Régénération des microélectrodes or rangés, équipé d’un analyseur de cellule en temps réel
Summary
Ce protocole décrit une stratégie générale pour régénérer des microélectrodes or déployèrent commerciales équipés pour un analyseur de cellules libres étiquette visant à économiser sur les haute marche frais ofmicrochip analyses. Le processus de régénération comprend la digestion trypsique, lavage à l’éthanol et l’eau et une étape de filature, ce qui permet une utilisation répétée des micropuces.
Abstract
Le test de base de cellules exempt d’étiquette est avantageux pour étude biochimique à cause de cela ne nécessite pas l’utilisation des animaux d’expérimentation. En raison de sa capacité à fournir des informations plus dynamiques sur les cellules dans des conditions physiologiques que les tests biochimiques classiques, cette analyse de cellules exempt d’étiquette en temps réel basée sur le principe de l’impédance électrique est d’attirer plus d’attention au cours des dernières décennie. Toutefois, son utilisation pratique peut être limitée en raison du coût relativement coûteux de la mesure, où coûteux consommables jetables or micropuces sont utilisés pour l’analyseur de la cellule. Dans ce protocole, nous avons développé une stratégie générale pour régénérer déployèrent microélectrodes or équipés d’un analyseur de commercial cellule exempte d’étiquette. Le processus de régénération comprend la digestion trypsique, lavage à l’éthanol et l’eau et une étape de filature. La méthode proposée a été testée et démontrée son efficacité pour la régénération et l’utilisation répétée des plaques électroniques commerciaux au moins trois fois, qui aidera les chercheurs enregistrer sur la cherté en cours d’exécution des essais sur des cellules en temps réel.
Introduction
Grâce à son efficace et moins fastidieux processus d’expérimentation, technologie exempte d’étiquette sur les cellules a connu une croissance rapide ces dix dernières années à des fins analytiques ainsi que la projection comme dans l’aspect de la protéomique1,2 , livraison3, etc.4,5 comparé avec des méthodes biochimiques traditionnelles visant à l’analyse cellulaire, analyse de cellules libres étiquette en temps réel avec le prototype développé par Giaever et collaborateurs précédemment6 de drogue est basé sur le principe de l’enregistrement des modifications du signal électrique sur la surface de la cellule-attachée puces électroniques, qui permettent une mesure continue de la croissance cellulaire ou de migration de manière quantitative. Suite à cette stratégie, une cellule en temps réel (RT-CES) système utilisant le principe de détection impédance électrique était introduite7,8 et, plus récemment, un analyseur commercial cellule en temps réel (RTCA) de détection électronique a été lancée laboratoire de recherche9.
L’analyseur de la cellule en temps réel commercial principalement lit les signaux évoqués LiPo de l’impédance électrique, entraînant des changements physiologiques des cellules couvés, y compris la prolifération cellulaire, migration, viabilité, la morphologie et l’adhérence sur le surface de micropuces10,11. Ces signaux électriques est également convertis par l’analyseur dans un paramètre sans dimension nommé la cellule Index (CI) pour évaluer l’état de la cellule. Le changement de l’impédance des micropuces reflète principalement l’environnement ionique des cellules couvertes à l’interface électrode/solution. Par conséquent, les performances analytiques de l’analyseur de cellules s’appuie fortement sur l’unité de détection de base, les micropuces jetables(p. ex., ce qu’on appelle plaques électroniques, par exemple, 96/16/8 puits), qui sont faites de microélectrodes or rangés lithographically imprimé au bas du puits de l’incubation. Des microélectrodes or assemblent sous forme de cercle en ligne (Figure 1) et couvrent la majeure partie de la surface des puits d’incubation, qui permettent une détection dynamique et sensible de cellules attachées3,12,13 ,,14. Le CI augmentera dans le cas de couverture plus de la surface des cellules sur la puce et diminue lorsque les cellules sont exposées à un substance toxique, aboutissant à l’apoptose. Bien que l’analyseur en temps réel cellulaire a été fréquemment utilisé pour déterminer la cytotoxicité11 et neurotoxicité15 et fournir plus d’informations cinétiques que la méthode classique de points de terminaison, les plaques électroniques jetables sont les plus coûteuses consommable.
