JoVE Journal > Developmental Biology
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Resultados
Discussion
Declarações
Acknowledgements
Materials
Referências
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Biologia do Desenvolvimento

Визуализация Multiciliated клетки в Zebrafish через комбинированные протокола вся гора флуоресцентные в Situ Гибридизация и иммунофлуоресценции

Published: November 18, 2017
doi:
10.3791/56261
, , , ,
1Department of Biological Sciences,University of Notre Dame

Summary

Реснички развития имеет жизненно важное значение для надлежащего органогенеза. Этот протокол описывает оптимизированный метод для обозначения и визуализировать клетки мерцательного данио рерио.

Abstract

В последние годы zebrafish эмбриона стала популярная модель для изучения биологии развития из-за черты как ex внутриутробное развитие эмбриона и оптической прозрачности. В частности zebrafish эмбриона стал важным организма к изучению органогенеза позвоночных почек, а также развития multiciliated клеток (MCC). Чтобы визуализировать ЦУП в почках эмбриональных данио рерио, мы разработали комбинированный протокол целом гора флуоресцентные, в situ гибридизация (рыба) и всего смонтировать иммунофлюоресценции (КРП), которая обеспечивает высокое разрешение изображения. Эта рукопись описывает нашу технику для совместного локализации стенограммы РНК и белков как инструмент лучше понять регулирование развития программ через выражение различных факторов линии.

Introduction

За последние несколько десятилетий данио рерио (Danio рерио) стала основной модельный организм для изучения биологии развития. Эмбрионы развиваться вне матери и оптически прозрачны. Кроме того формирование жизненно важных органов, таких, как глаз, почек и мозга происходит быстро, с структурами, формируется только 24 h пост оплодотворение (hpf). Важно отметить, что геном данио рерио высоко сохраняется с млекопитающих1,2,3. Кроме того данио рерио и млекопитающих органы имеют аналогичные анатомии и физиологии. Данио рерио эмбриональных почек или Пронефрос, демонстрирует значение модель системы для изучения функции гена во время ранних nephrogenesis и судьба Определение сохраненных эпителиальных клеточных популяций позвоночных нефрон4, 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10. Аналогичным образом, zebrafish эмбриона приобретает все большее значение в изучении Онтогенез КЦС11,12,13,14,15, 16 , 17.

Как их названия, ЦУП являются эпителиальных клеток характеризуется пучок подвижные реснички, расположенный на апикальной поверхности17. В данио рерио ЦУП в поток жидкости и рассредоточены в «salt-and-pepper» как мода на протяжении в середине каждого нефрон Пронефрос 24 hpf11,12,13,14, 15 , 16 , 17. Хотя они только были отмечены в нескольких человеческая почка болезнь случаев18,19,20,21, ЦУП широко распространены в других тканей млекопитающих, таких как мозг и Трахея22,23,24, который создает целый ряд проблем для экспериментального дизайна. Элегантный исследования в различных моделях позвоночных, включая данио рерио продемонстрировали сохранение пути судьбы MCC, с насечкой, сигнальный путь как ингибитор MCC развития12,17,25 ,,2627. Таким образом данио рерио Пронефрос предоставляет модель легко доступны для изучения генетических механизмов MCC развития в vivo11,12,13,14, 15 , 16 , 17.

Прозрачность и легко генетические манипуляции zebrafish эмбриона оказалась бесценным черты при изучении генетические и молекулярные пути, которые регулируют судьбу клеток, рост тканей и развития раннего эмбриона1,2 ,3. Как такие, традиционные методы визуализировать белка и Джин стенограммы, например в situ Гибридизация и вся гора если, был применен к и оптимизирован для данио рерио16,28,29, 30,,3132,33,34,35,36,,3738. Объединив популярных протоколов для рыб и если, можно обозначить и анализировать ЦУП в естественных условиях16,28,,3738.

