Eukaryota genomet replikering initieras på flera diskreta platser, kallas beskärningarna av replikering, från vilka replikering gafflar fortsätter i båda riktningarna (ses i Fragkos et al., 2015-1). Ursprung varierar i både deras timing och effektivitet av bränning, och flera tekniker har utvecklats för att övervaka replikering ursprung aktivitet och klarlägga orsakerna till denna variation. Aktiviteten av enskilda ursprung kan härledas från nivåer av enkelsträngat DNA2, som utgör runt aktiva ursprung, eller genom att använda 2D gelelektrofores för att övervaka specifika replikering intermediärer3, vilka båda kan upptäckas med radioaktiva sonder. Båda dessa tekniker tillämpas lättare i S. cerevisiae än i däggdjursceller, eftersom ursprung är begränsade till specifika kända sekvenser i fd. Med tillkomsten av microarrays blev det möjligt att bedöma ursprung bränning globalt. Detta gjordes först av märkning DNA med tunga isotoper, släppa celler från en G1-blocket i medium innehållande lätta isotoper och sedan övervaka bildandet av tunga-lätta hybrid DNA över genomet4. Införandet av hög genomströmning sekvensering tillät liknande genome-wide kontroll av ursprung aktivitet utan krav på dyra isotopiska märkning. Cellerna var sorterade i en flödescytometer enligt DNA-innehåll och deras DNA som utsätts för djupsekvensering. Eftersom sekvensen täckning intäkter från 1 x till 2 x under loppet av S fas, kan relativa replikering timing bedömas genom att jämföra Läs djupet av celler i S-fas till dem i G1 eller G25,6. Dessa tekniker, särskilt tillämpas på jäst, ledde till en djupare förståelse för hur DNA-sekvens, kromatinstruktur och DNA-replikering proteiner reglerar ursprung timing och effektivitet.
Trogen överföring av genetisk information under cellulär proliferation kräver inte bara framgångsrika inledandet av DNA-replikation, som äger rum på ursprung, men också framgångsrikt slutförande av replikering, vilket inträffar där replikering gafflar möts. Som inledande replikering varierar tidpunkten för slutförande av replikering i genomet med vissa regioner återstående unreplicated även sent i cellcykeln. Sådana områden kan vara särskilt långt från aktiv replikering ursprung eller kan innehålla sekvenser eller kromatin strukturer som hämmar DNA-polymerases. Sent replikera regioner kan manifestera sig som sårbara platser, som är associerade med kromosomala brott och högre mutation priser, och har varit inblandade i cancer och åldrande7,8,9. Men trots vikten av korrekt slutförande av DNA-replikation i underhåll av genomet stabilitet, har vår förståelse av var och hur detta sker halkat långt efter replikering insättande. Och medan enskilda gener vars slutet replikering har associerats med sjukdomen har studerats med, till exempel qPCR10, globala studier inriktas på att klarlägga platserna och bakomliggande orsaker sen replikering har saknats. Här beskriver vi en teknik som vi refererar till som ”G2 seq” där vi kombinerar flödescytometri med hög genomströmning sekvensering att belysa slutförandet av genomet replikering i jäst11. Med smärre förändringar, kan detta protokoll anpassas till alla celler som kan vara flöde-sorterad enligt DNA-innehåll.
Protocol
Representative Results
Discussion
Medan den här tekniken är robust och relativt rakt framåt, särskild uppmärksamhet bör ägnas följande:
(1) Vi rekommenderar att kulturer växa för minst 12 h innan de når log fas, eftersom skillnader manifesteras i cellcykeln distributioner om kulturer skördas efter att ha uppnått önskad täthet bara 4 h efter inympningen. Vårt antagande är att en cellcykeln-distribution som har nått en relativt stabil equilibrium bättre representerar en ”riktig” log fas fördelning än en …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöds av grant NIH GM117446 till A.B.