Jusqu’à présent, il n’y a eu aucune méthodes disponibles pour la régénération de la plaque électronique, qui est probablement dû au fait que des conditions de régénération dure, comme solution de piranha ou acide acétique sont impliqués16,17, 18, qui peuvent altérer l’État électrique de puces or. Par conséquent, une méthode douce et efficace pour enlever les cellules adhérentes et autres substances de la surface des puces or sera souhaitable pour le processus de régénération de la plaque électronique. Nous avons récemment mis au point un protocole visant à la régénération des plaques électroniques jetables, utilisant des réactifs non corrosifs et les puces régénérées sont caractérisés par des méthodes électrochimiques ainsi qu’optique19. En utilisant des réactifs de laboratoire facilement disponible et modérée comme la trypsine et éthanol, nous avons établi une méthode générale pour régénérer la plaquette commerciale électronique sans entraîner d’effets indésirables, qui est appliquée avec succès pour régénérer les deux principaux types de la plaque électronique (16 et L8) utilisé pour RTCA.
Protocol
Representative Results
Discussion
Nous avons résumé plusieurs méthodes disponibles17,23,24,25,26 pour régénérer les micropuces dans le tableau 1. Fondamentalement, ces méthodes impliqués relativement rudes conditions expérimentales pour atteindre la régénération complète de puces à cause de la présence d’interactions molécules molécule forte telle que celle …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Le travail a été soutenu par Natural Science Fondation nationale de Chine (U1703118), un projet financé par le fonds ouverts de la clé de l’état de priorité académique programme développement de Jiangsu Higher Education Institutions (PAPD), Jiangsu Shuangchuang programme Laboratoire de chimio/biodétection et chimiométrie (2016015) et le Laboratoire National de Biomacromolecules (2017kf05), professeur de Jiangsu Specially-Appointed projet, Chine.
Materials
| Rat: Sprague-Dawley | Charles River | Cat# 400 | |
| mouse anti-rat CD11b monoclonal (clone OX42) | Bio-Rad | Cat# MCA275R | Panning: 1:1,000; Staining: 1:500 |
| Goat polycolonal anti-Iba1 | Abcam | Cat# AB5076 | Staining: 1:500 |
| Rabbit polyclonal anti-Ki67 | Abcam | Cat# AB15580 | Staining: 1:500 |
| Alexa Fluor Donkey anti-mouse 594 | Invitrogen | Cat# 11055 | Staining: 1:500 |
| Alexa Fluor Donkey anti-goat 488 | Invitrogen | Cat# A-21203 | Staining: 1:500 |
| Alexa Fluor Donkey anti-Rabbit 647 | Invitrogen | Cat# A-31573 | Staining: 1:500 |
| Triton-X (detergent in ICC staining) | Thermo Fisher | Cat# 28313 | |
| Heparan sulfate | Galen Laboratory Supplies | Cat# GAG-HS01 | |
| Heparin | Sigma | Cat# M3149 | |
| Peptone from milk solids | Sigma | Cat# P6838 | |
| TGF-β2 | Peprotech | Cat# 100-35B | |
| Murine IL-34 | R&D Systems | Cat# 5195-ML/CF | |
| Ovine wool cholesterol | Avanti Polar Lipids | Cat# 700000P | |
| Collagen IV | Corning | Cat# 354233 | |
| Oleic acid | Cayman Chemicals | Cat# 90260 | |
| 11(Z)Eicosadienoic (Gondoic) Acid | Cayman Chemicals | Cat# 20606 | |
| Calcein AM dye | Invitrogen | Cat# C3100MP | |
| Ethidium homodimer-1 | Invitrogen | Cat# E1169 | |
| DNaseI | Worthington | Cat# DPRFS | |
| Percoll PLUS | GE Healthcare | Cat# 17-5445-02 | |
| Trypsin | Sigma | Cat# T9935 | |
| DMEM/F12 | Gibco | Cat# 21041-02 | |
