G2-seq: En høy gjennomstrømning sekvensering-basert teknikk for å identifisere sent replikere regioner i genomet
Summary
Vi beskriver en teknikk for å kombinere flowcytometri og høy gjennomstrømning sekvensering å identifisere sent etterligner områder i genomet.
Abstract
Mange teknikker er utviklet for å følge utviklingen av utryddelse S fasen av cellen syklus. De fleste av disse teknikkene har vært rettet mot utviklingen av plasseringen og tidsberegningen for initiering av genomet duplisering i stedet for fullføring. Imidlertid er det avgjørende at vi forstår områder av genomet som er sist å fullføre replikering, fordi disse områdene lide forhøyede nivåer av chromosomal brudd og mutasjon, og de har blitt assosiert med både sykdom og aldring. Her beskriver vi hvordan vi har utvidet en teknikk som er brukt til å overvåke replikering innvielsen å i stedet identifisere disse regionene i genomet sist komplett replikasjon. Denne tilnærmingen er basert på en kombinasjon av flowcytometri og høy gjennomstrømning sekvensering. Selv om denne rapporten fokuserer på bruk av denne teknikken til gjær, kan tilnærming brukes med alle celler som kan sorteres i en flyt cytometer etter DNA innhold.
Introduction
Eukaryote genomet replikering startes på flere separate områder, kalt opprinnelsen til replikering fra hvilke replikering gafler fortsette i begge retninger (omtalt i Fragkos et al., 20151). Opprinnelse varierer i både timing og effektiviteten av skyte, og flere teknikker er utviklet for å overvåke replikering opprinnelse aktivitet og belyse årsakene til denne varianten. Aktiviteten til individuelle opprinnelse kan være avledet fra nivåer av enkelt-strandet DNA2, hvilke skjemaer rundt aktive opprinnelse, eller ved hjelp av 2D gel geleelektroforese overvåke bestemte replikering mellomprodukter3, begge kan oppdages med radioaktivt sonder. Begge disse teknikkene brukes lettere i S. cerevisiae enn i pattedyrceller, fordi opprinnelse er begrenset til bestemte kjente sekvenser i det tidligere. Med ankomsten av microarrays ble det mulig å vurdere opprinnelse avfyring globalt. Dette ble først gjort av merking DNA med tunge isotoper ut celler fra en G1 blokk i middels inneholder lys isotoper og deretter overvåking dannelsen av tunge lys hybrid DNA over genomet4. Innføring av høy gjennomstrømning sekvensering tillatt lignende genomet hele overvåking av opprinnelse aktivitet uten krav til dyre isotopanrikning merking. Celler er sortert i en flyt cytometer etter DNA innhold og DNA utsatt for dyp sekvensering. Fordi sekvens dekning provenyet fra 1 x 2 x i løpet av S fase, kan relativ replikering timing vurderes ved å sammenligne Les dypet av celler i S fasen de i G1 eller G25,6. Disse teknikkene, spesielt på gjær, førte til en dypere forståelse av hvordan DNA sekvens, chromatin struktur og DNA replikering proteiner regulere opprinnelse timing og effektivitet.
Trofaste overføring av genetisk informasjon under cellular spredning krever ikke bare vellykket oppstart av utryddelse, som finner sted på opprinnelse, men også vellykket gjennomføring av replikering, som oppstår der replikering gafler møtes. Som Innvielse av replikering varierer tidspunktet for ferdigstillelse av replikering over genomet med visse regioner gjenværende unreplicated selv sent i cellen syklus. Slike områder kan være spesielt fjernt fra aktive replikering opprinnelse eller inneholder sekvenser eller chromatin strukturer som hindrer DNA polymerases. Sent replikere regioner kan manifestere seg som sårbare områder som er tilknyttet chromosomal brudd og høyere mutasjon priser, og har vært innblandet i kreft og aldring7,8,9. Men til tross for betydningen av riktig gjennomføring av utryddelse i vedlikehold av genomet stabilitet, har vår forståelse av hvor og hvordan dette skjer ligget langt bak av replikering innvielse. Og mens enkelte gener som sent replikering har vært forbundet med sykdommen har vært undersøkt med, for eksempel qPCR10, globale studier rettet mot Klargjørende plasseringene og underliggende årsaker sen replikering har manglet. Her beskriver vi en teknikk vi se som “G2 seq” der vi kombinerer flowcytometri med høy gjennomstrømning sekvensering å belyse ferdigstillelse av genomet replikasjon i gjær11. Med mindre endringer, kan denne protokollen tilpasses celler som kan flyt-sortert etter DNA innhold.
