Метод оценки Fc опосредованной эффекторных функций, вызванных гриппа гемагглютинин специфические антитела
Summary
Мы описываем метод измерения активации Fc опосредованной эффекторных функций антителами, предназначенных гемагглютинина вируса гриппа. Этот assay также может быть адаптирована для оценки способности моноклональных антител или поликлональных сыворотки против других вирусных поверхностных гликопротеинов побудить Fc опосредованный иммунитет.
Abstract
Антитела играют решающую роль в муфты врожденного и адаптивного иммунного ответа против вирусных патогенов через их антиген связывания доменов и Fc регионы. Здесь мы опишем, как измерить активации ФК эффекторных функций моноклональные антитела против гемагглютинина вируса гриппа с использованием генетически Jurkat клеточной линии, выразив активации типа 1 Fc-с помощью этого метода, FcγR. вклад специфических взаимодействий Fc-FcγR, предоставленных иммуноглобулины могут быть определены с помощью assay в пробирке .
Introduction
Иммунитет, предоставляемый вакцины против сезонного гриппа традиционно были оценены гемагглютинации ингибирование (HI) пробирного1, который измеряет наличие антител, которые целевой сайт связывания рецептора гемагглютинина. Эти Привет активные антитела могут наделять стерилизации иммунитет, но обычно узкие в их масштабы защиты, предоставляя иммунитет к только выбрать несколько штаммов вируса гриппа. Выделение и характеристика широко реактивной моноклональных антител, которые признают гемагглютинина (HA) предлагаю развития универсальной вакцины от гриппа в пределах досягаемости2,3,4, 5 , 6 , 7 , 8. одной из основных целей универсальной вакцины от гриппа является сильным антител ответ к сохраняемой регионах гриппа вирус9,10,11,12 , 13 , 14 , 15 , 16. широко реактивной антитела, которые признают эти сохранены epitopes, состоящий из нейтрализовать и не нейтрализуя антитела17,18было показано требуют взаимодействия Fc-FcγR для оптимального защита в естественных условиях и выделить вклад Fc опосредованный иммунитет на общий иммунный ответ на гриппа вирус19,20.
Коррелляты защиты играют решающую роль в оценке иммунитет к инфекции. Эти метрики позволяют ученых и клиницистов, для оценки эффективности вакцин, значение данных и курс лечения. Только установленные коррелятом защиты от инфекции вируса гриппа является пробирного торможение гемагглютинации. Титр 1:40 ассоциируется со снижением риска болезни1,21 – 50% и отражает наличие антител, которые препятствуют склеиванию путем привязки сайта, расположенный на шаровых голову HA рецептора. Однако следует также отметить, что Т-клеток ответов может быть лучше коррелируют защиты от инфекции вируса гриппа в пожилом возрасте. Интересно, что недавний доклад свидетельствует о том, что нейраминидазы ингибирование активности может быть лучше предсказатель иммунитета к гриппа22. К счастью типичных в vitro assays такие, как нейтрализация или нейраминидазы ингибирование анализов можно измерить ха стебель или нейраминидазы специфических антител. Однако, большинство этих обычных в vitro анализов, только принимать во внимание функции регионе связывания антигена антитела и не измерить роль региона Fc. Кроме того вклад-нейтрализующих антител, которые защитить через Fc рецептор участия в естественных условиях , не обнаруженных17,18. Для того чтобы измерить защиты, обеспечиваемой антител, которые индуцируют Fc опосредованный иммунитет как зависимые ячейки при посредничестве цитотоксичности антител (ADCC), необходим надежный в vitro пробирного.
