Imagem de tecidos amiloides manchado com Luminescent Oligothiophenes conjugados por hiperespectrais Confocal imagem de vida de fluorescência e microscopia
Summary
Deposição de amiloide é uma marca registrada de diferentes doenças e aflige muitos órgãos diferentes. Este artigo descreve a aplicação da fluorescência luminescent oligothiophene conjugados coloração em combinação com técnicas de microscopia de fluorescência. Este método de coloração representa uma poderosa ferramenta para detecção e exploração de agregados de proteínas em configurações clínicas e científicas.
Abstract
As proteínas que o depositam de amiloide nos tecidos por todo o corpo podem ser a causa ou a consequência de um grande número de doenças. Entre estas encontramos doenças neurodegenerativas, como Alzheimer e Parkinson doença afecta principalmente o sistema nervoso central e amiloidose sistêmica onde amiloide soro A, transtirretina e cadeias leves de IgG depositam como amiloide no fígado, do carpo túnel, baço, rins, coração e outros tecidos periféricos. Amiloide tem sido conhecido e estudado por mais de um século, muitas vezes utilizando corantes específicos amiloides como vermelho Congo e Thioflavin T (ThT) ou Thioflavin (ThS). Neste trabalho, apresentamos heptamer-formil ácido acético de tiofeno (hFTAA) como um exemplo de recentemente desenvolvidos complementa estes corantes chamado luminescent oligothiophenes conjugados (LCOs). hFTAA é fácil de usar e é compatível com coloração co na imunofluorescência ou com outros marcadores celulares. Pesquisa extensiva provou que hFTAA detecta uma ampla gama de agregados de proteínas de doença associada que corantes convencionais de amiloide. Além disso, hFTAA também pode ser aplicado para atribuição óptica de morfotipos agregados distintos para permitir estudos de polimorfismo fibrila amiloide. Enquanto a metodologia de imagem aplicada é opcional, nós aqui demonstrar imagens hiperespectrais (HIS), microscopia confocal e imagem latente (FLIM) tempo de vida de fluorescência a laser. Estes exemplos mostram algumas das técnicas de imagem onde LCOs podem ser usados como ferramentas para adquirir conhecimento mais detalhado da formação e propriedades estruturais de amiloides. É uma limitação importante à técnica, quanto a todas as técnicas de microscopia óptica convencional, a exigência de tamanho microscópico de agregados para permitir a detecção. Além disso, o agregado deve incluir uma estrutura repetitiva de β-folha para permitir a ligação de hFTAA. Exposição excessiva de fixação e/ou epítopo que modificam a estrutura agregada ou conformação pode processar pobre hFTAA vinculação e, portanto, apresentam limitações a imagem exata.
Introduction
Deposição de amiloide nos tecidos é uma característica patológica em um número de doenças como a doença de Alzheimer, doença de Parkinson, amiloidose sistêmica e doenças de príon. Apesar da prevalência de doenças relacionadas com a amiloide e o fato de que perto de 40 proteínas diferentes até à data foram classificados como precursores amiloides em humano1, pouco se sabe sobre a relação entre a deposição de amiloide e fenótipo da doença. Histologia das amostras dos pacientes humanos tem sido usado tanto para fins de diagnósticos e científicos. Um grande número de modelos animais foram criado para investigar a correlação entre carga amiloide e comportamento, esperança de vida e um número de outro ler fenotípico outs de progressão de doença,2,3. Grandes esforços estão sendo feitos também na descoberta de medicamentos e design para combater alguns dos nossas mais temidas doenças generalizadas. No entanto, a avaliação da conexão entre genótipo, fenótipo, carga de placa amiloide e administração de droga não é para a frente. As ferramentas para imagem de amiloide nos tecidos e coloração são muitas vezes rude e fornecem informações de baixa resolução sobre estrutura e formação de amiloide.