Protocol

Следующий протокол использует zebrafish взрослых поддерживается и позабочено для центра данио рерио исследований в Университете Нотр-Дам. Все методы для работы с данио рерио взрослых и эмбрионы были утверждены институциональный уход животных и использования Комитетом. 1. эмбриона фиксации Собирайте данио рерио эмбрионов, используя ранее описанные методы39,40. 24 hpf, добавить 500 мкл неспецифической протеазы смесь раствор (50 мг/мл) на E3 в эмбрион блюдо инкубировать при комнатной температуре (RT). После того, как эмбрионы начинают вырваться из хориона, удалите все жидкости из эмбриона блюдо. Вымойте зародыши 2 – 3 раза с свежими E3, добавив примерно 20 мл E3, нежно закрученного E3 в блюдо и затем декантирующие жидкости в жидких отходов сосуда. Чтобы усыпить эмбрионов до фиксации, добавьте 2 мл 0,2% tricaine в E3. Перенос эмбрионов в 5 мл стеклянный флакон с помощью Пластиковая пипетка Пастера. Удалите tricaine/E3 решения с помощью пипетки, после того, как эмбрионы поселились в нижней части флакона. Исправить 24 hpf эмбрионов с 5 мл 4% параформальдегида (PFA) для 2-4 ч в РТ, без агитации.Предупреждение: PFA токсичных и PFA решения должны рассматриваться под капотом химической, в то время как исследователь носить защитные очки, перчатки и лаборатории пальто. Подготовка PFA фиксатором от гранулированный порошок ПФА следует выполнять с исключительной осторожностью, как гранулированный PFA, как правило, разогнать через статический заряд.Примечание: Эмбрионы можно исправить в 4%, PFA на ночь при 4 ° C. Подготовка 4% PFA путем нагрева 1 x фосфатный буфер (PBS) до кипения, постоянно помешивая решение полностью растворить гранулированный PFA. После того, как раствор остынет обратно вниз RT, 4%, PFA-это фильтр, стерилизованные, проходя через систему одноразовые 0,45 мкм для вакуумной фильтрации, тогда и aliquoted порционно 15 мл или 50 мл для хранения при температуре-20 ° C. Удалите 4% PFA и эмбрионы мыть дважды с 1 X фосфатного буфера солевой с 0.1% Tween-20 (PBST) на RT. мыть эмбрионов один раз с 5 мл 100% метанола (метанола) на RT. добавить 5 мл свежего 100% метанола для эмбрионов и инкубировать при-20 ° C по меньшей мере 20 мин.Примечание: Эмбрионы могут храниться в 100% метанола при-20 ° C до готовности для подготовки эмбриона. 2. эмбриона подготовка и гибридизация Увлажняет эмбрионы промывкой раз в 5 мл 50% метанола в 1 x PBST за 5 мин при регидратации RT. продолжить омыв эмбрионы в 5 мл 30% метанола в 1 x PBST 5 мин на RT. мыть эмбрионы в 5 мл 1 x PBST дважды за 5 минут на RT. Разрушения эмбрионов по инкубации их в 5 мл раствора 1:1,000 протеиназы K (pK) (10 мг/мл) в 1 x PBST 2 мин на RT.Примечание: Старые эмбрионы могут инкубировали дольше, чем 2 мин в концентрации pK, приведенным выше, однако концентрацией 5 мг/мл и инкубации время менее 2 мин предлагается для эмбрионов моложе 24 hpf. Удаление решения pK и мыть сразу в 5 мл 1 x PBST дважды на RT. исправить эмбрионы в 5 мл 4% ПФА в РТ по крайней мере 20 мин.Примечание: Эмбрионы можно исправить в 4%, PFA на ночь при 4 ° C. Удаление PFA и мыть дважды в 5 мл 1 x PBST на RT. Трансфер эмбрионов в 5 мл 1 x PBST в плоское дно microcentrifuge трубки помещены вертикально в microcentrifuge стойку на RT для облегчения взаимодействия между каждого эмбриона и решения последующих гибридизации. Вымойте эмбрионов дважды в 1,5 мл раствора гибридизации (Гибнер +) на RT. Добавить 1,5 мл свежего Гибнер + и инкубировать эмбрионов при 70 ° C в гибридизации печи для 4-6 ч. Заменить 1,5 мл Гибнер + объем раствора зонд (10 мкл РНК зонд/500 мкл Гибнер +) достаточно, чтобы полностью покрыть эмбрионов.Примечание: Синтезировать antisense РНК зонд, используя ранее описанные методы39. Гибридизируйте зонд на ночь в печь гибридизации при 70 ° C с отдельных труб расположены вертикально в microcentrifuge стойку, без встряхивания. 3. Горячие моет и блокировка Примечание: Горячие моет выполняются, поставив соответствующее решение на эмбрионах и затем инкубации в печь гибридизации в 70 ° C. Чтобы сохранить моющих растворов при 70 ° C, место 50 мл трубки каждого решения в печь гибридизации когда зонд / Гибнер + смесь добавляется. Выньте зонд. Вымойте эмбрионы дважды при 70 ° C в 1,5 мл 50% формамида/2 x буфер солевой раствор натрия цитрата (SSC) для 20-30 мин.Примечание: Зонд можно хранить в Гибнер + при-20 ° C и повторно использоваться на более поздний срок. Один раз мыть эмбрионов при 70 ° C по 1,5 мл 2 x SSC 15 мин мыть эмбрионы дважды при 70 ° C в 1,5 мл 0,2 X SSC для 20-30 мин. X SSC заменить 0,2 с 1,5 мл реагента, блокировки и инкубировать на ночь при 4 ° C.