| Penicillin/ Streptomycin | Gibco | Cat# 15140-122 | |
| Glutamine | Gibco | Cat# 25030-081 | |
| N-acetyl cysteine | Sigma | Cat# A9165 | |
| Insulin | Sigma | Cat# 16634 | |
| Apo-transferrin | Sigma | Cat# T1147 | |
| Sodium selenite | Sigma | Cat# S-5261 | |
| DMEM (high glucose) | Gibco | Cat# 11960-044 | |
| Dapi Fluoromount-G | Southern Biotech | Cat# 0100-20 | |
| Poly-D-Lysine | Sigma | Cat# A-003-E | |
| Primaria Plates | VWR | Cat# 62406-456 | |
| Stock reagents | reconstitution | Concentration used | Storage |
| Apo-transferrin | 10 mg/mL in PBS | 1:100 | -20°C |
| N-acetyl cysteine | 5 mg/mL in H2O | 1:1,000 | -20°C |
| Sodium selenite | 2.5 mg/mL in H2O | 1:25,000 | -20°C |
| Collagen IV | 200 μg/mL in PBS | 1:100 | -80°C |
| TGF-b2 | 20 μg/mL in PBS | 1:10,000 | -20°C |
| IL-34 | 100 μg/mL in PBS | 1:1,000 | -80°C |
| Ovine wool cholesterol | 1.5 mg/mL in 100% ethanol | 1:1,000 | -20°C |
| Heparan sulfate | 1 mg/mL in H2O | 1:1,000 | -20°C |
| Oleic acid/Gondoic acid | Gondoic: 0.001 mg/mL; Oleic: 0.1 mg/mL in 100% ethanol | 1:1,000 | -20°C |
| Heparin | 50 mg/mL in PBS | 1:100 | -20°C |
| Solutions | Recipe | Comments | |
| Perfusion Buffer | 50 μg/mL heparin in DPBS++ (PBS with Ca++ and Mg+ +) | Use when ice-cold | |
| Douncing Buffer | 200 μL of 0.4% DNaseI in 50 mL of DPBS++ | Use when ice-cold | |
| Panning Buffer | 2 mg/mL of peptone from milk solids in DPBS++ | ||
| Microglia Growth Medium (MGM) | DMEM/F12 containing 100 units/mL penicillin, 100 μg/mL streptomycin, 2 mM glutamine, 5 μg/mL N-acetyl cysteine, 5 μg/mL insulin, 100 μg/mL apo-transferrin, and 100 ng/mL sodium selenite | Use ice-cold MGM to pan microglia off of immnopanning dish. | |
| Collagen IV Coating | MGM containing 2 μg/mL collagen IV | ||
| Myelin Seperation Buffer | 9 mL Percoll PLUS, 1 mL 10x PBS without Ca++ and Mg++, 9 μL 1 M CaCl2, 5 μL 1 M MgCl2 | Mix well after the addition of CaCl2 and MgCl2 | |
| TGF-b2/IL-34/Cholesterol containing growth media (TIC) | MGM containing human 2 ng/mL TGF-b2, 100 ng/mL murine IL-34, 1.5 μg/mL ovine wool cholesterol, 10 μg/mL heparan sulfate, 0.1 μg/ml oleic acid, and 0.001 μg/ml gondoic acid | Make sure to add cholesterol to media warmed to 37 °C and do not add more than 1.5 μg/mL or it will precipitate out. Do not filter cholesterol-containing media. Equilibrate TIC media with 10% CO2 for 30 min- 1 hr before adding to cells to insure optimal pH. |
Referências
- Michaelis, S., Wegener, J., Robelek, R. Label-free monitoring of cell-based assays: Combining impedance analysis with SPR for multiparametric cell profiling. Biosens. Bioelectron. 49, 63-70 (2013).
- Hillger, J. M., et al. Whole-cell biosensor for label-free detection of GPCR-mediated drug responses in personal cell lines. Biosens. Bioelectron. 74, 233-242 (2015).
- Atienzar, F. A., et al. The use of real-time cell analyzer technology in drug discovery: defining optimal cell culture conditions and assay reproducibility with different adherent cellular models. J. Biomol. Screen. 16 (6), 575-587 (2011).
- Chen, H., et al. Label-free luminescent mesoporous silica nanoparticles for imaging and drug delivery. Theranostics. 3 (9), 650-657 (2013).
- Gao, Z., et al. Silicon Nanowire Arrays for Label-Free Detection of DNA. Anal. Chem. 79 (9), 3291-3297 (2007).
- Giaever, I., Keese, C. A morphological biosensor for mammalian cells. Nature. 366 (6455), 591-592 (1993).
