Denne protokol beskriver hvordan man producerer retinale pigment epitel celler (ÅV) fra pluripotente stamceller. Metoden bruger en kombination af vækstfaktorer og små molekyler for at styre differentieringen af stamceller til umodne ÅV i 14 dage og modne, funktionelle ÅV efter tre måneder.
Vi beskriver en robust metode til direkte differentiering af pluripotente stamceller i retinal pigment epitel celler (ÅV). Formålet at levere en detaljeret og grundig protokol er klart vise hvert trin og at gøre dette let tilgængeligt for forskere i feltet. Denne protokol resulterer i et ensartet lag af ÅV med minimal eller ingen manuel dissektion behov. Metoden præsenteres her har vist sig at være effektiv til induceret pluripotente stamceller (iPSC) og menneskelige embryonale stamceller. Derudover beskrives metoder til kryopræservering af mellemliggende cellebanker, der tillader langtidsopbevaring. ÅV genereret ved hjælp af denne protokol kan være nyttige for iPSC sygdom i parabol modellering eller klinisk anvendelse.
Den retinale pigment epitel er en éncellelag af pigmenterede celler, der giver afgørende støtte til fotoreceptorer. Retinale pigment epitel celler (ÅV) har mange funktioner i vision, herunder lysabsorption, næringsstof og ion transport, retinoid cykling, fotoreceptor ydre segment fagocytose, og vækst faktor sekretion1. Der er en bred vifte af retinale dystrophies, der påvirker funktionen af ÅV og resulterer i et tab af synet, herunder aldersrelateret makuladegeneration og retinitis pigmentosa. Generation af ÅV fra pluripotente stamceller kan lette forskning for at forstå disse øjensygdomme, og kan give en ubegrænset kilde til ÅV til celle behandlinger2. Faktisk bruger flere kliniske forsøg undervejs ÅV afledt af pluripotente stamceller3.
Denne differentiering protokol blev oprindelig beskrevet af Buchholz4 og var baseret på den tidligere udgivne metode fra Clegg5. Proceduren, der efterligner den normale i vivo udviklingsmæssige proces direkte udifferentierede pluripotente stamceller mod en ÅV skæbne via manipulation af insulin vækstfaktor (IGF), basic fibroblast vækstfaktor (FGF-2; FGF-basic), omdanne vækst faktor beta (TGF-β) og WNT veje4,5. Protokollen blev betydeligt forbedret ved tilsætning af en WNT pathway agonist sent i den protokol, som gav 97.77% ± 0,1% pre-melanosome protein (PMEL) positive celler, og er blevet tilpasset til xeno-fri betingelser6,7. Den resulterende ÅV har vist sig at udtrykke ÅV markører på udskrift og protein niveauer, til at udskille kendte ÅV vækstfaktorer med passende polaritet, og udføre fagocytose af fotoreceptor ydre segmenter8. Denne protokol er hurtigere og mere pålidelig end “spontan” protokoller af differentiering, der involverer simple fjernelse af basic fibroblast vækstfaktor8. Derudover RNA sequencing data viser, at RPE opnået med denne protokol er meget lig dem, opnået ved hjælp af de mere almindelige spontan tilgang8. Den 14-dages metode genererer ÅV, der passer til “5 P’s” nævnt af Mazzoni9 (pigmenteret, polariseret, fagocyterende, post mitotiske, polygonale)9. Mens denne procedure har vist sig for at være reproducerbare i flere labs, ønsker vi at anerkende flere ekstra styret differentiering metoder, der er blevet offentliggjort i de seneste år10,11,12 , 13.
Denne protokol beskriver hvordan man producerer retinale pigment epitel celler fra pluripotente stamceller. Metoden blev optimeret ved hjælp af både menneskelige embryonale og inducerede pluripotente stamceller fra et feeder-fri, serum-fri kultur metode. Siden den oprindelige isolering af humane embryonale stamceller i 1998 og afledning af induceret pluripotente stamceller (iPSC) i 2007, et væld af stamceller kultur metoder har været udviklet14,15,16, 17. Disse metoder bør være tilstrækkeligt for producerende stamcelle kolonier, der er modtagelige for denne differentiering. Der er ingen kendte begrænsninger for anvendelsen af denne metode til ordentligt afledte og vedligeholdt pluripotente stamceller.
