Expedited Radiation Biodosimetry by Automated Dicentric Chromosome Identification (ADCI) and Dose Estimation

Ben Shirley; Yanxin Li; Joan H.M. Knoll; Peter K. Rogan

doi:10.3791/56245

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Genética

Rayonnement accéléré biodosimétrie automatisé par Identification des chromosomes dicentriques (ADCI) et l’Estimation de la Dose

Published: September 04, 2017

doi:

10.3791/56245

Ben Shirley*¹, Yanxin Li*¹, Joan H.M. Knoll^1,2, Peter K. Rogan^1,3

¹CytoGnomix Inc., ²Department of Pathology and Laboratory Medicine,Western University, ³Department of Biochemistry,Western University

Summary

Le test cytogénétique chromosomes dicentriques (DC) quantifie l’exposition aux rayonnements ionisants. Le logiciel identificateur de chromosomes dicentriques automatisé et estimateur de Dose précisément et rapidement estime la dose biologiquement de contrôleurs de domaine dans les cellules en métaphase. Il distingue les chromosomes monocentriques et autres objets de DCs et estimations de dose de rayonnement biologique de la fréquence des contrôleurs de domaine.

Abstract

Dose de rayonnement biologique peut être estimée à partir des fréquences de chromosomes dicentriques dans les cellules en métaphase. Effectuer ces tests cytogénétiques chromosomes dicentriques est traditionnellement un processus manuel, beaucoup de travail mal adapté pour gérer le volume d’échantillons qui peut nécessiter une vérification à la suite d’un événement de grand nombre de blessés. Un logiciel automatisé identificateur de chromosomes dicentriques et Dose estimateur (ADCI) automatise ce processus en examinant des ensembles d’images de métaphase en utilisant des techniques de traitement image axée sur l’apprentissage automatique. Le sélectionne logiciel images appropriées pour analyse en supprimant les images inappropriés, classifie chaque objet comme contenant du centromère du chromosome ou non-chromosome, détail distingue les chromosomes sous forme de chromosomes monocentriques (MCs) ou dicentriques chromosomes (DCs), détermine la fréquence de DC dans un échantillon et estime que la dose de rayonnement biologique en comparant la fréquence d’échantillonnage DC avec des courbes d’étalonnage calculés à l’aide d’échantillons d’étalonnage. Ce protocole décrit l’utilisation du logiciel de l’ADCI. En général, tant d’étalonnage (dose connue) et jeux de test (dose inconnue) des images de métaphase est importées pour effectuer l’estimation de la dose exacte. Des images optimales pour l’analyse se trouvent automatiquement à l’aide de filtres d’image prédéfinie ou peuvent aussi être filtrées à travers l’inspection manuelle. Le logiciel traite les images dans chaque échantillon et fréquences de DC sont calculés à différents niveaux de sévérité différents pour appeler les contrôleurs de domaine, en utilisant une approche d’apprentissage de la machine. Courbes d’étalonnage linéaire quadratique sont générées basé sur les fréquences DC calibration échantillons exposés à des doses physiques connues. Doses d’échantillons exposés à des niveaux de rayonnement incertain sont estimées à partir de leurs fréquences de DC à l’aide de ces courbes d’étalonnage. Rapports peuvent être générés à la demande et fournissent les Résumé des résultats d’un ou plusieurs échantillons, un ou plusieurs des courbes d’étalonnage ou d’estimation de la dose.

Introduction

Rayonnement biodosimétrie utilise des marqueurs biologiques, pour la plupart des aberrations chromosomiques telles que les chromosomes dicentriques (DCs) et translocations chromosomiques pour mesurer les doses de rayonnement que les individus sont exposés à. Une dose biologiquement absorbée peut être différente de la physique dose mesurée par les instruments en raison de la variabilité entre les individus. De même, rayonnement d’une certaine dose de physique peut produire des expositions biologiques différentes en raison des conditions physiologiques ou environnementales sous-jacentes. Connaissance de la dose biologique est particulièrement important pour le diagnostic et le traitement.

L’essai de DC est l’étalon-or de l’Organisation mondiale de la santé (OMS) et l’Agence internationale de l’énergie atomique (AIEA) pour évaluer l’exposition de rayonnement biologique chez les personnes. C’était le premier dosage recommandé par l’AIEA et l’OMS pour l’évaluation de dose de rayonnement. Fréquence de DC est relativement stable pendant environ 4 semaines après l’exposition de rayonnement¹ et leur corrélation quantitative avec la dose de rayonnement émis est exacte, qui font DCs le biomarqueur idéal. La relation entre la dose de rayonnement (référencé dans les unités de Gray [Gy]) et la fréquence de DC (référencée comme nombre de contrôleurs de domaine par cellule) peut être exprimée comme une fonction linéaire quadratique.

La cytogénétique de DC a été le standard industriel pour environ 55 ans². Elle a été réalisée manuellement, nécessitant 1-2 jours pour analyser les données de microscope d’un échantillon sanguin. Plusieurs centaines à plusieurs milliers d’images sont nécessaires pour évaluer avec précision l’exposition aux radiations selon la dose à³. À des doses supérieures à 1 Gy, l’AIEA recommande un minimum de 100 DCs être détecté. Examen des images de métaphase de 250-500 est une pratique courante dans les laboratoires de cytogénétique biodosimétrie. Pour les échantillons avec des expositions < 1 Gy, 3 000-5 000 images sont proposées en raison des bas probabilités de formation DC. Dans les deux cas, c’est une tâche de travail intense.

Laboratoires de cytogénétique biodosimétrie créer leur propre in vitro courbes d’étalonnage de rayonnement biodosimétrie avant d’évaluer les doses biologiques dans les échantillons de test. Des échantillons de sang de personnes normales, de contrôle sont exposés à des radiations et les lymphocytes sont ensuite cultivées et préparées pour l’analyse des chromosomes métaphasiques. À l’aide de ces échantillons, biologiques doses reçues sont étalonnés pour les doses de physiques connus émis par une source de rayonnement standard. Après que les images de cellule de métaphase sont enregistrées, experts examinent des images, comptent DCs et calculer les fréquences de DC pour chaque échantillon. Une courbe d’étalonnage est construite en ajustant une courbe linéaire quadratique pour les fréquences de DC à toutes les doses. Puis, les expositions dans l’échantillon de personnes peuvent être déduites en faisant correspondre les fréquences DC aux doses calibrées sur la courbe ou en les spécifiant dans la formule de quadratique linéaire correspondante.

Nous ont automatisé les deux la détection des contrôleurs de domaine et dose de détermination pour accélérer cette procédure à l’aide de logiciels. Automatisé identificateur de chromosomes dicentriques et Dose estimateur (ADCI) utilise image axée sur l’apprentissage machine, techniques de traitement pour détecter et distinguer les chromosomes dicentriques (DCs) de chromosomes monocentriques (MCs) et d’autres objets et automatise le rayonnement estimation de la dose. Le logiciel a pour but de significativement réduire ou éliminer la nécessité d’une vérification manuelle des comtes de DC et d’accélérer les estimation de dose grâce à l’automatisation. Il a été développé avec la participation des laboratoires de référence de biodosimétrie à Santé Canada (SC) et de laboratoires nucléaires canadiennes (CNL). Leurs commentaires assurera que performance continuera satisfont aux critères de l’AIEA pour ce dosage.

