장기 이식에서 HLA Alloantibodies의 검출에 대 한 펩 티 드 배열 맞춤
Summary
장기 기증자와 받는 사람 쌍 사이 인간 백혈구 항 원 (HLA) 시퀀스에 불일치 장기 이식의 거부 항 체 중재의 주요 원인입니다. 여기 안티 기증자 HLA alloantibodies 기관 수령인에 프로브를 개별 기증자의 HLA 시퀀스를 기반으로 하는 사용자 지정 항 배열의 사용 선물이.
Abstract
장기 이식, 기능 및 장 수는 이식의 비판적으로 의존 인간 백혈구 항 원 (HLA)에 대 한 면역 거부 반응 제어 성공. 실험실 테스트 안티-HLA 면제, 기존으로 선물의 기반으로하는 조직 적합성 지침 또는 드 노 보 주요 이식 장벽을 구성 하는 HLA 항 체를 생성. 현재 테스트 ~ 100 미리 재조합 HLA 항 원에 대 한 고정된 된 이식 세라 프로브를 사용 하 여 단일 원 구슬 (SAB) 플랫폼을 기반으로 합니다. 그러나, 인 간에 있는 HLA 종류, 쌍둥이 이외의 HLA 시퀀스의 동일한 조합을 공유 하는 수 없이 두 개인의 훨씬 더 큰 다양 한을 존재 한다. HLA 타이핑과 직접 시퀀싱 기술 DNA 순서는 기증자의 사이 어떤 불일치를 정확 하 게 캡처할 수 있습니다 받는 사람의 HLA, SAB 분석 결과 시퀀스 표시에서 그것의 한정 된 다양성 때문이 정확 하 게 감지할 수 있는 동안 기증자의 HLA 불일치에 대 한 구체적으로 alloantibodies입니다. 우리가 감지 하 고 개인으로 반대로 기증자 HLA 항 체의 특성 다른 기술을 사용 하 여 보완 방법을 개발 하고자 했다. 검사 도구는 주문 펩 티 드 항 체 중재 거절에 대 한 위험을 평가 하기 위해 기관 수령인의 포스트 이식 세라 프로 빙에 대 한 기증자 HLA 파생 된 시퀀스의. 한 기증자 받는 쌍에 대 한 단일 배열에 600 독특한 펩 티 드까지 만들어집니다 기반으로 기증자의 HLA 단백질 시퀀스에 15-아미노 산 성 순서로 하나 이상 일치 하지 않는 찌 꺼 기를 들고 각 펩 티 드. 사전 및 사후 식을 세라가이 배열에 대 한 항 원 패턴을 비교를 우리의 파일럿 실험, 또한 관련 된 면역 epitopes를 정확 하 게 우리를 허용 하는 해상도와 안티-HLA 신호 수 있었습니다. 이러한 맞춤 항 배열 장기 이식 기증자 특정 HLA epitopes의 고해상도 검출 허용.
Introduction
전 세계에 걸쳐 정기적으로 실시 하는 기관 대체 요법 수백만의 목숨을 저장 하고있다. 동안 큰 번호 아직도 대기에 기증자 기관 (기관에 의해 제공 된 정보에 따르면 공급의 심각한 부족으로 인해 받을 수 단단한 장기 이식, 매년 미국에서 백만 명 당 약 100 환자에서 발생 조달과 이식 네트워크-OPTN/UNOS: optn.transplant.hrsa.gov). 장기 이식 기관 낭비 하 고, 생명을 구할 높은 규제는 하지만 이러한 규정을 알려 하는 데 사용 하는 과학적인 도구 효과에서 제한 됩니다. 예를 들어, 과학계는 완전히 HLA 분자의 높은 다형 상태를 인식 하 고 고해상도 입력 하 고 (SBT) 입력 시퀀스 기반을 사용 하 여 DNA의 정확한 유전 테스트 최근 몇 년 동안1, 에서 개발 되었습니다 그러나 2., alloantibody 검사 방법 아직 되지 않은 항 원 조사로 개별 HLA 시퀀스의 광대 한 다양 한 생산할 수 있게. 현재는 불변 패널을 사용 하는 표준 시험 ~ 100 유전자 항 원 HLA의 일반적인 이체의 구성 하는의 A, B, C, DQ, DP와 박사는 인구3,4,,56시퀀스. 자주, 실제 기증자의 HLA 시퀀스에에서 포함 되지 않은 강제 이식 의사와 외과 기증자의 실제 시퀀스와 해당 “표준” 사이의 공유 유사성에 따라 기증자 특정 반응성 추론 테스트 패널에는 테스트 설정7,8. 따라서, 그것은 때로는 거부 위험 항 체 테스트 결과9,10,,1112에 따라 신뢰할 수 있는 평가 하도록 도전. 따라서, 새로운 개인적으로 alloantibodies에 대 한 사용자 정의 테스트는 긴급 하 게 필요한13,14.