Описанный ниже метод оценивает способность мышиных моноклональных антител побудить Fc опосредованной функций с использованием генетически модифицированных линия клетки Jurkat, выразив активации мышиных типа 1 FcR, FcγRIV. Антитело участие FcγR передает, внутриклеточная сигнализация ядерный фактор что триггеры активированные Т-клетки опосредованной Люцифераза деятельности. Assay имеет ряд преимуществ над традиционными методами, которые требуют изоляции и культуры основных эффекторных клеток и использования проточной цитометрии для выявления активации Fc опосредованной эффекторных функций19,23,24 25, ,26. Во-первых протокол, описанные здесь может быть легко адаптирована для включения различных вирусных цели, FcγRs и антитела от разных видов (человека и мышиных). Во-вторых использование модифицированных клеток Jurkat линия, выражая, FcγR с Люцифераза Репортер ген под ядерный фактор активированные Т-клеток (NFAT) позволяет для assay большого формата, который может быть легко проанализирован с помощью пластины читатель измерения люминесценции. Здесь традиционной активации основного эффекторных клеток заменяется индукции NFAT-Люцифераза на антитела участие FcγR на поверхности клетки Jurkat. Этот assay формат 96-луночных пластина позволяет для измерения до четырех различных образцов в triplicates с семи разведения – количество выборок, которые могли бы быть громоздким, с использованием традиционных методов. Есть дополнительные очки рассмотреть этот assay, которые могут повлиять на дизайн экспериментов и интерпретации данных. Вирусная цели должны быть выражены на поверхности клеток, в порядке признания антитела. Чтобы избежать этого, целевой антиген (например внутренних вирусного белка) могут наноситься непосредственно на поверхности плиты. Однако это не еще не протестирована тщательно. Кроме того изменение линии клетки Jurkat выражает только один тип активации FcγR и не выразить любой тормозной FcγRs, в то время как главной ячейки линии Экспресс всех рецепторов в физиологических условиях.
Ранее мы использовали этот assay продемонстрировать что epitope специфики в рамках поликлональных играет решающую роль в регулировании Fc опосредованной эффекторных функций и оптимального активации антител зависимых клеточный ответ требует две точки контакт2827,. Здесь мы описываем метод, который оценивает способность стебель специфических моноклональных антител и активировать Мурина, активация FcγRIV. Хотя есть исключения29,30, большое количество широко реактивной антител целевых регионе антигенно сохранены стебель гемагглютинин и таким образом играют важную роль в развитии всеобщего гриппа вакцина.
Protocol
Representative Results
Discussion
Метод, описанный здесь позволяет измерить ха специфических моноклональных антител способность привлекать мышиных FcγRIV. Цель антигена, гемагглютинина вируса гриппа, выражается на поверхности клеток после заражения вирусом или трансфекции плазмидной ДНК. Assay далее поддается с использо…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Этот проект частично финансируется с федеральных средств от национального института аллергии и инфекционных болезней, национальные институты здравоохранения, Департамент здравоохранения и социальных служб, под CEIRS договора P01AI097092-04S1 (P.E.L.).
Materials
| A549 cells | ATCC | CCL-185 | Adenocarcinomic human alveolar basal epithelial cells |
| HEK 293T cells | ATCC | CRL-3216 | Human embryonic kidney cells |
| Lipofectamine 2000 | Life Technologies | 11668019 | Transfection reagent |
| 1X Opti-MEM Reduced Serum Medium | ThermoFisher Scientific | 51985-034 | |
| White tissue culture treated 96-well plate | Corning, Inc. | 3917 | Assay plates |
| 10X MEM | Gibco | 11430-030 | |
| Jurkat cell expressing murine FcgRIV | Promega | M1201 | Kit provides includes cells, Bio-Glo Luciferase assay system, 1X RPMI and low IgG serum |
| Jurkat cell expressing human FcgRIIIa | Promega | G7010 | Kit provides includes cells, Bio-Glo Luciferase assay system, 1X RPMI and low IgG serum |
| Jurkat cell expressing human FcgRIIa | Promega | G9901 | Kit provides includes cells, Bio-Glo Luciferase assay system, 1X RPMI and low IgG serum |
| Luminometer | BioTek | Synergy H1 Multi-Mode reader | Luminescence plate reader |
| Bio-Glo Luciferase Assay System | Promega | G7940 | Contains luciferase assay buffer and luciferase assay substrate |
| Madin Darby canine kidney cells | ATCC | CCL-34 | Canine kidney cells |
Referências
- Hobson, D., Curry, R. L., Beare, A. S., Ward-Gardner, A. The role of serum haemagglutination-inhibiting antibody in protection against challenge infection with influenza A2 and B viruses. J Hygiene. 70 (04), 767-777 (1972).