Le logiciel effectue les fonctions suivantes : 1) filtrage DCs en sélectionnant les images cellule métaphase optimal pour l’analyse, la reconnaissance du chromosome 2), DC détection et dosage de fréquence DC et 3) estimation de la dose de rayonnement de doses calibrées, données sur le rayonnement cytogénétique. Ce logiciel traite les groupes d’images de la métaphase de la même personne (appelés un échantillon), compte le nombre de contrôleurs de domaine dans l’utilisation de chaque image des techniques de traitement, puis retourne la dose estimée de rayonnement reçue par chaque échantillon en unités de Grays (Gy).

Le logiciel a été conçu pour traiter une gamme de structures chromosomiques, comtes et densités. Toutefois, l’algorithme fonctionne de manière optimale dans les images de métaphase contenant un complément complet près de chromosomes bien séparées, linéaire,⁴. Images contenant des jeux hautement avec chevauchement des chromosomes, plusieurs cellules, cellules en métaphase incomplète, sœur séparation des chromatides sœurs, noyaux, objets non chromosomiques et autres défauts peuvent réduire l’exactitude de l’algorithme. Modèles de sélection d’image et autre segmentation objet seuils peuvent filtrer la majorité des images moins qu’optimales et fausses positifs DCs dédiés.

Chromosomes dicentriques détection est effectuée lors du traitement d’une image. L’algorithme tente de déterminer quels sont les objets dans une image sont des chromosomes et localise ensuite les deux régions plus susceptibles d’être des centromères sur chaque chromosome. Ensuite, une série de différents Support Vector Machine (SVM) modèles d’apprentissage distinguer les chromosomes comme DCs ou normal, chromosomes monocentriques. Les modèles SVM diffèrent dans la sensibilité et la spécificité de la détection de DC (voir étape 3.1.4 ci-dessous), qui peut influer sur les fréquences de DC qui sont déterminées dans un échantillon.

ADCI traite les ensembles de Giemsa (ou DAPI) colorées des images numériques de métaphase (au format TIFF ou JPG) pour un ou plusieurs échantillons. Le logiciel analyse DCs en échantillons d’étalonnage et des échantillons de test. Les doses de physiques (en Gy) des échantillons d’étalonnage sont connus et sont utilisés dans la production d’une courbe d’étalonnage. Les doses physiques et biologiques des individus avec des expositions inconnues sont déduits par le logiciel de la courbe d’étalonnage générées par ordinateur. Bien que les laboratoires utilisent des techniques comparables, les courbes d’étalonnage des laboratoires différents varient souvent³. Les deux échantillons de courbe et test d’étalonnage du laboratoire même doivent être traités pour l’estimation de la dose exacte dans les échantillons de test.

Ce logiciel offre rapidité, précision et évolutivité qui aborde la productivité nécessaire pour gérer un événement dans lequel de nombreuses personnes en même temps seront essayés. Elle a été développée à partir de 2008-2017,⁴^,⁵^,⁶^,⁷^,⁸^,⁹^,¹⁰^,¹¹^,¹² ^,,¹³. À l’aide de matériel d’informatique récent, ce bureauLogiciel PC peut traiter et estimation de dose de rayonnement dans un échantillon de 500 génomes de métaphase en 10-20 min ⁴. Le code est basé sur un ensemble de segmentation d’images exclusives et des algorithmes pour l’analyse des chromosomes en apprentissage automatique. Analyse experte de chaque chromosome exposé à un rayonnement 3 Gy a donné des précisions comparables à ADCI. Dans un ensemble de 6 échantillons d’expositions inconnues (précédemment utilisées dans un exercice de compétence internationale), le logiciel a estimé doses 0,5 Gy des valeurs obtenues par l’examen manuel des mêmes données par SC et CNL, satisfaire aux exigences de l’AIEA pour le triage biodosimétrie. En outre, normalisation interlaboratoire et finalement la reproductibilité des dose estiment qu’avantage d’avoir un contrôleur de domaine commun, automatisé notation algorithme. Néanmoins, le logiciel permet la personnalisation d’image critères de filtrage et sélection, permettant aux différences dans les méthodes de préparation de chromosome et sources d’étalonnage de rayonnement à prendre en compte.

Ce logiciel est une interface utilisateur graphique (GUI) – système qui analyse des ensembles d’images de chromosome contenant au moins Giemsa (DAPI) – teinté de cellules en métaphase d’anomalies résultant de l’exposition aux rayonnements ionisants. Les ensembles d’images sont numériquement photographiés avec un système de microscope de lumière (ou épifluorescence) et chaque jeu correspond à un échantillon différent. Le logiciel utilise des techniques pour détecter et distinguer DCs de MCs et autres objets de traitement d’image. Filtres-empiriquement segmentation puis éliminent automatiquement fausses positifs DCs sans affecter trues DCs. Enfin, le logiciel filtre automatiquement les images indésirables basées sur diverses propriétés de l’image trouvées des images de métaphase de mauvaise qualité avec des modèles de sélection image précalculé (ou spécifiées par l’utilisateur). Ces images incluent celles contenant excessive ou un nombre insuffisant d’objets « bruyants », plusieurs chromosomes qui se chevauchent, les images manquent les chromosomes en métaphase, un nombre excessif de sœur chromatides⁴. Les données d’image automatiquement curated sont utilisées pour générer la courbe d’étalonnage de dose provenant d’échantillons de dose de rayonnement connu et sont utilisées pour estimer les expositions d’échantillons exposés à des doses inconnues.

Sortie du logiciel peut être lus et enregistré en tant que : sortie 1) basé sur du texte affiché dans la console, 2) des terrains qui peuvent être sauvegardés comme images et 3) les rapports au format HTML. De nombreux aspects du logiciel sont personnalisables pour répondre aux besoins spécifiques des différents laboratoires. Laboratoires individuels fournissent habituellement des échantillons d’étalonnage et d’essai préparé et recueilli basé sur le protocole cytogénétique validé dans ce laboratoire. Cela maintient l’homogénéité de la préparation de l’échantillon et permet des courbes d’étalonnage obtenues à partir d’échantillons d’étalonnage à appliquer judicieusement pour tester les échantillons dérivés utilisant le même protocole. Courbes d’étalonnage peuvent aussi être crées à partir de coefficients de la courbe ou fréquences DC à doses thérapeutiques. Les estimations de dose plus précises sont obtenues en filtrant des images de qualité inférieures et des fausses positifs DCs (FPs). Sélection de sous-ensembles d’image optimale au sein de chaque échantillon s’effectue à l’aide de « Modèles de sélection Image » qui éliminent les images subpar qui tendent à introduire des FPs. Une série de modèles prévalidées sont inclus avec le logiciel, cependant complémentaires pour les modèles avec seuils personnalisés et de filtres peuvent être créés et enregistrés par l’utilisateur.