De mest kritiske trin er passaging af stamceller til dag 0 af differentiering (trin 2,5) og potentielle behovet for manuel dissektion på dag 14 af processen (trin 4.5). Når picking fjerne differentierede celler fra stamceller kolonier, henvise til billeder i Kent18. Som anført, angive de fibroblastic celler mellem kolonierne og de uigennemsigtige celler i kolonier differentierede celler, der skal fjernes, før du begynder denne protokol18. Kun udifferentierede, tætpakkede kolonier med definerede kanter skal være passaged for differentiering.
Antallet af stamceller seedede pr. brønd (trin 2.6.7) kompliceres af, at stamcellerne kan ikke være triturated i en enkelt cellesuspension ved passage og præcist kan ikke medregnes ved hjælp af en hemocytometer. Tilnærmelse af 80% sammenflydende stamceller er indiceret til passaging 1 godt af en 6-godt plade i 4 brønde i en 12-godt plade. Forskelle mellem stamcellelinjer, såsom vækst, kan påvirke, hvor hurtigt de umodne ÅV nå sammenløbet mellem dage 0 til 4. Stamcellerne vil producere ÅV uanset præcise sammenløbet, men celle udbytte vil blive negativt påvirket, hvis cellerne er alt for sparsomme i denne fase. De umodne ÅV celler skal være ca 40-50% sammenflydende på dag 1 og næsten 100% sammenflydende dagen 4. Hvis cellerne ikke producerer en sammenflydende éncellelag af dag 4 eller 6, bør protokollen gentages på et højere seeding tæthed på dag 0. For eksempel, hvis 1 godt af en 6-godt plade var passaged til 4 huller i en 12-godt pladen på dag 0 og den umodne ÅV er ikke 100% sammenflydende på dag 4, reducere Seedning til en 1:3 eller 1:2 passage på dag 0 eller tillade stamceller til at blive mere sammenflydende før passaging. Det er afgørende at etablere en ensartet såning tæthed, når man sammenligner flere cellelinjer.
Manuel dissektion skridt på dag 14 er kun nødvendige, når ikke-ÅV celler er til stede i kulturen (figur 2 c). Da tilsætning af CHIR99021 til protokollen kræver mange pluripotente stamcellelinjer lidt at ingen manuel dissektion. Nogle præparater har en højere forekomst af neurale patches og det er afgørende at fjerne disse celler. Hvis ÅV ikke er levedygtig på passage 0 gennem passage 3, er det muligt at gentage differentiering protokollen tager tilstrækkelig tid til at fjerne alle ikke-ÅV celler. Det sker ikke ofte, men det er nævnt her for at bemærke, at trinnet dissektion dag 14 kan optimeres, når det er nødvendigt.
Der er en bred vifte af ÅV differentiering protokoller, der varierer i pris såvel som kultur metoder, effektivitet, kvantificering og funktionel vurdering, hvor sidstnævnte har været gennemgået grundigt2. Vi foretrækker den 14-dages metode detaljeret her på grund af dens effektivitet, tilpasningsevne og anvendelighed til en bred vifte af celle linjer4,7,8. Kryopræservering skridt i denne protokol giver også en stor fordel i at skabe en mellemliggende celle bank til fremtidig brug, undgå lot-for-lot variabilitet i eksperimenter. Starter med kun 4 brønde i en 12-godt plade, er det muligt at udvide i 6-godt plader på passage 0 og T75 kolber på passage 1 og 2. På passage 2 dag 3-5, når cellerne er stadig subconfluent og ikke har genvundet pigment, er det muligt at cryopreserve millioner af celler og derefter optø den modne ÅV, udpeget passage 3 dag 30, kontrollere RNA udtryk, protein udtryk, vækst faktor sekretion, fagocytose, osv. Vi har også etableret protokoller for at udvide ÅV for op til 13 passager 19.