- Throsby, M., et al. Heterosubtypic neutralizing monoclonal antibodies cross-protective against H5N1 and H1N1 recovered from human IgM+ memory B cells. PloS One. 3 (12), e3942 (2008).
- Ekiert, D. C., et al. Antibody recognition of a highly conserved influenza virus epitope. Science. 324 (5924), 246-251 (2009).
- Ekiert, D. C., et al. A Highly Conserved Neutralizing Epitope on Group 2 Influenza A Viruses. Science. 333 (6044), 843-850 (2011).
- Tan, G. S., et al. A pan-H1 anti-hemagglutinin monoclonal antibody with potent broad-spectrum efficacy in vivo. J Virol. 86 (11), 6179-6188 (2012).
- Tan, G. S., et al. Characterization of a Broadly Neutralizing Monoclonal Antibody That Targets the Fusion Domain of Group 2 Influenza A Virus Hemagglutinin. J Virol. 88 (23), 13580-13592 (2014).
- Friesen, R. H. E., et al. A common solution to group 2 influenza virus neutralization. PNAS. 111 (1), 445-450 (2014).
- Dreyfus, C., et al. Highly Conserved Protective Epitopes on Influenza B Viruses. Science. 337 (6100), 1343-1348 (2012).
- Krammer, F., Palese, P., Steel, J. Advances in Universal Influenza Virus Vaccine Design and Antibody Mediated Therapies Based on Conserved Regions of the Hemagglutinin. Curr Top Microb and Immunol. , (2014).
- Impagliazzo, A., et al. A stable trimeric influenza hemagglutinin stem as a broadly protective immunogen. Science. , (2015).
- Nachbagauer, R., Krammer, F. Clinical Microbiology and Infection. Clin Microb Infect. , 1-7 (2017).
- Krammer, F. Novel universal influenza virus vaccine approaches. Current opinion in virology. 17, 95 (2016).
- Steel, J., et al. Influenza virus vaccine based on the conserved hemagglutinin stalk domain. mBio. 1 (1), (2010).
- Krammer, F., Pica, N., Hai, R., Margine, I., Palese, P. Chimeric hemagglutinin influenza virus vaccine constructs elicit broadly protective stalk-specific antibodies. J Virol. 87 (12), 6542-6550 (2013).
- Krammer, F., Pica, N., Hai, R., Tan, G. S., Palese, P. Hemagglutinin Stalk-Reactive Antibodies Are Boosted following Sequential Infection with Seasonal and Pandemic H1N1 Influenza Virus in Mice. J Virol. 86 (19), 10302-10307 (2012).
- Hai, R., et al. Influenza viruses expressing chimeric hemagglutinins: globular head and stalk domains derived from different subtypes. J Virol. 86 (10), 5774-5781 (2012).
- Dunand, C. J. H., et al. Both Neutralizing and Non-Neutralizing Human H7N9 Influenza Vaccine-Induced Monoclonal Antibodies Confer Protection. Cell Host and Microbe. 19 (6), 800-813 (2016).
- Tan, G. S., et al. Broadly-Reactive Neutralizing and Non-neutralizing Antibodies Directed against the H7 Influenza Virus Hemagglutinin Reveal Divergent Mechanisms of Protection. PLoS Path. 12 (4), e1005578 (2016).