Une fois le logiciel charge avec succès, la principale interface graphique (GUI) est présenté (voir Figure 1). À partir de cette interface, échantillons, chacun consistant en un dossier de fichiers d’image de cellule métaphase, peuvent être sélectionnées et traitées afin d’identifier les contrôleurs de domaine, courbes d’étalonnage peuvent être créés et comparées et dose d’exposition de rayonnement des échantillons peut être déterminé.

Figure 1 : Les principaux secteurs de l’Interface utilisateur graphique inclut : une liste d’échantillons (1), une liste d’étalonnage courbes (2), le processus en file d’attente (3), qui surveille l’état de la détection de DC dans chaque ensemble d’images de chaque échantillon, un terrain afficher (4), qui résume les statistiques ou autres propriétés quantitatives d’un ensemble d’images dans des échantillons ou des courbes de calibrage et une console (5) qui contient le texte descriptif comme sorties de chaque opération effectuée par le programme. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Protocol

1. importation et échantillons de processus clic ' échantillons ' dans la barre de menus et sélectionnez ' nouvel échantillon '. Recherchez un répertoire approprié contenant un groupe d’images de la métaphase et cliquez sur ' sélectionner le dossier '. Tapez un ID unique pour l’échantillon dans le ' spécifier un ID unique pour le nouvel échantillon ' champ de texte. Cet ID permettra d’identifier l’échantillon dans l’espace de travail. ID de l’échantillon doit contenir alphanumérique, ' _ ', ou '-' caractères seulement. Sait à l’inclusion du laboratoire de la source et dose physique (pour les échantillons d’étalonnage) en l’échant. (Facultatif), fournir une description de l’échantillon, si vous le souhaitez au sein de la ' Description de l’échantillon (facultatif) ' zone de texte. Clic ' OK ' d’ajouter le nouvel échantillon à l’espace de travail. Répéter les étapes 1.1 à 1.4 pour ajouter d’autres échantillons. Créer un minimum de 3 échantillons d’étalonnage (sept ou plus sont recommandés 3 expositions différentes) et au moins un échantillon d’estimation de la dose. Mettre en évidence tous les échantillons, créés dans les étapes 1.1 à 1.5 dans le ' échantillons ' la liste, puis cliquez sur ' ou ajouter les échantillons à la file d’attente de processus ' () icône de. Clic ' traiter tous les échantillons dans la file d’attente ' () icône pour traiter tous les échantillons dans l’ordre dans la file d’attente – une ' ADCI traitement ' boîte de dialogue apparaît contenant tous les échantillons dans la file d’attente avec une barre de progression Lorsque tous les échantillons ont terminé le traitement, cliquez sur le . Enregistrer les échantillons maintenant, ou cliquez sur ' enregistrer un échantillon traité dans un fichier d’exemple de l’ADCI ' () l’icône pour enregistrer un échantillon traité ultérieurement. 2. visualisation et sélection des Images (facultatif, pas recommandé) Remarque : cette étape décrit l’utilisation de l’afficheur d’images métaphase et création d’un modèle de sélection d’image. Certains modèles de sélection image validés sont inclus avec le logiciel qui peut être utilisé dans la génération de courbe d’étalonnage et d’estimation de la dose. Ainsi, cette étape n’est pas requise, mais il peut être utilisé comme un guide décrivant les étapes nécessaires pour le faire si vous le souhaitez. Mettre en évidence un échantillon au sein de la ' échantillons ' la liste, cliquez sur ' échantillons ' dans le menu et sélectionnez ' Image vue ' pour ouvrir le ' métaphase visionneuse ' . Naviguer entre les images Sélectionnez une image dans la liste déroulante pour afficher une image spécifique. Cliquez sur les icônes fléchées gauche et droite pour faire défiler les images. Sélectionnez une valeur SVM Sigma dans la liste déroulante pour afficher les résultats de détection de DC à cette valeur de Sigma. Sélectionnez " Unprocessed " de la liste déroulante pour afficher les images raw sans contours chromosome. Vérifier la ' inverser ' case à cocher pour inverser les valeurs de couleur et de luminosité pour chaque pixel de l’image. Vérifier le ' Image dans la liste de surveillance ' case à cocher pour ajouter l’image visible à un ' liste '. Cliquez sur ' enregistrer la liste de surveillance dans un fichier texte ' () l’icône pour enregistrer les noms de toutes les images dans la liste de surveillance dans un fichier texte. Modèles de sélection d’image clic ' Voir toutes les photos ' (sélection par défaut) d’inclure toutes les images dans la zone de liste déroulante de sélection image. Observez le texte adjacent à ' images incluses ' à la découverte de la fraction des images sélectionnées par le modèle de sélection d’image actuellement appliquée. Clic ' vue inclus des images ' d’inclure uniquement ces images qui n’ont pas été exclus par le modèle de sélection d’image dans la zone déroulante. Clic ' vue exclue images ' à inclure des images qui ont été exclus par le modèle de sélection d’image appliqués dans la zone déroulante. Cocher la ' exclure ' case à cocher exclure manuellement une seule image. NOTE : Les images manuellement exclus sont restaurés à l’image sélectionnée si un modèle de sélection d’image est appliqué par la suite. Enregistrer une sélection d’images en cliquant sur le ' enregistrer la sélection ' bouton. Entrez un nom de fichier pour la sélection mémorisée lorsque vous y êtes invité. Cliquez sur ' charger sélection ' pour appliquer une sélection précédemment sauvegardée. Cliquez ' filtres d’Image s’appliquent ' pour ouvrir le ' appliquer le filtre Image sélection modèle à échantillon actuel ' boîte de dialogue, qui crée, enregistre, ou applique des critères de sélection des images de métaphase dans un échantillon. Sélectionner un modèle de sélection d’image dans la liste préremplie. Cliquez sur ' OK ' d’appliquer le modèle actuel. Entrez une description pour un nouveau modèle désiré, définir ' Image filtres d’Exclusion ', définir ' Image classement et inscription ', puis cliquez sur ' sauver sélection modèle ' pour créer une Image Modèle de sélection. NOTE : Les définitions des ' Image de classement et inscription ' méthodes et chacun ' filtre d’Exclusion Image ' se trouvent dans la documentation en ligne de logiciels 14. 3. Génération de la courbe (Recommended optional step) courbe de Calibration Wizard s’assurer un minimum de trois échantillons de calibration sont présents dans l’espace de travail avant de procéder. Cliquez sur ' assistants ' dans la barre de menus et sélectionnez ' courbe d’étalonnage ' pour ouvrir l’Assistant d’étalonnage courbe. NOTE : Bien que seulement trois échantillons sont mathématiquement requis pour s’adapter et de calculer une courbe d’étalonnage, sept ou plusieurs échantillons qui couvrent un éventail d’expositions entre 0 et 5 Gy sont recommandées. Les exemples supplémentaires sont nécessaires pour s’adapter à la courbe d’étalonnage pour une réponse linéaire quadratique dose, mais les valeurs optimales de Sigma peuvent être plus faible afin d’obtenir des courbes qui peuvent être utilisés pour l’estimation de la dose faible (< 1 Gy) ; les valeurs optimales de Sigma pour les doses supérieures à ce seuil sont différentes (voir étape 3.1.4). Procédez par le biais de l’Assistant liminaire de l’écran et placez une coche à côté de chaque échantillon d’étalonnage souhaitée. Pour chaque échantillon de calibration sélectionné de cette façon, préciser la dose de physique (en Gy), l’échantillon a été exposé à dans son champ de texte adjacent. Continuer à l’écran de l’Assistant suivant. Sélectionner un modèle de sélection d’image