HLA 유전자는 중요 한 조직 적합성 복잡 한 (MHC) 수용 체를 면역 반응6에 있는 주요 기능을 인코딩합니다. HLA 유전자 인간 게놈6의 가장 다형성 유전자 알려져 있습니다. DNA의 급속 한 발전으로 인해 시퀀싱 HLA 유전자의 새로운 유전자 변형에 대 한 전략 (또는 단순히 대립 유전자 라고 합니다)는 폭발적인 속도15,16에서 발견 되 고 있다. 3 월 2017 년까지 16,755 검증된 대립 했다 입금 되었습니다 IMGT/HLA 데이터베이스 (http://www.ebi.ac.uk/ipd/index.html)에 12,351의 클래스의 했다 내가 하 고 4,404 클래스 II 그룹의 했다. 강한 대조에서는,만 조금 100 가지 대립 유전자는 일상적으로 장기 이식에서 alloantibodies를 검색 하는 데 사용 되는 표준 단일 원 구슬 (SAB) 분석 결과에 표시 됩니다. SAB 메서드 cytometry 사용 Luminex 플랫폼을 기반으로 합니다. 이후 분석 결과 활용 생산, 작은 일괄 처리에 배치 variabilities 외 항, 불변 집합 개인 및 실험실5를 통해 튼튼하게 원으로 테스트 표준화 수 있다. 그러나,이 테스트는 특히 기증자 시퀀스는 결 석 하는 경우 기증자 대립 유전자에 대 한 구체적으로 개발 하는 모든 alloantibodies를 캡처할 수는 SAB에서 설정. 진정한 시퀀스에 따라 기증자의 항 원의 사용자 지정 생산 하는 데 필요한, 하지만 필요한 생산을 합리화 하 고 테스트 절차에 기술적도 전에 남아 있다.
우리는 최근 신장 이식 과목17의 타당성 조사에서 다른 방법론을 설명합니다. 메서드와 사전 조사에 대 한 펩 티 드 항 원은 배열 형식에 사용 후 세라 개별 과목의 이식. 각 배열이 했다 자리 합성 방법18,19,20,21,22,23 펩 티 드 항 원, 각 15 생산을 사용 하 여 사용자 지정 길이, 아미노산 완전히 기반으로 각 장기 기증자의 HLA 대립 유전자 a, B, C, DQA1, DQB1, DRB1. 자리 합성 표준 Fmoc 화학22 를 사용 하 여 셀 루 로스 멤브레인에 운영 되 고 완전 자동화 된 로봇 시스템19,21병행에서 사용자 지정 펩 티 드의 수백을 생산할 수 있다. 막 배열 스트립 및 사이클 reprobing의 여러 라운드를 견딜 수 있습니다. 우리의 회고전 연구17, 우리는 저장된 이식 antisera (즉, 이식 전후) 시계열에서 수집 된 항 원 패턴의 변화를 감지. 여기 우리는 제조, 원으로 조사 및 결과 분석 배열 디자인을 포함 하 여 워크플로에 대 한 기술 프로토콜을 설명 합니다. 메서드를 특정 선형 epitopes 이식 기증자의 HLA 분자에 대 한 alloantibodies를 감지 하는 위한 것입니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
여기서 설명 하는 자리 배열의 디자인은 이식 한 장기 기증자의 HLA 항 원에 대 한 alloantibody 특이성의 실험 연구입니다. 기존 SAB 클리닉에서 광범위 하 게 사용 분석 결과, 달리 항 배열 메서드는 개별 기증자의 진정한 HLA 시퀀스를 수용할 수 있는 유연한 디자인에 주요 이점이 있다. 곧 모호성16,27 없이 정확한 HLA 유전자 시퀀스 판독을 생산할 수 있을 것?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
우리 박사 숀 리를 감사 하 고 자리와 그들의 친절 한 도움에 대 한 캐나다의 웨스턴 대학교의 싱 리 생산 배열. 우리는 샘플 서비스를 제공 하기 위한 조직 적합성 코어와 포괄적인 이식 센터의 노스웨스턴 대학 직원에 감사. 이 작품 보조 보드 노스웨스턴 메모리얼 병원, 그리고 노스웨스턴 대학에서 제공 하는 제이를 교수 시작 기금에 의해 부분적으로 지원 되었습니다.
Materials
| Peptide array | INTAVIS Bioanalytical Instruments | ||
| Ethanol | Sigma-Aldrich | E7023 | |
| Ponceau S solution | Sigma-Aldrich | P7170 | |
| Non-fat milk | Bio Rad Laboratories | 1706404 | |
| TBST | Santa Cruz Biotechnology | 10711454001 | |
| Goat anti-human IgG–HRP | ThermoFisher Scientific | A18811 | |
| Clarity Western ECL Substrate | Bio Rad Laboratories | 1705061 | |
| Restore Western Blot Stripping Buffer | Thermo Scientifics | 21059 | |
| ChemiDoc gel imaging system | Bio Rad Laboratories | 1708265 |
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