Vermelho Congo birrefringência, ThT e ThS fluorescência são exemplos de métodos clássicos para detectar e analisar carga amiloide em amostras de tecido da pacientes biópsias e post mortem amostras e modelos animais de doença4. Estas técnicas têm sido usadas por várias décadas (vermelho de Congo desde a década de 1920 e ThT e derivados desde a década de 1960), e apesar de instrumentação tem sido aperfeiçoada e permite a análise detalhada, os procedimentos de coloração e análise ainda estão sendo realizadas da mesma forma como há quase um século.
Neste trabalho, descrevemos a utilização de um corante de amiloide romance altamente sensível, hFTAA5, que permite a deteção dos depósitos de proteína imatura pequena com alta precisão, bem como a detecção de amiloide maduro. Em comparação com corantes convencionais, hFTAA tem sido comprovada detectar uma gama maior de doença associados agregados de proteína a5,6,7. Além disso, hFTAA também pode ser aplicado para atribuição óptica de morfotipos agregados distintos8. Aqui, descrevemos a coloração hFTAA e análise de tecido do estabelecido modelos animais da doença de Creutzfeld-Jacob e proteína de Precursor da β-amiloide (APP) ratos transgénicos projetado para imitar o desenvolvimento da placa na doença de Alzheimer9,10 . Mostramos também a análise de diagnóstico e post mortem amostras de pacientes que sofrem de amiloidose sistêmica. Os LCOs têm propriedades intrínsecas que permite fazer um relatório sobre as diferenças conformacionais dentro de uma placa; e combinando dois LCOs com propriedades diferentes em matéria de vinculação e fluorescência, a diferença é ainda mais pronunciada11. Um microscópio de epifluorescência equipados com filtros de passe longo e uma cabeça de câmara hiperespectrais é usada para ativar a classificação objectiva das propriedades espectrais e gravação de micrografias para análise espectral. Microscopia de fluorescência confocal com um laser sintonizável como a fonte de excitação é usada para avaliar as propriedades tridimensionais de uma placa amiloide em maior detalhe. O laser sintonizável habilita a coleção do espectro de excitação e um passo menos seleção de comprimentos de onda de emissão no microscópio co imagens de fluorescência LCO e imunofluorescência para determinar a localização co da proteina alvo e amiloide. FLIM oferece uma sensibilidade sem precedentes para diferenças conformacionais impostas as LCOs e revela diferenças que não podem ser detectadas em espectros de emissão de fluorescência.
Os principais objetivos com o método de coloração descrito são para facilitar a detecção sensível de pequenos depósitos amiloides e caracterizar o polimorfismo conformacional dentro depósitos amiloides. Este conhecimento é importante para a compreensão básica das doenças de agregação da proteína.
Protocol
Representative Results
Discussion
Deposição de proteínas aberrantly dobradas em amiloide é um evento-chave de muitos processos de doença. Placas amiloides extracelulares composta de peptídeos Aβ e neurofibrilares intracelulares formadas por hyperphosphorylated tau são encontradas no cérebro de pacientes da doença de Alzheimer. Uma variedade de proteínas diferentes, por exemplo, transtirretina (TTR), componente do soro amiloide A (SAA) e misfold de cadeia leve de IgG e manifesto como depósitos amiloides nos tecidos fora do SNC. Embora amiloide depósitos foram conhecidos e estudados por mais de um século, ainda falta conhecimento detalhado de como amiloide deposição é iniciada no nível molecular e o que pode ser feito para evitar este processo. Para a doença de Alzheimer, é necessário comprovar como o processo de amiloidose está associado a neurodegeneração. Uma busca de chave na missão de tratar a amiloidose é desenvolver romance aperfeiçoá-lo ferramentas para monitoramento de amiloide iniciação, progressão e regressão; Portanto, detecção de amiloide alvo é chave. A longo prazo, os diagnósticos clínicos irão beneficiar aumentando a sensibilidade e seletividade de amiloide coloração métodos7,15. Desafios atuais a este respeito são tremendos e é uma área de pesquisa muito ativa. Uma questão principal para o desenvolvimento clínico e ensaios é diagnóstico prognóstico. Estas doenças prováveis começam bem antes que os sintomas aparecem, mas começar com tratamento lá deve ser a identificação da doença. Neste documento, a sensibilidade é um aspecto chave para novas metodologias. Além disso, esta questão é ainda mais complexa porque alguns agregados de proteína são tóxicos, alguns são protetores, e alguns são neutros. Daí a capacidade de monitorar morfotipos agregados específicos é essencial, uma vez que a existência de espécies distintas de agregados foi sugerida para explicar o fenótipo heterogêneo, relatado por uma diversidade de Doenà § as Neurodegenerativas proteína agregação. Por exemplo, a proteína príon é um exemplo clássico de como uma sequência idêntica primária de aminoácidos pode DCJ em morfotipos agregados distintos, que dão origem a cepas específicas do prião. Polimorfismo de semelhante também foi relatado para o peptídeo Aβ, α-synuclein e tau. A este respeito, LCOs foram mostrados para ser excelentes ferramentas para atribuição óptica de morfotipos agregados distintos. Proteína príon-cepa-específico agrega, depósitos de proteína encontrados em diversos tipos de amiloidose sistêmica, bem como polimórfico Aβ e agregados de tau distinguiram-se devido o fenômeno óptico conformationally induzido observado a partir do LCOs.