si désiré dans la liste des modèles, des modèles de sélection image prédéfinie contenant fournis avec le logiciel en plus de tous les modèles créés manuellement. Continuer à l’écran de l’Assistant suivant. Sélectionner une valeur de SVM Sigma dans la zone de liste déroulante. Continuer à l’écran suivant de l’Assistant . NOTE : Une valeur de SVM Sigma de 1.4 ou 1.5 est recommandée pour les estimations des doses > 1 Gy et une valeur de 1,0 pour les estimations ci-dessous 1 Gy ( Figure 2). Passez en revue toutes les sélections sur l’écran de résumé et cliquez sur ' finition ' pour terminer l’Assistant, provoquant une prepopulatEd ' créer une courbe ' dialogue apparaisse. figure 2 : visualisation de l’effet de la modification de la valeur de Sigma SVM de l’algorithme sur le vrai positif (TP) et le nombre de faux positifs (FP) DC, le Calue prédictive Positive (VPP) et vrai positif Rate (TPR). s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure. créer une boîte de dialogue courbe. (Sautez cette étape si l’Assistant a été utilisé) cliquez sur ' courbes ' dans la barre de menus et sélectionnez ' nouvelle courbe '. Choisissez ' raccord courbe aux données Dose-réponse ' dans la zone de liste déroulante présentées dans la boîte de dialogue et cliquez sur ' OK '. Spécifier une identité unique pour la courbe dans le ' spécifier une identité unique pour la nouvelle courbe ' la zone de texte dans le ' créer une courbe ' dialogue. (En option) Type une description pour la nouvelle courbe dans le ' ajouter une brève description de la courbe à créer ' zone de texte. (Sauter les étapes suivantes si l’Assistant de courbe a été utilisé pour créer une courbe d’étalonnage) définie des valeurs de la courbe. Remarque : L’Assistant de la courbe d’étalonnage décrit à l’étape 3.1 préremplit quelle champs dans le ' créer une courbe ' dialogue. Les étapes suivantes décrivent comment remplir manuellement ces champs. Si l’Assistant a été utilisé, certaines étapes ci-dessous peuvent tout de même suivre si vous le souhaitez, d’ajouter ou de supprimer des données supplémentaires. Sélectionnez une valeur de SVM Sigma des options dans le ' SVM ' liste déroulante – il est fortement recommandé que la valeur de Sigma choisie ici correspondent à la valeur de Sigma choisie lors de l’utilisation de cette courbe d’estimation de la dose. (Facultatif), spécifiez un modèle de sélection d’image en cliquant sur le ' spécifier un fichier ' bouton. Cliquez ' entrée ' pour ajouter une nouvelle entrée vide à la liste de dose-réponse sous la rubrique ' Dose réponse d’entrée de données pour créer une courbe '. Entrer la dose d’un échantillon de calibrage en Gy sous la rubrique ' Dose '. Enter ' réponse (DC/cellule) ' tirées de l’exemple de sortie dans la console lorsqu’un échantillon est mis en surbrillance. Recherchez la valeur DC/cellule appropriée pour la valeur de Sigma SVM précédemment sélectionnée dans la console ou de l’état de l’échantillon correspondant (étape 5.1, si disponible) et entrez-le dans ce domaine. Répétez les trois étapes précédentes jusqu’à ce que tous les échantillons d’étalonnage ont été ajoutées. Presse ' valider les données ' pour s’assurer que le contenu de la Dose-réponse, liste est correctement formaté – vérifier tous les champs dans la liste de Dose-réponse sont en surbrillance verte indiquant des données valides. Presse ' OK ' pour finaliser la création de la courbe. Pour enregistrer la nouvelle courbe dans le ' courbe sauver ? ' boîte de dialogue qui s’affiche après pressage ' OK '. Ou cliquez sur ' enregistrer la courbe dans un fichier de courbe ADCI ' () icône en surbrillance dans le ' courbes ' la liste plus tard. 4. Estimation de la dose (Recommended optional step) Assistant Estimation de Dose cliquez ' assistants ' dans la barre de menus et sélectionnez ' Estimation de Dose '. Procéder à travers l’écran introduction de l’Assistant et sélectionnez une courbe d’étalonnage préalablement créé dans la zone de liste déroulante – ses propriétés s’affichent ci-dessous. Continuer à l’écran de l’Assistant suivant. Placez une coche à côté des échantillons pour essai d’exposition inconnue pour les inclure dans l’estimation de la dose. Continuer à l’écran de l’Assistant suivant. Observer la description et les propriétés de l’image sélection modèle appliqué pendant la génération de courbe d’étalonnage. Observer que le même modèle de sélection d’image est appliqué aux échantillons de test sélectionné. Continuer à l’écran de l’Assistant suivant. Remarque : Sous la description du modèle de sélection d’image, le même modèle est prérempli et s’appliquera pour les échantillons d’épreuve de sélection. Appliquer le même modèle de sélection d’image de calibration et tester des échantillons. Bien qu’il soit possible d’appliquer des modèles de sélection image différente en sélectionnant un modèle différent dans la liste déroulante, ce n’est pas recommandé. Sélectionner une valeur de SVM Sigma dans la liste déroulante. Continuer à l’écran de l’Assistant suivant. Remarque : La valeur de Sigma SVM utilisée durant la génération de courbe d’étalonnage est préremplie. Il est recommandé que cette valeur reste inchangé. Examiner les sélections précédentes sur l’écran de résumé et cliquez sur ' finition ' pour terminer l’Assistant – un préremplies ' calculatrice de Dose ' boîte de dialogue apparaîtra. Calculatrice de dose (ignorez cette étape si l’Assistant a été utilisé) mettre en évidence une courbe d’étalonnage de la liste des courbes sous la rubrique ' courbes ', cliquez ' courbes ' dans le menu et sélectionnez ' Dose de calculer ' pour ouvrir le ' calculatrice de Dose ' dialogue. (Ignorer ces étapes si l’Assistant a été utilisé) définie des valeurs pour l’estimation de la dose. Remarque : L’Assistant de l’Estimation de la Dose indiqué au point 4.1 préremplit quelle champs dans le ' calculatrice de Dose ' dialogue. Les étapes suivantes décrivent comment remplir manuellement ces champs. Si l’Assistant a été utilisé, certaines étapes ci-dessous peuvent tout de même suivre si vous le souhaitez, d’ajouter ou de supprimer des données supplémentaires. Cliquez ' Échantillons d’utilisation dans l’espace de travail pour combler les fréquences DC ' () icône et point culminant des échantillons au sein de la ' échantillons traités dans ADCI Espace de travail ' liste pour ajouter les échantillons sélectionnés à la ' DC fréquences pour l’Estimation de la Dose ' liste. Sélectionner un modèle de sélection SVM Sigma valeur et image pour ces échantillons dans les listes déroulantes. Remarque : Une valeur de SVM Sigma correspondant à la valeur de Sigma utilisée dans la production de courbe d’étalonnage est nécessaire pour l’estimation de la dose exacte. La valeur de Sigma associée à la courbe d’étalonnage est indiquée au bas de la ' calculatrice de Dose ' dialogue. (en option) échantillons d’essai supplémentaire de Add en répétant les deux étapes précédentes. Sinon, ajouter plusieurs échantillons simultanément en mettant en évidence des échantillons multiples dans la ' les échantillons traités dans l’espace de travail ' liste. (facultatif) cliquez sur le ' d’entrée d’une valeur de fréquence DC ' () icône pour entrer manuellement un DC fréquence non associée à n’importe quel échantillon si vous le souhaitez – la nouvelle fréquence DC s’ajouteront à la ' DC Aberrations pour l’Estimation de la Dose ' liste. (facultatif) Double clic le ' nom ' champ de fréquence DC entrée manuellement pour modifier son nom. (facultatif) point culminant des échantillons appropriés, puis cliquez sur ' fréquence supprimer DC ' () icône de prélèvement d’échantillons qui ont été ajoutés à la ' DC Pour l’Estimation de la Dose des aberrations ' liste par erreur. Cliquez ' OK ' pour fermer la ' calculatrice de Dose ' et effectuer l’estimation de la dose – résultats sont de sortie dans la console. Comme résultats d’estimation de dose sont affichés dans la console sous forme de tableau pour chaque échantillon, observer ' fréquence DC ', ' SVM ', ' Dose estimée ' (contient l’estimée la dose biologiquement de l’échantillon, exprimée en Gy), et ' modèle de sélection Image appliquée ' champs. 