Примечание: Это возможно для инкубации блокировки реагент для 4 h вместо ночлег в рт. 4. Антитело инкубации и моет буфер малеиновой кислоты Примечание: Держать эмбрионов, защищены от окружающего света. Замените 0,2 мл анти-DIG-POD в блокировки реагента в соотношении 1:1,000 блокировки реагента и Инкубируйте 3 h под фольгой или другого блокирует свет крышка на RT.Примечание: Кроме того, антитела можно инкубировать на ночь при 4 ° C. После 3 h Вымойте эмбрионы в 1,5 мл буфера малеиновой кислоты, 2 – 4 раза за 10-15 мин на RT. инкубировать эмбрионы на ночь при 4 ° C в 1,5 мл свежего малеиновой кислоты буфера.Примечание: Это не необходимо для инкубации в буфере малеиновой кислоты на ночь, но это так уменьшается зонд фон. 5. Датчик обнаружения и удаления пероксидаза Примечание: Держать эмбрионов, защищены от окружающего света. Удаление буфера малеиновой кислоты и заменить 1,5 мл ПБС. Вымойте эмбрионов дважды в 1,5 мл 1 x PBS для 5 мин каждый на RT. инкубировать эмбрионов в 0,2 мл Cy3 флуоресцентной окраски раствора для 60 мин на RT.Примечание: Время инкубации может отличаться для различных датчиков. Вымойте эмбрионов с 1,5 мл следующих % метанола в ПБС втечение 10 мин на RT: 30% метанола, 50% метанола, 75% метанола и 100% метанола. Инкубировать эмбрионов с 1,5 мл 1% H2O2 метанола для 30 мин на RT. мыть эмбрионов с 1,5 мл следующих решений метанола в однократном ПБС втечение 10 мин на RT: 75% метанола, 50% метанола и 30% метанола. Вымойте эмбрионов дважды за 5 мин на RT в 1,5 мл ПБС.Примечание: Эмбрионы можно хранить в PBS на ночь при 4° C. 6. иммунофлуоресценции Примечание: Держать эмбрионов, защищены от окружающего света. Вымойте эмбрионов в 1,5 мл ddH2O 5 мин на RT. мыть эмбрионов в 1,5 мл, предварительно охлажденный ацетона (хранятся при температуре-20 ° C) для 7 мин на RT. мыть эмбрионов один раз в 1,5 мл ddH2O 5 мин на RT. мыть эмбрионов один раз в 1,5 mL 1 x PBST с 1% ДМСО (PBDT) за 5 мин на RT. Инкубируйте эмбрионов в 1,5 мл PBDT + 10% плода бычьим сывороточным (ФБС) на рокер на RT за 2 ч. Удалить PBDT + FBS и заменить 1,5 мл первичных антител, анти ацетилированные тубулин (производятся из мыши) и анти γ-тубулина, (производится из кролика), разбавленный вместе на 1: 400 в PBDT + 1% FBS. Инкубировать эмбрионов на ночь при 4 ° C.Примечание: Время инкубации может варьироваться в зависимости от основного антитела. Тестирование различных временных интервалов могут быть необходимы для оптимизации маркировки. 7. вторичные антитела Примечание: Держать эмбрионов, защищены от окружающего света. Чтобы удалить избыток несвязанные антитела от эмбрионов, мыть в 1,5 мл PBDT + 1% FBS + 0,1 М NaCl за 1 мин на RT на рокер. Вымойте эмбрионы 5 раз в 1,5 мл PBDT + 1% FBS + 0,1 М NaCl 30 мин на рокер на RT. мыть эмбрионы в 1,5 мл PBDT + 1% FBS 30 мин на RT на рокер. Инкубировать эмбрионов на ночь при 4 ° C 200 мкл вторичных антител, Alexa 488 коза анти мыши IgG и Alexa 647 коза анти кролик IgG, разводили вместе PBDT в 1: 500. 8. DAPI пятнать Примечание: Держать эмбрионов, защищены от окружающего света. Вымойте эмбрионы быстро на RT в 1,5 мл PBDT два раза. Замените PBDT на 1,5 мл DAPI, разбавленный 1:15000 в 1 X PBST и инкубировать 15 мин на RT на рокер. Вымойте эмбрионы в 1,5 мл PDBT + 1% FBS + 0,1 М NaCl три раза в РТ за 15-20 мин. Хранение эмбрионов в 1,5 мл PBDT на 4 ° C до готовности к горе и изображения. 9. Установка и обработки изображений для данио рерио Пронефрос Бокового лежал эмбриона на стеклянное скольжение в небольшом объеме, примерно 10 мкл, PBDT. Сожмите эмбриона позади глаз с парой тонкой пинцет, чтобы удалить голову и некоторые из желтка мяч. Используйте тонкой щипцы для нежно отчищать оставшийся желток мяч от тела эмбриона. Удалите из слайда с тонкой ткани диссоциированных желток и дополнительной жидкости. Добавить каплю монтажа СМИ на оставшиеся хвост эмбриона и расположите так, чтобы хвост укладывается сбоку. Место coverslip на вершине хвост, чтобы сгладить образец, а затем поместить в поле покрыты слайд. Изображение почек ресничек на 60 X увеличением на конфокального микроскопа, используя следующие каналы: DAPI синим цветом (набор на 408.0 лазерных Нм), FITC в зеленом (набор на 488.0 лазерных Нм), Cy3 краситель помечены красным (лазерный комплекс на 561.0 Нм) и Alexa 680 в белом (лазерный комплекс на 637.0 Нм).