Rettes blikket fremad, vil denne metode være nyttigt for iPSC modellering af okulær sygdomme og for generation af ÅV til cellulære terapi. Med hensyn til iPSC sygdom modellering anvendes denne protokol i øjeblikket i laboratoriet til at producere ÅV fra CRISPR-korrigeret linjer med ikke-korrigeret kontrol fra den samme patient. Denne protokol er desuden tilpasses syntetiske substrater og xeno-fri betingelser, der er nyttige for at overholde god fremstillingsmæssig praksis kræves for en cellulær terapi.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde blev støttet af Garland initiativ for Vision, California Institute for regenerativ medicin (CIRM, grants DR1-01444, CL1-00521, TB1-01177, FA1-00616 og TG2-01151), The Vermont Fællesskabet Foundation, The Breaux Foundation, og den Foundation Fighting blindhed Wynn-Gund Translationel forskning Acceleration Program.
SterilGARD III laminar flow biosafety cabinet | Baker | model: SG603A-HE, type: A2, class: 2 | 6' Baker laminar flow biosafety cabinet |
Dissection Hood | Labconco | Model 3970405 | laminar flow bench top |
dissecting microscope | Nikon | SMZ 1500 | heated stage |
air-jacketed CO2 incubator | Sanyo | MCO-17AIC | 37 oC and 5% CO2 |
inverted phase contrast microscope | Olympus | IX53 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Media Components | |||
DMEM/F12 | Gibco | 10565042 | |
N2 Supplement | Gibco | 17502048 | |
B27 Supplement | Gibco | 17504044 | |
NEAA | Gibco | 11140050 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Growth Factors and Reagents | |||
Nicotinamide | Sigma | N0636 | |
Recombinant mouse noggin | R&D systems | 1967-NG-025 | |
Recombinant human DKK-1 | R&D systems | 5439-DK-010 | |
Recombinant IGF-1 | R&D systems | 291-G1-200 | |
FGF-basic | Peprotech | 100-18B | |
Recombinant human/mouse/rat Activin A | Peprotech | 120-14E | |
SU5402 FGF inhibitor | Santa Cruz Biotechnology | sc-204308 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Substrates | |||
Matrigel Basement Membrane Matrix, Phenol Red-Free, LDEV-Free | Corning | 356237 | extracellular matrix-based hydrogel (ECMH) |
Matrigel hESC-Qualified Matrix, LDEV-Free | Corning | 354277 | growth factor reduced ECMH |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Other reagents | |||
1X Versene (EDTA) | Gibco | 15040066 | |
DPBS | Gibco | 14190250 | |
1X PBS (no calcium, no magnesium) | Gibco | 10010023 | |
TrypLE (trypsin-like dissociation enzyme, TDE) | Gibco | 12563011 | |
X-VIVO 10 (RPE supporting medium) | Lonza | BW04-743Q | |
Y-27632 | Tocris | 12-541-0 (1254) | |
CryoStor CS10 | BioLife Solutions | 210102 | cryopreservation medium |
1.2 mL Cryogenic Vial | Corning | 430487 | |
Mr. Frosty (freezing container) | Nalgene | 5100-0001 | freezing container |
Normocin | Invivogen | ant-nr-2 | antimicrobial reagent |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Other Equipment | |||
Pipet-aid | Drummond | 4-000-101 | |
12-well culture plate | Corning | CLS3516 | Used during differentiation. |
T75 flask | Corning | 430641 | Used during RPE maturation. |
6-well culture plate | Corning | CLS3513 | Used during RPE maturation. |
cell scraper | Corning | 08-771-1A | Used during passages. |
cell strainer | Falcon | 352340 | Used during passages before cell count. |