5. Rapports Remarque : la méthode utilisée pour nommer un rapport, puis sélectionnez un répertoire dans lequel il est enregistré est commune à tous les types de rapports. A ' rapport nom ' doit être fournie. Lorsqu’un rapport est généré, un répertoire contenant des fichiers de rapport sera créé automatiquement à l’aide de ce nom. Ce répertoire sera placé dans les limites est le ' rapport dossier '. Par défaut, le ' dossier de rapports ' est un répertoire nommé ' rapports ' dans le répertoire de données spécifié pendant l’installation. Exemple de rapport cliquez ' rapport ' dans la barre de menus et sélectionnez ' exemple de rapport ' pour ouvrir le ' générer l’exemple de rapport ' dialogue. Entrez un nom pour le rapport dans le ' rapport nom ' champ de texte. Cliquez sur ' parcourir ' modifier le ' dossier de rapports ' si vous le souhaitez. Sélectionner au moins un échantillon traité à inclure dans le rapport en plaçant une coche à côté des échantillons appropriés dans le ' choisir des échantillons ' liste. Spécifier une plage de SVM Sigma des valeurs pour lesquelles générer DC distribution parcelles en sélectionnant des valeurs dans ' Min ' et ' Max ' boîtes de liste déroulante dans le ' Distribution de contrôleurs de domaine dans l’échantillon ' zone. Exclure le rapport de parcelles de distribution DC si vous le souhaitez en décochant la ' comprennent ' case à cocher dans le ' Distribution des contrôleurs de domaine dans l’échantillon ' domaine. Spécifier quels emplacements contenant des statistiques de filtrage à inclure dans le rapport en plaçant des coches à côté des terrains nécessaires à la ' sélectionner les parcelles ' zone. Cliquez sur ' OK ' pour générer le rapport. Rapport courbe cliquez ' rapport ' dans la barre de menus et sélectionnez ' courbe rapport ' pour ouvrir le ' générer rapport courbe ' dialogue. Entrez un nom pour le rapport dans le ' rapport nom ' champ de texte. Cliquez sur ' parcourir ' modifier le ' dossier de rapports ' si vous le souhaitez. Sélectionner au moins une courbe d’inclure dans le rapport en plaçant une coche à côté de courbes appropriés dans le ' choisir les courbes à inclure dans le rapport ' liste. Cliquez sur ' OK ' pour générer le rapport. Rapport estimation de dose effectuer dose estimation les étapes décrites à la section 4. NOTE : Dose estimation rapports sont générés à partir des résultats indiqués dans les zones de terrain et de la console. Ainsi, une parcelle d’estimation de dose doit être présente dans la zone de traçage au moment où un rapport est généré. Clic ' rapport ' dans la barre de menus et sélectionnez ' Dose Estimation rapport ' pour ouvrir le ' générer rapport de dose estimation ' dialogue. Entrez un nom pour le rapport dans le ' rapport nom ' champ de texte. Cliquez sur ' parcourir ' modifier le ' dossier de rapports ' si vous le souhaitez. Clic ' OK ' pour générer le rapport. 6. Capacités d’audit Remarque : le logiciel enregistre toutes les opérations effectuées au cours d’une session dans un fichier journal. Le programme fournit une application de logiciel accessoire qui permet les fichiers journaux être lus, fouillé, utilisé pour évaluer l’intégrité d’une analyse et dans certains cas, pour récupérer des données d’échantillon d’incomplète ou prématurément terminée séances. Cliquez ' aider ' dans la barre de menus et sélectionnez ' afficher les journaux ' pour ouvrir le logiciel supplémentaire de visionneuse journal fichier. S’assurer que les fichiers journaux répertoriés dans la barre latérale sur le côté gauche de la fenêtre. Si aucun fichier n’est visible, cliquez sur ' File ', choisissez ' répertoire du fichier journal Select ', puis accédez à un répertoire contenant des fichiers journaux. Double-cliquez sur le nom d’un fichier journal dans la barre latérale pour afficher le contenu du fichier journal dans le ' Viewer ' Tab Sélectionner le ' recherche ' tab et entrée Rechercher des termes à rechercher un ou plusieurs fichiers journaux. Entrée paramètres de recherche si vous le souhaitez dans la ' de ', ' à ', ' utilisateur ', ' licence ', ' opération ', et ' Paramètres ' champs. Utiliser le curseur pour sélectionner le ' résultats de la recherche de Max pour chaque fichier '. Remarque : Certains paramètres de recherche, telles qu’username, renvoie des résultats nombreux dans chaque fichier journal correspondant. Ce paramètre limite le nombre de résultats de recherche affichés dans chaque fichier de log. Placer une coche dans la ' recherche seulement mis en évidence que les fichiers ' case (Journal de tous les fichiers sont recherchés par défaut) et mettre en surbrillance les fichiers journaux dans la barre latérale pour rechercher uniquement un sous-ensemble des fichiers journaux. Vérifier la ' effectuer la vérification de l’intégrité ' case (activé par défaut) pour examiner chaque fichier journal admissible Rechercher des erreurs liées à un arrêt inattendu logiciel. Clic ' recherche ' pour rechercher les fichiers journaux et observer la recherche les résultats sur le côté droit de la fenêtre. Cliquez sur le ' afficher le fichier journal ' bouton adjacent à un résultat de recherche pour mettre en évidence et afficher la ligne indiquée dans le ' Viewer ' Tab Problèmes d’intégrité des fichiers log cliquez sur le ' l’intégrité ' onglet pour afficher des erreurs détectées au cours de la vérification d’intégrité (si le chèque a été demandé). Remarque : Une recherche doit être effectuée pour examiner les fichiers journaux pour les problèmes d’intégrité. Pour effectuer une vérification d’intégrité sans la recherche des fichiers journaux pour uney les termes de recherche, il suffit de laisser tous les champs de paramètre de recherche noir dans le ' recherche ' onglet, assurer la ' effectuer la vérification de l’intégrité ' est cochée, puis cliquez sur ' recherche '. Si des problèmes d’intégrité sont trouvées, le ' intégrité ' onglet arrière-plan couleur devient rouge Questions intégrité resolve (sortie est groupé par fichier journal) si possible. Remarque : Pour plus d’informations concernant les étapes permettant de résoudre les problèmes d’intégrité, consultez la documentation en ligne 14. 7. Courbe et Dose Estimation statistique Options cliquez ' paramètres ' dans la barre de menus et sélectionnez ' Options de statistiques ' pour ouvrir le ' Options de statistiques ' dialogue. Sélectionner une courbe d’étalonnage, méthode (méthode des moindres carrés ou maximum de vraisemblance) dans la zone de liste déroulante de. Placez une coche à côté de ' afficher la courbe d’étalonnage IC à 95 %, le cas échéant ' pour afficher les intervalles de confiance de 95 % pour le traçage d’une courbe d’étalonnage. Placez une coche à côté de ' estimation de Dose calcule IC à 95 % en raison du Poisson ' pour calculer les limites de confiance à 95 % sur les estimations de la dose selon la nature du Poisson du rendement DC. Placez une coche à côté de ' estimation de Dose calcule IC à 95 % en raison de la courbe, le cas échéant ' pour calculer les limites de confiance à 95 % sur les estimations de dose issues des incertitudes liées à la courbe d’étalonnage.