Protocol
Representative Results
Discussion
Mens denne teknikken er robust og relativt rett frem, spesiell oppmerksomhet bør gis til følgende:
(1) vi anbefaler at kulturer vokser minst 12 h før de når loggen fase, siden forskjeller manifestere i cellen syklus distribusjoner hvis kulturer høstes etter å ha nådd ønsket tetthet bare 4 h etter vaksinering. Vår antakelse er at en celle syklus distribusjon som har nådd en relativt stabil likevekt bedre representerer en “ekte” Logg fase distribusjon enn en distribusjon som er fortsat…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbeidet ble støttet av grant NIH GM117446 til A.B.
Materials
| YeaStar Genomic DNA kit | Genesee Scientific | 11-323 | |
| 1 µM SYTOX Green | ThermoFisher | 57020 | resuspend in 50 mM sodium citrate, pH 7.2 |
| 50 mM sodium citrate, pH 7.2 | |||
| RNase solution (0.25 mg / mL) | Sigma | R6513 | 0.25 mg / mL RNaseA resuspended in 50 mM sodium citrate, pH 7.2, boil RNase solution for 10 minutes before the first use only, and from then on store at -20° |
| proteinase K solution (20 mg / mL) | ThermoFisher / Invitrogen | 25530-015 | resuspend in 10 mM Tris, pH 7.5, 2 mM CaCl2, 50% glycerol, store at -20°C |
| Model 50 Sonic Dismembrator | Fisher Scientific | FB50A220 | |
| BD Biosciences FACSAria II | BD Biosciences | 644832 | |
| Zymo-spin III columns | Zymo Research | C1005 | |
| Qubit dsDNA HS Assay Kit | ThermoFisher | Q32851 | |
| Qubit 3.0 Fluorometer | ThermoFisher | Q33216 | |
| Covaris Model LE220 Focused-Ultrasonicator | Covaris | 500219 | |
| Illumina TruSeq DNA LT Sample Prep Kit | Illumina | 15026486 | |
| Illumina HiSeq 2500 instrument | Illumina | SY–401–2501 | |
| gsnap alignment software | open source software / Genentech | http://research-pub.gene.com/gmap |
Referências
- Fragkos, M., Ganier, O., Coulombe, P., Mechali, M. DNA replication origin activation in space and time. Nat Rev Mol Cell Biol. 16, 360-374 (2015).
- Santocanale, C., Diffley, J. F. A Mec1- and Rad53-dependent checkpoint controls late-firing origins of DNA replication. Nature. 395, 615-618 (1998).
- Brewer, B. J., Fangman, W. L. A replication fork barrier at the 3′ end of yeast ribosomal RNA genes. Cell. 55, 637-643 (1988).
- Raghuraman, M. K., et al. Replication dynamics of the yeast genome. Science. 294, 115-121 (2001).
- Muller, C. A., Nieduszynski, C. A. Conservation of replication timing reveals global and local regulation of replication origin activity. Genome Res. 22, 1953-1962 (2012).
- Koren, A., Soifer, I., Barkai, N. MRC1-dependent scaling of the budding yeast DNA replication timing program. Genome Res. 20, 781-790 (2010).
- Lang, G. I., Murray, A. W. Mutation rates across budding yeast chromosome VI are correlated with replication timing. Genome Biol Evol. 3, 799-811 (2011).
- Durkin, S. G., Glover, T. W. Chromosome fragile sites. Annu Rev Genet. 41, 169-192 (2007).
- Dillon, L. W., Burrow, A. A., Wang, Y. H. DNA instability at chromosomal fragile sites in cancer. Curr Genomics. 11, 326-337 (2010).
- Widrow, R. J., Hansen, R. S., Kawame, H., Gartler, S. M., Laird, C. D. Very late DNA replication in the human cell cycle. Proc Natl Acad Sci U S A. 95, 11246-11250 (1998).
- Foss, E. J., et al. SIR2 suppresses replication gaps and genome instability by balancing replication between repetitive and unique sequences. Proc Natl Acad Sci U S A. 114, 552-557 (2017).
- Wu, T. D., Reeder, J., Lawrence, M., Becker, G., Brauer, M. J. GMAP and GSNAP for Genomic Sequence Alignment: Enhancements to Speed, Accuracy, and Functionality. Methods Mol Biol. 1418, 283-334 (2016).
- Quinlan, A. R., Hall, I. M. BEDTools: a flexible suite of utilities for comparing genomic features. Bioinformatics. 26, 841-842 (2010).
- Langmead, B. Aligning short sequencing reads with Bowtie. Curr Protoc Bioinformatics. , 17 (2010).
- Li, H., Durbin, R. Fast and accurate short read alignment with Burrows-Wheeler transform. Bioinformatics. 25, 1754-1760 (2009).
- Kellis, M., Birren, B. W., Lander, E. S. Proof and evolutionary analysis of ancient genome duplication in the yeast Saccharomyces cerevisiae. Nature. 428, 617-624 (2004).
- Goodwin, S., McPherson, J. D., McCombie, W. R. Coming of age: ten years of next-generation sequencing technologies. Nat Rev Genet. 17, 333-351 (2016).