Representative Results

Данио рерио одичал тип эмбрионы были зафиксированы в 24 hpf и немедленно подготовлена как описано выше. Рисунок 1 изображает экспериментального процесса наряду с выбранной иллюстрированный этапов. Рабочий процесс, описанные в шагах 1-8 охватывает процессы закупок образца, фиксации и манипуляции фиксированных тканей на этикетке эндогенного стенограммы с антисмысловых riboprobes следуют иммунофлюоресценции для метки белки интерес. Шаг 9 в рабочем процессе относится монтаж и методы специально разработаны для оптимизации визуализации zebrafish эмбриона ствола визуализации. В чертежах, которые сопровождают шаг 9 мы иллюстрируем метод манипуляции для позиционирования ткани на стеклянное скольжение. В этом шаге удаляются мяч головой и желток эмбриона, оставляя хвостовое боков расположены между coverslip и стекла слайд. Удаление желток мяч и голова предлагается для лучших изображений постоянного населения MCC в Пронефрос, как мяч желток auto флуоресцирует и затрудняет процесс монтажа. Представитель изображений, полученных с помощью конфокального микроскопа предоставляются в 2 рисунок, который показывает же одичал тип эмбриона на 60 X увеличением и цифровой зум в том же масштабе. Верхней панели обеспечивают изображения каждого отдельного канала, в то время как две панели нижней являются композитные наложение этих визуализации данных. Белое поле (на изображении слева) излагаются области, которая находится в центре внимания цифровой зум (изображение справа). Подчеркивается в заключительном панели цифровой зум, ядра были помечены в DAPI, и ЦУП были обнаружены на основе антисмысловых riboprobe, предназначенных для признать odf3b, где антитела к γ-тубулина обозначают Базальные тела и α-тубулина обозначает ресничек. В цифровой зум составного оверлея Желтая пунктирная круг указывает периметра ККУ, которая была определена из-за обладание odf3b стенограммы, множественные базально органов и реснички. Моно мерцательного смежную ячейку, обозначается желтой пунктирной окружности, была определена на основании фенотип обладания одного тела базальных и одну ресничку. Рисунок 1: схема экспериментальной блок. Это блок-схема показывает процесс экспериментальной, сопровождается иллюстрациями критических этапов, в которых снежинка указывает холодной инкубации, три изогнутые линии представляют тепла и часы представляет собой длительный инкубационный раз. Рабочий процесс может выполняться как минимум 6 дней (см. день количество каждого этапа процесса в правом верхнем углу), хотя некоторые шаги могут выполняться в течение более длительных периодов времени, как отмечается в протоколе. Подробное изображение процесса монтажа вытягивается, демонстрируя окончательные монтируется эмбриона хвост между стеклянное скольжение и coverslip. Черной пунктирной коробки описаны области, отображаемого на 60 X увеличением. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры. Рисунок 2: представитель результаты для визуализации КЦС Пронефрос данио рерио. Максимальная изображения проекции 24 hpf одичал тип zebrafish эмбриона на 60 X увеличением, а также цифровой зум на конфокальный на 60 X увеличением же эмбриона. Белые прямоугольники указывают области сосредоточена на для масштабирования. Отдельные пятна DAPI (ядра) и odf3b (ЦУП), γ-тубулина (Базальные тела), α-тубулина (реснички) помечены и затем объединились в нижней две панели. В цифровой зум, мы предоставляем аппроксимации расположение ячеек следующим: MCC является предложенный пунктирной желтый круг, и точечно желтый круг излагаются моно мерцательного ячейки. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Discussion