- Xiao, C., Lachance, B., Sunahara, G., Luong, J. H. T. Assessment of cytotoxicity using electric cell-substrate impedance sensing: concentration and time response function approach. Anal. Chem. 74 (22), 5748-5753 (2002).
- Xiao, C., Lachance, B., Sunahara, G., Luong, J. H. T. An in-depth analysis of electric cell-substrate impedance sensing to study the attachment and spreading of mammalian cells. Anal. Chem. 74 (6), 1333-1339 (2002).
- Xing, J. Z., et al. Dynamic monitoring of cytotoxicity on microelectronic sensors. Chem. Res. Toxicol. 18 (2), 154-161 (2005).
- Abassi, Y. A., et al. Kinetic cell-based morphological screening: prediction of mechanism of compound action and off-target effects. Chem. Biol. 16 (7), 712-723 (2009).
- Urcan, E., et al. Real-time xCELLigence impedance analysis of the cytotoxicity of dental composite components on human gingival fibroblasts. Dent. Mater. 26 (1), 51-58 (2010).
- Atienza, J. M., Zhu, J., Wang, X., Xu, X., Abassi, Y. Dynamic monitoring of cell adhesion and spreading on microelectronic sensor arrays. J. Biomol. Screen. 10 (8), 795-805 (2005).
- Rahim, S., Uren, A. A Real-time Electrical Impedance Based Technique to Measure Invasion of Endothelial Cell Monolayer by Cancer Cells. J. Vis. Exp. (50), e2792 (2011).
- Moodley, K., Angel, C. E., Glass, M., Graham, E. S. Real-time profiling of NK cell killing of human astrocytes using xCELLigence technology. J. Neurosci. Meth. 200 (2), 173-180 (2011).
- Marinova, Z., Walitza, S., Grunblatt, E. Real-time impedance-based cell analyzer as a tool to delineate molecular pathways involved in neurotoxicity and neuroprotection in a neuronal cell line. J. Vis. Exp. (90), e51748 (2014).
- Chatelier, R. C., Gengenbach, T. R., Griesser, H. J., Brighamburke, M., Oshannessy, D. J. A general method to recondition and reuse Biacore sensor chips fouled with covalently immobilized protein/peptide. Anal. Biochem. 229 (1), 112-118 (1995).
- Vashist, S. K. A method for regenerating gold surface for prolonged reuse of gold-coated surface plasmon resonance chip. Anal. Biochem. 423 (1), 23-25 (2012).
- Nguyen, T. T., et al. A regenerative label-free fiber optic sensor using surface plasmon resonance for clinical diagnosis of fibrinogen. Int. J. Nanomed. 10, 155-163 (2015).
- Xu, Z., et al. A general method to regenerate arrayed gold microelectrodes for label-free cell assay. Anal. Biochem. 516, 57-60 (2017).
- Wang, H., et al. Three-dimensionally controllable synthesis of multichannel silica nanotubes and their application as dual drug carriers. ChemPlusChem. 80 (11), 1615-1623 (2015).
- Verrier, S., Notingher, I., Polak, J. M., Hench, L. L. In situ monitoring of cell death using Raman microspectroscopy. Biopolymers. 74 (1-2), 157-162 (2004).
- Keighley, S. D., Li, P., Estrela, P., Migliorato, P. Optimization of DNA immobilization on gold electrodes for label-free detection by electrochemical impedance spectroscopy. Biosens. Bioelectron. 23 (8), 1291-1297 (2008).
- Kandimalla, V. B., et al. Regeneration of ethyl parathion antibodies for repeated use in immunosensor: a study on dissociation of antigens from antibodies. Biosens. Bioelectron. 20 (4), 903-906 (2004).
- McGovern, J. P., Shih, W. Y., Shih, W. H. In situ detection of Bacillus anthracis spores using fully submersible, self-exciting, self-sensing PMN-PT/Sn piezoelectric microcantilevers. Analyst. 132 (8), 777-783 (2007).
- Loo, L., et al. A rapid method to regenerate piezoelectric microcantilever sensors (PEMS). Sensors. 11 (5), 5520-5528 (2011).
- Fischer, L. M., et al. Gold cleaning methods for electrochemical detection applications. Microelectron. Eng. 86 (4-6), 1282-1285 (2009).