Materials
| YeaStar Genomic DNA kit | Genesee Scientific | 11-323 | |
| 1 µM SYTOX Green | ThermoFisher | 57020 | resuspend in 50 mM sodium citrate, pH 7.2 |
| 50 mM sodium citrate, pH 7.2 | |||
| RNase solution (0.25 mg / mL) | Sigma | R6513 | 0.25 mg / mL RNaseA resuspended in 50 mM sodium citrate, pH 7.2, boil RNase solution for 10 minutes before the first use only, and from then on store at -20° |
| proteinase K solution (20 mg / mL) | ThermoFisher / Invitrogen | 25530-015 | resuspend in 10 mM Tris, pH 7.5, 2 mM CaCl2, 50% glycerol, store at -20°C |
| Model 50 Sonic Dismembrator | Fisher Scientific | FB50A220 | |
| BD Biosciences FACSAria II | BD Biosciences | 644832 | |
| Zymo-spin III columns | Zymo Research | C1005 | |
| Qubit dsDNA HS Assay Kit | ThermoFisher | Q32851 | |
| Qubit 3.0 Fluorometer | ThermoFisher | Q33216 | |
| Covaris Model LE220 Focused-Ultrasonicator | Covaris | 500219 | |
| Illumina TruSeq DNA LT Sample Prep Kit | Illumina | 15026486 | |
| Illumina HiSeq 2500 instrument | Illumina | SY–401–2501 | |
| gsnap alignment software | open source software / Genentech | http://research-pub.gene.com/gmap |
Referências
- Fragkos, M., Ganier, O., Coulombe, P., Mechali, M. DNA replication origin activation in space and time. Nat Rev Mol Cell Biol. 16, 360-374 (2015).
- Santocanale, C., Diffley, J. F. A Mec1- and Rad53-dependent checkpoint controls late-firing origins of DNA replication. Nature. 395, 615-618 (1998).
- Brewer, B. J., Fangman, W. L. A replication fork barrier at the 3′ end of yeast ribosomal RNA genes. Cell. 55, 637-643 (1988).
- Raghuraman, M. K., et al. Replication dynamics of the yeast genome. Science. 294, 115-121 (2001).
- Muller, C. A., Nieduszynski, C. A. Conservation of replication timing reveals global and local regulation of replication origin activity. Genome Res. 22, 1953-1962 (2012).
- Koren, A., Soifer, I., Barkai, N. MRC1-dependent scaling of the budding yeast DNA replication timing program. Genome Res. 20, 781-790 (2010).
- Lang, G. I., Murray, A. W. Mutation rates across budding yeast chromosome VI are correlated with replication timing. Genome Biol Evol. 3, 799-811 (2011).
- Durkin, S. G., Glover, T. W. Chromosome fragile sites. Annu Rev Genet. 41, 169-192 (2007).
- Dillon, L. W., Burrow, A. A., Wang, Y. H. DNA instability at chromosomal fragile sites in cancer. Curr Genomics. 11, 326-337 (2010).
- Widrow, R. J., Hansen, R. S., Kawame, H., Gartler, S. M., Laird, C. D. Very late DNA replication in the human cell cycle. Proc Natl Acad Sci U S A. 95, 11246-11250 (1998).
- Foss, E. J., et al. SIR2 suppresses replication gaps and genome instability by balancing replication between repetitive and unique sequences. Proc Natl Acad Sci U S A. 114, 552-557 (2017).
- Wu, T. D., Reeder, J., Lawrence, M., Becker, G., Brauer, M. J. GMAP and GSNAP for Genomic Sequence Alignment: Enhancements to Speed, Accuracy, and Functionality. Methods Mol Biol. 1418, 283-334 (2016).
- Quinlan, A. R., Hall, I. M. BEDTools: a flexible suite of utilities for comparing genomic features. Bioinformatics. 26, 841-842 (2010).
- Langmead, B. Aligning short sequencing reads with Bowtie. Curr Protoc Bioinformatics. , 17 (2010).
- Li, H., Durbin, R. Fast and accurate short read alignment with Burrows-Wheeler transform. Bioinformatics. 25, 1754-1760 (2009).
- Kellis, M., Birren, B. W., Lander, E. S. Proof and evolutionary analysis of ancient genome duplication in the yeast Saccharomyces cerevisiae. Nature. 428, 617-624 (2004).
- Goodwin, S., McPherson, J. D., McCombie, W. R. Coming of age: ten years of next-generation sequencing technologies. Nat Rev Genet. 17, 333-351 (2016).