Протокол, подробно изложенных выше оптимизирован для маркировки ЦУП в Пронефрос с odf3b стенограммы и α-тубулина в 24 hpf zebrafish эмбриона. Для достижения наилучших результатов рекомендуется использовать свежую фиксированной и подготовленных эмбрионов. Эмбрионов, которые были исправлены и хранятся в метанола или Гибнер + при-20 ° C для более чем одной недели может быть использован, но вероятность нежелательных фоновых пятнать увеличивается с течением времени, что эмбрионы находятся в хранилище.

Модификации и устранение этой техники необходимо адаптировать этот метод для других наборов конкретных маркеров, например другие антисмысловых riboprobes и других антител. Многие методы для настройки параметров шагов в процессе всей горе в situ гибридизация были ранее документально нашей группы и другие,31,34,,3638 39. Аналогичным образом каждый протеин антитела потребует некоторых неполадок с точки зрения пятнать раз и приблизительные диапазоны разведений и инкубации раз для каждого основного антитела лучше всего оцениваются путем оценки документально результаты28, 35. для эмбрионов моложе 24 hpf, pK лечение должно быть короче чем 2 мин, где эмбрионов старше 24 hpf следует относиться с ПК для более 2 мин. Кроме того, эмбрионов старше 24 hpf следует отбеленные пигмента до pK лечения.

После окрашивания с флуоресцентные окрашивание раствора, важно, чтобы удалить оставшиеся пятно, антитела и пероксидазы, выполнив серию метанола и водорода пероксид смывки. Сразу же после стирок PBS являются жизненно важными для удаления избыточного метанола из эмбрионов. Главное прежде чем продолжить если антитела, мы обнаружили, что ацетон и моет деионизированной воды делают эмбрионов менее склонны придерживаться друг друга и/или пробирок. В наш опыт, антитела для конкретных транскрипционных факторов и других генов хотя они могут эффективно работать в западных помарок, не работает хорошо для если у рыбок данио. Однако весьма сохраняется и обильные белков, таких как тубулин α и β-катенина, хорошо работают в zebrafish если16,37.

С рыбой это позволяет визуализировать РНК стенограммы генов, которые пока не имеют специфических антител в данио рерио. Сочетание рыбы, если, как свидетельствует этот протокол, Сопредседатель локализации стенограммы РНК и белка может быть увидено в vivo (рис. 2). Гибкий характер протокола позволяет быстрое устранение неполадок для визуализации различных стенограммы РНК и белков в многочисленных тканей и моменты времени. В сочетании с уже уважаемых черты zebrafish эмбриона, этот протокол рыбы + если обеспечивает еще один инструмент для изучения выражение генов и белков важные для развития пути регулирования.

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Эта работа частично поддержали Грант R01DK100237 R.A.W. и национальной науки фонд выпускников исследовательских стипендий No. DGE-1313583 для A.N.M. Мы также благодарим колледж из науки летом Undergraduate исследований программы стипендий для поддержки м.ю. Мы хотели бы поблагодарить центр данио рерио исследований в Университете Нотр-Дам их посвященный уходу за наших данио рерио. Мы хотели бы также поблагодарить Департамент биологических наук, а также члены нашей лаборатории для всех их поддержку и ценные идеи.