- DiLillo, D. J., Tan, G. S., Palese, P., Ravetch, J. V. Broadly neutralizing hemagglutinin stalk-specific antibodies require FcγR interactions for protection against influenza virus in vivo. Nat Med. 20 (2), 143-151 (2014).
- DiLillo, D. J., Palese, P., Wilson, P. C., Ravetch, J. V. Broadly neutralizing anti-influenza antibodies require Fc receptor engagement for in vivo protection. J Clin Invest. 126 (2), 605-610 (2016).
- Potter, C. W., Oxford, J. S. Determinants of immunity to influenza infection in man. Brit Med Bull. 35 (1), 69-75 (1979).
- Memoli, M. J., et al. Evaluation of Antihemagglutinin and Antineuraminidase Antibodies as Correlates of Protection in an Influenza A/H1N1 Virus Healthy Human Challenge Model. mBio. 7 (2), e00417 (2016).
- Jegaskanda, S., et al. Age-associated cross-reactive antibody-dependent cellular cytotoxicity toward 2009 pandemic influenza A virus subtype H1N1. J Infect Dis. 208 (7), 1051-1061 (2013).
- Jegaskanda, S., et al. Cross-Reactive Influenza-Specific Antibody-Dependent Cellular Cytotoxicity Antibodies in the Absence of Neutralizing Antibodies. J Immunol. 190 (4), 1837-1848 (2013).
- Jegaskanda, S., Wheatley, A. K., Kent, S. J. ScienceDirectAntibody-dependent cellular cytotoxicity and influenza virus. Curr Opin Virol. 22 (C), 89-96 (2017).
- Srivastava, V., et al. Identification of Dominant Antibody-Dependent Cell-Mediated Cytotoxicity Epitopes on the Hemagglutinin Antigen of Pandemic H1N1 Influenza Virus. J Virol. 87 (10), 5831-5840 (2013).
- He, W., et al. Epitope specificity plays a critical role in regulating antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity against influenza A virus. PNAS. 113 (42), 11931-11936 (2016).
- Leon, P. E., et al. Optimal activation of Fc-mediated effector functions by influenza virus hemagglutinin antibodies requires two points of contact. PNAS. , 201613225 (2016).
- Benjamin, E., et al. A Broadly Neutralizing Human Monoclonal Antibody Directed against a Novel Conserved Epitope on the Influenza Virus H3 Hemagglutinin Globular Head. J Virol. 88 (12), 6743-6750 (2014).
- Ekiert, D. C., Kashyap, A. K., et al. Cross-neutralization of influenza A viruses mediated by a single antibody loop. Nature. 488 (7417), 526-532 (2013).
- He, W., et al. Broadly Neutralizing Anti-Influenza Virus Antibodies: Enhancement of Neutralizing Potency in Polyclonal Mixtures and IgA Backbones. J Virol. 89 (7), 3610 (2015).
- Kristensen, A. B., et al. Antibody Responses with Fc-Mediated Functions after Vaccination of HIV-Infected Subjects with Trivalent Influenza Vaccine. J Virol. 90 (12), 5724-5734 (2016).
- Greenberg, S. B., Criswell, B. S., Six, H. R., Couch, R. B. Lymphocyte cytotoxicity to influenza virus-infected cells. II. Requirement for antibody and non-T lymphocytes. J Immunol (Baltimore, Md. : 1950). 119 (6), 2100-2106 (1977).
- Corrales-Aguilar, E., Trilling, M., et al. A novel assay for detecting virus-specific antibodies triggering activation of Fcγ receptors. J Immunol Meth. 387 (1-2), 21-35 (2013).
- de Vries, R. D., et al. Influenza virus-specific antibody dependent cellular cytoxicity induced by vaccination or natural infection. Vaccine. 35 (2), 238-247 (2017).
- Cheng, Z., et al. Development of a robust reporter-based ADCC assay with frozen, thaw-and-use cells to measure Fc effector function of therapeutic antibodies. J Immunol Meth. 414 (1), 69-81 (2014).