Deposição de amiloide é um evento que ocorre nos tecidos que são difíceis de penetrar com métodos biofísicos ou bioquímicos de precisão molecular. A possibilidade de sonda eventos ex vivo, in vivoe em vitro usando as mesmas moléculas LCO prepara o palco para unraveling eventos que ocorrem na vivo usando técnicas que só são possíveis aplicar em ex vivo ou em Vitro amostras de11,17. Um modelo estrutural recentemente relatada alta resolução mostra que o LCO pentamérica ALCA (pFTAA) liga-se em uma cavidade formada por cadeias laterais alinhadas paralelamente ao eixo de fibrila abrangendo 6 em registro-beta-hiper-velocidade18, demonstrando que é possível obter conhecimento de resolução atômica sobre as entidades do alvo LCO. Em essência, o modo de vinculação cavidade e vinculação de pFTAA é semelhante ao vermelho Congo19, ditada por um sulco forrado com repetitivas positiva carregada Lys cadeias laterais. A afinidade de LCOs parecem ser melhor em comparação com vermelho Congo, provavelmente devido a flexibilidade da cadeia e interações de van der Waals forte dos átomos de enxofre dos anéis tiofeno em direção a cavidade hidrofóbica. A detecção de espécies prefibrillar (antes responde ThT)5,20 aparece dependente folhas β repetitivos, compostas no registro paralelo-beta-vertentes, que para hFTAA, sendo duas unidades de tiofeno mais de pFTAA extensão de cruzamento de até 8 beta-fios.
O protocolo de coloração requer atenção à resolução de problemas para os seguintes passos: (i) fixação: fixação extensa de amostras de tecido pode perturbar a estrutura amiloide e limitar a possibilidade de detectar a variação nos espectros de fluorescência induzidos por conformacional distorção da molécula hFTAA. Fixação suave de cryosections de material fresco congelado é preferida para alcançar ótima resolução espectral. No entanto, hFTAA vai manchar e fluorescem amiloide em tecido fixo mas com eficácia reduzida e menos variação espectral. (ii) o epítopo exposição: pré-tratamento do tecido conseguir epítopo exposição para ligação de anticorpo ocasionalmente pode reduzir a capacidade de hFTAA ligar por causa do interrompido estrutura amiloide. Se este é um problema, e exposição de epítopo é um passo crucial no anticorpo que mancha o protocolo, usando seções consecutivas para anticorpo e hFTAA, respectivamente pode ser considerado. (iii) overstaining: hFTAA é extremamente sensível. Soluções de trabalho devem ser mantidas em concentração baixa nM. Diminua a concentração de hFTAA se a coloração de fundo é um problema. Se elementos que se ligam hFTAA são esparsos no tecido, um excesso de hFTAA pode agregar e acumular-se no meio de montagem. Isto é reconhecido como fluorescência que não consta do plano de foco do tecido em si. Se isto for exibida, mergulhe o slide montado em PBS até a lamínula pode ser deslizada da seção, lave com PBS e remontar com meio de montagem fresco e um novo deslizamento da tampa. (iv) o filtro com base em imagem: Este documento descreve principalmente espectralmente resolvido fluorescência imagem usando filtros de passe longo ou múltiplos canais de deteção. hFTAA também pode ser monitorado usando filtros de passe curto. Esteja ciente de que isso irá reduzir o contraste e abolir as possibilidades de detectar várias cores.