Materials

non-specific protease mixture solution Roche 11459643001, pronase from Streptomyces griseus Dilute in E3 without methylene blue to make 50mg/mL stock solution; store at -20°C
E3 solution Dilute 50X E3 (250 mM NaCl, 8.5 mM KCl, 16.5 mM CaCl2, 16.5 mM MgSO4 in distilled water) in distilled water; add 1 x 10-5 M methylene blue (sigma M9140) to inhibit contamination
tricaine (ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate) Fluka A5040-250G To make a 0.2% stock solution, dissolve 1 g of tricaine powder in 10 mL Tris, pH 9.5 and distilled water up to 500 mL
embryo dishes VWR 351029
5 mL glass vials Wheaton 225012
disposable plastic Pasteur pippettes VWR 414004-004
4% paraformaldehyde (PFA) solution Electron Microscopy Services 19210 Dissolve 4% PFA in 1X PBS and bring to a boil under a fume hood. Cool and aliquot, then store at -20°C. Do not refreeze once thawed for use.
10X PBS American Bioanalytical AB11072 Dilute in distilled water to make a 1X stock
Tween-20 stock American Bioanalytical AB02038 Make a 0.1% Tween-20 stock by diluting in distilled water.
1X phosphate buffered saline with 0.1% Tween 20 (PBST) Sigma P9416 0.1% Tween-20 in 1X PBS
methanol (MeOH) Sigma 34860-4L
proteinase K Roche 3115879001 Dissolve in distilled water to make a 10 mg/mL stock; aliquot and store at -20°C
flat bottom microcentrifuge tubes VWR 87003-300; 87003-298
formamide American Bioanalytical AB00600 store at -20°C
hybridization solution (HYB+) 50% formamide, 5X SSC, 0.1% Tween-20, 5 mg/mL yeast torula RNA, 50 μg/μL heparin; store at -20°C
hybridization oven Fisher Scientific 13-247-10Q
20X saline-sodium citrate (SSC) buffer solution American Bioanalytical AB13156 dilute in distilled water to make 2X and 0.2X stocks
blocking reagent solution Roche 11096176001 dilute in maleic acid buffer to make a 10% stock solution; store at 4°C
maleic acid buffer solution Sigma M0375 and S7653 150mM maleic acid, 100mM NaCl (pH 7.5)
anti-Digoxigenin-POD, Fab fragments Roche 11207739910 store at 4°C
Cy3 fluorescent staining solution PerkinElmer, Inc. NEL744001KT, TSA Plus Cyanin3 system store at 4°C; prepare staining solution fresh by making a 1:50 dilution of TSA reagent (dissolved in 60 uL of DMSO) in the kit buffer
Hydrogen peroxide (H2O2) Sigma H1009-500mL store at 4°C
molecular grade distilled water (ddH2O) Mediatech 25-055-CM
acetone American Bioanalytical AB00636-01000 store an aliquot at -20°C
DMSO American Bioanalytical AB00435-01000
fetal bovine serum (FBS) Gibco 10438-034 aliquot and store at -20°C
monoclonal anti-acetylated tubulin clone 6-11B-1 Sigma-Aldrich T6793 aliquot and store at -20°C
anti-γ-tubulin anitbody produced in rabbit Sigma-Aldrich T5192 aliquot and store at -20°C
odf3b cDNA clone MGC:63985 OpenBiosystems IMAGE:6792478 store bacterial glycerol stock at -80°C
NaCL American Bioanalytical AB01915-05000
Alexa flour 647 goat anti-rabbit IgG Life Technologies A21245 store at 4°C; protect from light
Alexa fluor 488 goat anti-mouse IgG Life Technologies A11029 store at 4°C; protect from light
DAPI Life Technologies D1306 aliquot and store at -20°C
glass slide Thermo-Fisher 4445
glass coverslip Thermo-Fisher 12-540A 18 x 18 mm
fine forceps Roboz RS-1050 Dumont Tweezers Pattern #55
mounting media Polysciences, Inc. 18606, Aqua-Poly/Mount store at 4°C
confocal microscope and associated software We use a Nikon C2plus Confocal Microscope with NIS-elements AR software
rocker Bio-Rad 1660710EDU
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Referências