Representative Results

Essai du logiciel a été réalisée avec la métaphase chromosome image données de HC et CNL. Des échantillons de sang ont été irradiés par une unité XRAD-320 (250 kV radiographies, 12,5 mA, 2mm Al filtration, débit de dose : 0.92 ou 1.7 Gy/min) calibré avec une chambre d’ion à HC et traitées dans les deux laboratoires. Échantillons de lymphocytes de sang périphérique ont été cultivées, fixe et colorées dans chaque établissement selon les protocoles établis3,15. Images de métaphase de lames de coloration Giemsa furent capturés indépendamment par chaque laboratoire en utilisant un système automatisé de microscopie. Experts dans chaque laboratoire a marqué DCs dans plusieurs de ces échantillons manuellement, construit leurs propres courbes de calibration et estimé les doses d’échantillons des risques inconnus. Une description détaillée de ces données est fournie dans le tableau 1. Dose de physique Objectif Préparation de HC Préparation de la CNL Nom de visé Nbre d’images Nom de visé Nbre d’images 0 Gy Calibration HC0Gy 731 CNL0Gy 798 0,1 Gy Calibration HC01Gy 2162 NA NA Gy 0,25 Calibration HC025Gy 1826 NA NA 0,5 Gy Calibration HC05Gy 1054 CNL05Gy 1532 Gy 0,75 Calibration HC075Gy 1233 NA NA 1 Gy Calibration HC1Gy 1566 CNL1Gy 841 2 Gy Calibration HC2Gy 1147 CNL2Gy 996 3 Gy Calibration HC3Gy 1212 CNL3Gy 1188 4 Gy Calibration HC4Gy 909 CNL4Gy 1635 5 Gy Calibration HC5Gy 1019 NA NA 3.1 Gy Test HCS01 540 CNLS01 500 2.3 Gy Test HCS08 637 CNLS08 500 1.4 Gy Test HCS10 708 NA NA 1,8 Gy Test HCS04 600 CNLS04 957 2.8 Gy Test HCS05 1136 CNLS05 1527 3.4 Gy Test HCS07 477 CNLS07 735 Tableau 1 : Sources de données de l’Image fournies par SC et CNL pour l’évaluation du logiciel.Référence : Modification du tableau 1 dans Rogan et coll., 20164. Seules les images manuellement présélectionnés étaient disponibles auparavant nous du CNL. Images non filtrées sont devenues disponibles et comtes d’image sont mises à jour en conséquence. En outre, nouvellement acquis échantillons HC (0.25Gy, 0.75Gy et 5Gy) sont présentés ici. Sélection automatique de l’Image dans les échantillons Qualité d’image est essentielle à la détection correcte de DC dans l’analyse DC. Sélection des images par des spécialistes de cytogénétiques est habituellement réalisée manuellement dans l’analyse conventionnelle de DC. ADCI utilise des critères quantitatifs image pour sélectionner automatiquement les images avant DC fréquence calcul16. Les utilisateurs peuvent soit filtrer les images basées sur les morphologies chromosomiques spécifiques et/ou de cellules de tri selon les proportions relatives des longueurs des objets en fonction des longueurs connues des groupes définis de cytogénétique des chromosomes chez un caryotype humain normal (appelé le méthode de la distance de groupe-bin). Les filtres morphologiques disponibles utilisent des seuils de scale-invariant pour rejeter images de cellules avec des ensembles de chromosomes incomplète ou avec des métaphases multiples, avec des chromosomes prométaphase, avec soeur éminente dissociation entre chromatides sœurs, fortement courbé et tordu chromosomes, avec des objets qui ont des contours harmonieux caractéristiques des noyaux intacts et ceux dans lesquels les objets moins sont reconnus sous forme de chromosomes. Figure 3 (a) et (b) montrent des exemples d’images sélectionnées, tandis que la Figure 3 (c) et (d) sont des exemples d’images qui sont filtrés par le logiciel. Ces images sont tirées d’un échantillon HCS05 (décrite dans le tableau 1) et sont sélectionnés par le modèle de sélection d’image prédéfini qui se classe au rang de toutes les images de distance bin group, puis sélectionne les meilleures images de 250. Chromosomes en Figure 3 (A), (b) sont bien séparées et présentent une morphologie satisfaisante. Figure 3 (c) contient un nombre excessif de grappes de chromosome se chevauchent. Figure 3 (d) montre sévère soeur séparation des chromatides sœurs. Les chromatides sœurs sont complètement séparés au moins 8 des chromosomes et les constrictions centromériques sont ambigues dans la plupart des autres chromosomes. Figure 3 : exemples d’Images de métaphase en échantillon HCS05 (grossissement : 63 X), fois Unselected et sélectionnés par le modèle « Groupe Bin Distance, Top 250 Images ». (A) et (B) sont des images sélectionnées. (C) et (D) sont des images qui ont été éliminés par le modèle. (C) a été exclu parce qu’il contenait trop de chromosomes qui se chevauchent et (D) avait un nombre excessif de sœur séparé chromatides. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure. Les effets de l’application de ces modèles de sélection d’image est évident en examinant le niveau de confiance de détection de DC dans un échantillon. Occurrences de contrôleurs de domaine dans une population de cellules à partir d’un échantillon irradié suivent une distribution de Poisson. Le test d’ajustement du Khi-deux compare la distribution de fréquence DC observée à l’ajustement prévu pour la distribution de Poisson. Modèles que correctement filtrer les données échantillon présentent des fréquences de DC ne diffère pas significativement du Poisson prévu dérivés de valeurs (seuil de signification généralement > 0,01). Figure 4 affiche les occurrences DC et le correspondant s’adapte aux distributions de Poisson pour l’échantillon HC4Gy de toutes les images vs uniquement les images sélectionnées