Nos últimos anos tornou-se evidente que como pesquisa ferramentas, LCOs fluorescentes e em particular o hFTAA mostrar propriedades altamente promissoras. Os resultados foram demonstrados para uma vasta variedade de proteínas e Estados de doença, variando de deteção de hFTAA dos agregados no interior das células (tau, miosite corpo de inclusão), amiloidose sistêmica de amiloide soro A, transtirretina, cadeias leves de imunoglobulina (kappa e lambda) seminogelin 1, príon proteína (incluindo amostras clínicas)21, polipeptídeo amiloide ilhéu e insulina7,15. Um fator limitante para a implementação de hFTAA como uma ferramenta de diagnóstico é que a microscopia de fluorescência não é extensivamente usada em laboratórios de patologia amiloide rotina. Além disso, dele não está prontamente disponível na clínica. No entanto, hFTAA coloração amiloide e microscopia de fluorescência têm sido utilizados em laboratórios clínicos em um microscópio de fluorescência com base do filtro e deveser considerado como um método diagnóstico complementar. Isto foi demonstrado recentemente em biópsias do túnel do carpo com amiloidose transtirretina usando as configurações básicas para fluorescência em uma forma automatizada de22.
Além disso, além de várias proteínas, hFTAA fluorescência reconhece uma grande variedade de tipos de fibrila e pre-fibrillar agregados amiloides, por exemplo, espécies fibrillar caminho foram detectados e caracterizadas. Nesta publicação, demonstrámos um Ice em vários tipos de amostra utilizando três técnicas de microscopia. O uso da síntese controlada também permitiu o desenvolvimento de LCOs para versátil deteção de alvos biomolecular, por exemplo, gravação de interações de plasmon de superfície (SPR) de ressonância23 e radioativos por emissão de pósitrons tomografia computadorizada (PET)24.
Até à data, foram publicados mais de 25 diferentes LCOs com. Um aumento da utilização de LCOs para a imagem latente de depósitos amiloides aumentará o conhecimento e a compreensão de como estes agregados associada a doença de montam, desmontagem e interferem com os órgãos e indivíduos em que residem.
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Os autores desejam agradecer Mikael Lindgren e Chanan Sluzny para o Conselho em microscopia de fluorescência e Adriano Aguzzi, Johan Bijzet, Bouke Hazenberg, Frank Heppner, Mathias Jucker, Therese Klingstedt, Karin Magnusson, Christina Sigurdson, Daniel Sjölander, Christoph Röcken, Gunilla Westermark, Per Westermark e Kurt Zatloukal por contribuir cortes histologicos ou micrografias exibidas nesta publicação. A coleção de dados apresentados neste documento foi financiada por contribuições de sueca cérebro Foundation (Hjärnfonden), a associação de Alzheimer sueco (Alzheimerfonden), o Conselho de pesquisa Sueco (VR), a associação Göran Gustafsson, Georg & Astrid Olsson, projeto UE FP7 saúde LUPAS e Universidade de Linköping.
Materials
| hFTAA/Amytracker545 | Ebba Biotech | ||
| Dako fluorescene mounting medium | Agilent technologies | GM304 | |
| LeicaDM6000 | Leica | ||
| Lumen 200 | Prior | ||
| Spectraview system | ASI spectral imaging | ||
| Spectraview software | ASI spectral imaging | ||
| LSM780 | Zeiss | ||
| Zen 2010b v6.0 software | Zeiss | ||
| FLIM system | Becker & Hickl | ||
| Ar/ML 458/488/514 | Zeiss | ||
| Tunable Laser In Tune | Zeiss |
Referências
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