  1. Lieschke, G. J., Currie, P. D. Animal models of human disease: zebrafish swim into view. Nat Rev Genet. 8, 353-367 (2007).
  2. Goldsmith, J. R., Jobin, C. Think small: zebrafish as a model system of human pathology. J Biomed Biotechnol. 2012, 817341 (2012).
  3. Howe, K., et al. The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome. Nature. 496, 498-503 (2013).
  4. Drummond, I. A. Kidney development and disease in the zebrafish. J Am Soc Nephrol. 16, 299-304 (2005).
  5. Wingert, R. A., et al. The cdx genes and retinoic acid control the positioning and segmentation of the zebrafish pronephros. PLoS Genet. 3, 1922-1938 (2007).
  6. Wingert, R. A., Davidson, A. J. The zebrafish pronephros: a model to study segmentation. Kindey Int. 73 (10), 1120-1127 (2008).
  7. Wingert, R. A., Davidson, A. J. Zebrafish nephrogenesis involves dynamic spatiotemporal expression changes in renal progenitors and essential signals from retinoic acid and irx3b. Dev Dyn. 240, 2011-2027 (2011).
  8. Chambers, B. E., Wingert, R. A. Renal progenitors: roles in kidney disease and regeneration. World J Stem Cells. 8 (11), 367-375 (2016).
  9. Drummond, B. E., Wingert, R. A. Insights into kidney stem cell development and regeneration using zebrafish. World J Stem Cells. 8 (2), 22-31 (2016).
  10. Poureetezadi, S. J., Wingert, R. A. Little fish, big catch: zebrafish as a model for kidney disease. Kidney Int. 89 (6), 1204-1210 (2016).
  11. Kramer-Zucker, A. G., Olale, F., Haycraft, C. J., Yoder, B. K., Schier, A. F., Drummond, I. A. Cilia-driven fluid flow in the zebrafish pronephros, brain and Kupffer’s vesicle is required for normal organogenesis. Development. 132, 1907-1921 (2005).
  12. Liu, Y., Narendra, P., Kramer-Zucker, A., Drummond, I. A. Notch signaling controls the differentiation of transporting epithlelia and multiciliated cells in the zebrafish pronephros. Development. 134, 1111-1122 (2007).
  13. Ma, M., Jiang, Y. J. Jagged2a-Notch signaling mediates cell fate choice in the zebrafish pronephric duct. PLoS Genetics. 3, e18 (2007).
  14. Li, Y., Cheng, C. N., Verdun, V. A., Wingert, R. A. Zebrafish nephrogenesis is regulated by interactions between retinoic acid, mecom, and Notch signaling. Dev Biol. 386 (1), 111-122 (2014).
  15. Wang, L., et al. miR-34b regulates multiciliogenesis during organ formation in zebrafish. Development. 140, 2755-2764 (2013).
  16. Marra, A. N., Wingert, R. A. Epithelial cell fate in the nephron tubule is mediated by the ETS transcription factors etv5a and etv4 during zebrafish development. Dev Biol. 411 (2), 231-245 (2016).
  17. Marra, A. N., Li, Y., Wingert, R. A. Antennas of organ morphogenesis: the roles of cilia in vertebrate kidney development. Genesis. 54 (9), 457-469 (2016).
  18. Duffy, J. L., Suzuki, Y. Ciliated human renal proximal tubular cells. Observations in three cases of hypercalcemia. Am J Pathol. 53, 609-616 (1968).
  19. Katz, S. M., Morgan, J. J. Cilia in the human kidney. Ultrastruct Pathol. 6, 285-294 (1984).
  20. Hassan, M. O., Subramanyan, S. Ciliated renal tubular cells in crescentic glomerulonephritis. Ultrastruct Pathol. 19, 201-203 (1995).
  21. Ong, A. C., Wagner, B. Detection of proximal tubular motile cilia in a patient with renal sarcoidosis associated with hypercalcemia. Am J Kidney Dis. 45, 1096-1099 (2005).
  22. Worthington, W. C., Cathcart, R. S. Ependymal cilia: distribution and activity in the adult human brain. Science. 139, 221-222 (1963).
  23. Cowan, M. J., Galdwin, M. T., Shelhamer, J. H. Disorders of ciliary motility. Am J Med Sci. 321, 3-10 (2001).
  24. Jain, R., et al. Temporal relationship between primary and motile ciliogenesis in airway epithelial cells. Am J Respir Cell Mol Biol. 43, 731-739 (2010).
  25. Stubbs, J. L., Vladar, E. K., Axlerod, J. D., Kitner, C. Multicilin promotes centriole assembly and ciliogenesis during multiciliate cell differentiation. Nat Cell Biol. 14, 140-147 (2012).
  26. Tan, F. E., et al. Myb promotes centriole amplification and later steps of the multiciliogenesis program. Development. 140, 4277-4286 (2013).
  27. Zhou, F., Narasimhan, V., Shboul, M., Chong, Y. L., Reversade, B., Roy, S. Gmnc is a master regulator of the multiciliated cell differentiation program. Curr Biol. 25, 3267-3273 (2015).
  28. Jowett, T. Analysis of Protein and gene expression. Methods Cell Biol. 59, 63-85 (1999).
  29. Schulte-Merker, S. Chapter 2: Looking at Embryos. Zebrafish: A practical approach. 261, 39-58 (2002).
  30. Brend, T., Holley, S. A. Zebrafish whole mount high-resolution double fluorescent in situ hybridization. J Vis Exp. (25), (2009).
  31. Lauter, G., Soll, I., Hauptmann, G. Two-color fluorescent in situ hybridization in the embryonic zebrafish brain using differential detection systems. BMC Dev Biol. 11, (2011).
  32. Drummond, B. E., Li, Y., Marra, A. N., Cheng, C. N., Wingert, R. A. The tbx2a/b transcription factors direct pronephros segmentation and corpuscle of Stannius formation in zebrafish. Dev Biol. 421 (1), 52-66 (2017).
  33. Jaffe, K. M., Thiberge, S. Y., Bisher, M. E., Burdine, R. D. Imaging cilia in zebrafish. Methods Cell Biol. 97, 415-435 (2010).
  34. Lauter, G., Soll, I., Hauptmann, G. Multicolor fluorescent in situ hybridization to define abutting and overlapping gene expression in the embryonic zebrafish brain. Neural Dev. 6, (2011).
  35. Sorrells, S., Toruno, C., Stewart, R. A., Jette, C. Analysis of apoptosis in zebrafish embryos by whole-mount immunofluorescence to detect activated caspase 3. J Vis Exp. (82), e51060 (2013).
  36. Schumacher, J. A., Zhao, E. J., Kofron, M. J., Sumanas, S. Two-color fluorescent in situ hybridization using chromogenic substrates in zebrafish. Bio Techniques. 57, 254-256 (2014).
  37. Julich, D., et al. beamter/deltaC and the role of Notch ligands in the zebrafish somite segmentation, hindbrain neurogenesis and hypochord differentiation. Dev Biol. 286, 391-404 (2005).
  38. Gross-Thebing, T., Paksa, A., Raz, E. Simultaneous high-resolution detection of multiple transcripts combined with localization of proteins in whole-mount embryos. BMC Biology. 12, (2014).
  39. Cheng, C. N., Li, Y., Marra, A. N., Verdun, V., Wingert, R. A. Flat Mount Preparation for Observation and Analysis of Zebrafish Embryo Specimens Stained by Whole Mount In situ Hybridization. J Vis Exp. (89), e51604 (2014).
  40. Poureetezadi, S. J., Donahue, E. K., Wingert, R. A. A Manual Small Molecule Screen Approaching High-throughput Using Zebrafish Embryos. J Vis Exp. (93), e52063 (2014).

Tags

Multiciliated CellsZebrafishWhole Mount Fluorescent In Situ HybridizationImmunofluorescenceBiologia do DesenvolvimentoPronephrosCiliaRNA TranscriptsProtein LabelingAntibodiesFixationRehydrationProteinase KHybridization SolutionRNA Probe

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citar este artigo
Marra, A. N., Ulrich, M., White, A., Springer, M., Wingert, R. A. Visualizing Multiciliated Cells in the Zebrafish Through a Combined Protocol of Whole Mount Fluorescent In Situ Hybridization and Immunofluorescence. J. Vis. Exp. (129), e56261, doi:10.3791/56261 (2017).
Baixar citação
Reimpressões e Permissões

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image