par le modèle « groupe bin distance, top 250 images ». Figure 4 (b) montre un meilleur ajustement à la distribution de Poisson. Le p-valeur (0,36) de la série filtrée d’images dépasse largement celle de la répartition de DC non filtrée dans la Figure 4 (a). À 5 % ou 1 % les niveaux de signification, l’échantillon non filtré dans la Figure 4 (a) est moins fiable, car il contient des données de DC de qualité inférieures, sous l’hypothèse nulle d’une distribution de Poisson de DCs est rejeté. Figure 4 : Captures d’écran des fréquences proportionnées DC apte à Poisson Dstributions de HC4Gy d’échantillon dans le logiciel. (A) toutes les images sont incluses, (B) seuls les images sélectionnées par modèle (distance bin group, top 250 images) sont inclus. La légende (en haut à droite) indique les statistiques de l’ajustement de la distribution de Poisson (indice de Dispersion, test de Mu et Lambda) et de la bonté de khi-deux test d’ajustement (p-value) s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure. Détection de chromosomes dicentriques (DC) Détection précise de DC est la condition préalable critique ADCI. Correctement détecté DCs et ceux manqués par le logiciel sont définis comme de vrais positifs (TPs) et de faux négatifs (FNs). Les objets qui ne sont pas des contrôleurs de domaine, mais incorrectement détecté en tant que contrôleurs de domaine, sont appelés faux positifs (FPs). FPs incluent chromosomes monocentriques, fragments de chromosomes, sœur séparée chromatides, grappes de chromosome se chevauchent et les objets non chromosomique. La figure 5 montre les résultats de détection de DC dans deux images de la métaphase. Les objets 1 et 3 sont TPs, alors que l’objet 4 est un FP comprenant deux chromosomes distincts monocentrique jointes le long de leurs bras courts. Dans la Figure 5 (a), objet 2 était à l’origine un FP, mais par la suite corrigé par FP filtres dans le logiciel. Objet 5 et 6 d’objet dans la Figure 5 (b) sont des exemples susceptibles de PN. Figure 5 : Captures d’écran indiquent métaphase Chromosome Classification des contrôleurs de domaine potentiels. (A) Une image dans l’échantillon CNL1Gy (grossissement : 63 X) montrant 1 TP, objet « 1 » ; et 1 corrige FP, objet « 2 ». (B) une image dans l’échantillon CNL4Gy (grossissement : 63 X) montrant 1 TP, objet « 3 » ; 1 FP, objet « 4 » ; et 2 PN potentiels, objets « 5 » et « 6 ». TPs, FPs corrigée, monocentrique normal et chromosomes non classifiés figurent respectivement avec contour en rouge, jaune, vert et bleu. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure. Estimation de la dose des échantillons pour essai Le résultat final des analyses de l’ADCI sont les estimations de la dose d’échantillons déduites des courbes d’étalonnage. Les estimations de dose faites par le logiciel pour les échantillons d’essai dans le tableau 1 sont indiquées dans les tableaux 2 et 3. À titre de comparaison, la dose de rayonnement physique émis et les doses sécables manuelles par des experts à SC pour les échantillons HCS01, HCS08 et HCS10 sont indiqués. De même, le manuel a marqué doses par des experts de la CNL et physique sont indiqués pour CNLS04, CNLS05 et CNLS07. La figure 6 montre les courbes d’étalonnage avec les estimations de dose de rayonnement pour les échantillons de laboratoire de biodosimétrie Santé Canada HCS01, HCS08, HCS10, HCS04, HCS05 et HCS07. La courbe d’étalonnage est générée à l’aide d’échantillons HC0Gy, HC1Gy, HC2Gy, HC3Gy et HC4Gy. Le modèle de sélection d’image contenant 3 Z-score-filtres + « groupe bin distance, images top 250 » est appliqué à tous les échantillons. Estimations de la dose ainsi que des analyses statistiques associées sont indiquées dans le tableau 2. Figure 6 : Capture d’écran de l’Estimation de la Dose des échantillons pour essai HC. Les carrés noirs représentent des échantillons d’étalonnage. Images dans des échantillons et des échantillons d’étalonnage sont sélectionnés par le modèle (3 filtres FP + groupe bin distance, top 250 images). Épaisseur des lignes pointillées représentent le mappage de DCs/métaphase par le biais de la courbe d’étalonnage pour l’estimation de la dose. Fines lignes pointillées dénotent supérieur et abaisser les limites de confiance de 95 % de DCs/métaphase. Codes d’échantillons de couleur : rouge vif, HC S01 (dose physique : 3.1Gy, dose SC déduit : 3.4Gy, ADCI : 3Gy) ; vert foncé, HC S04 (dose physique : 1.8Gy, ADCI : 1.85Gy) ; bleu vif, HC S05 (dose physique : 2.8Gy, ADCI : 2.95Gy) ; bleu foncé, HC S07 (dose physique : 3.4Gy, ADCI : 2.35Gy) ; rouge foncé, HC S08 (dose physique : 2.3Gy, dose SC déduit : 2.5Gy, ADCI : 2Gy) ; vert vif, HC S10 (dose physique : 1.4Gy, dose SC déduit : 1.4Gy, ADCI : 0.95Gy). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure. Échantillons Dose de physique HC déduit la Dose ADCI estimé Dose Estimation de la Dose LCL Estimation de la Dose UCL P-valeur * HCS01 3.1 3.4 3 2.3 3.8 0,117 HCS08 2.3 2.5 2 1.4 2.7 0,815 HCS10 1.4 1.4 0,95 0,5 1.55 0.211 HCS04 1.8 NA 1,85 1.25 2.55 0.0293 HCS05 2.8 NA 2.95 2.25 3.75 0.00354 HCS07 3.4 NA 2.35 1.7 3.1 0,0002 Tableau 2 : Dose les résultats de l’Estimation des échantillons pour essai HC.Référence : Modification du tableau 3 en Rogan et coll., 20164. ADCI dose estimations rapportées sont fondées sur des images non filtrées et ajustement de courbe a été réalisée à l’aide de la méthode des moindres carrés. Ici, la courbe d’étalonnage a été ajustée en utilisant la méthode du maximum de vraisemblance et un modèle de sélection d’image contenant 3 filtres FP + « groupe bin distance, images top 250 » a été appliqué avant l’estimation de la dose. Estimation de la dose UCLet LCL pour haute estimation de dose et de réduire les limites de confiance à 95 % selon la nature du Poisson du rendement DC. * Qualité carrée chi de l’ajustement de la distribution théorique de Poisson ; NA : Résultats de dose manuellement présumée n’ont pas été fournis. Estimations des doses de rayonnement pour les échantillons du CNLS04 canadien de laboratoires nucléaires, CNLS05, CNLS07, CNLS01 et CNLS08 sont indiqués dans la Figure 7. La courbe d’étalonnage est générée à l’aide d’échantillons CNL0Gy, CNL0.5Gy, CNL1Gy, CNL2Gy, CNL3Gy et CNL4Gy. Nous avons appliqué un modèle de sélection d’image composée de 6 filtres FP à tous les échantillons. Les résultats des analyses statistiques sont indiquées dans le tableau 3. Figure 7 : Capture d’écran de l’Estimation de la Dose d’échantillons CNL. Les carrés noirs représentent des échantillons d’étalonnage. Images dans des échantillons et des échantillons d’étalonnage sont sélectionnés à l’aide de 6 filtres FP. Épaisseur des lignes pointillées représentent le mappage de DCs/métaphase par le biais de la courbe d’étalonnage pour l’estimation de la dose. Fines lignes pointillées dénotent supérieur et abaisser les limites de confiance de 95 % de DCs/métaphase. Codes d’échantillons de couleur : rouge vif, CNL S04 (dose physique : 1.8Gy, dose CNL déduit : 1.7Gy, ADCI : 1.95Gy) ; rouge foncé, CNL S05 (dose physique : 2.8Gy, dose CNL déduit : 2.7Gy, ADCI : 3.05Gy) ; vert vif, CNL S07 (dose physique : 3.4Gy, dose CNL déduit : 3.1Gy, ADCI : 3.4Gy) ; vert foncé, CNL S01 (dose physique : 3.1Gy, ADCI : 3.75Gy) ; bleu, CNL S08 (dose physique : 2.3Gy, ADCI : 2.8Gy). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure. Échantillons Dose de physique CNL déduit la Dose ADCI estimé Dose Estimation de la Dose LCL Estimation de la Dose UCL P-valeur * CNLS04 1.8 1.7 1.95 1.25 2.45 0.0545 CNLS05 2.8 2.7 3.05 2,75 3.35 0,325 CNLS07 3.4 3.1 3.4 3 3.75 0,473 CNLS01 3.1 NA 3.75 3.35 > 4 7.63E-11 CNLS08 2.3 NA 2.8 2.25 3.3 0,777 Tableau 3 : Résultats d’estimation de dose du CNL échantillons.Référence : Modification du tableau 3, Rogan et coll., 20164. Les estimations de dose ADCI signalées auparavant reposaient sur non filtré (HC) ou sélectionné manuellement les images (CNL) et courbe a été effectuée à l’aide de la méthode des moindres carrés. Ici, la courbe d’étalonnage a été ajustée en utilisant la méthode du maximum de vraisemblance et un modèle de sélection d’image contenant 3 filtres FP + « groupe bin distance, images top 250 » a été appliqué avant l’estimation de la dose. Estimation de la dose UCL et LCL, réfèrent respectivement, pour la dose estimée supérieure et abaisser les limites de confiance à 95 % selon la nature du Poisson du rendement DC.* Qualité carrée chi de l’ajustement de la distribution théorique de Poisson ; NA : Résultats de dose manuellement présumée n’étaient pas disponibles. Estimation de la dose de rayonnement dans la gamme de linéarité de la courbe d’étalonnage (< 1 Gy) peuvent être effectuées avec le logiciel, mais un Sigma valeur 1.0 est recommandé pour réduire la fréquence des contrôleurs de domaine mal classés (Figure 8). Figure 8 : Captures d’écran de deux courbes d’étalonnage dérivé d’échantillons d’étalonnage HC à Sigma de différentes valeurs. (A) des échantillons de calibration HC : 0Gy, 2Gy, 3Gy, 4Gy et 5Gy chez Sigma = 1,5. Échantillons de calibrage pour le HC (B) : 0Gy, 0.25Gy, 0.5Gy, 0.75Gy, 1Gy, 2Gy, 3Gy, 4Gy, et 5Gy à l’aide de SVM Sigma = 1,0. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure. Ces analyses indiquent qu’il y a petit, mais acceptables différences physique et biologiques présumée dose interprétée par des experts et par le logiciel. La différence entre un manuel ou un logiciel estimation de la dose de physique est dénommée le « erreur ». L’erreur dans les doses présumées d’échantillons marqués manuellement par SC et CNL est ≤0, 3 Gy. Traitement automatique par le logiciel est moins précis que les experts, mais généralement dans les limites de triage spécifié par l’AIEA de ± 0,5 Gy3. Pour la plupart des échantillons essayés aux tableaux 2 et 3, le logiciel produit de bons résultats dans ce seuil. Toutefois, HCS07 et CNLS01 présentent un pauvre d’ajustement à la distribution de Poisson, ce qui suggère qu’il y avait des problèmes potentiels dans l’image et qualité de DC dans ces échantillons qui n’ont été réglés par application de l’image et les modèles de sélection FP. Le seuil de signification de valeur p semble être trop strictes dans le cas de HCS05, où le logiciel déterminé avec précision la dose correcte.

Discussion

Fonctionnalités et limitations du logiciel

Le protocole décrit dans le présent document présente la procédure par étapes typique utilisée dans ADCI pour importer et traiter des images de métaphase cytogénétiques, créer des courbes d’étalonnage de rayonnement et estimer la dose biologique chez des individus ou des échantillons exposés à l’inconnu niveaux de rayonnement. Cependant, il n’est pas nécessaire d’exécuter ces instructions dans l’ordre. Par exemple, de nombreux échantillons de dose inconnue peuvent être traitées et analysées à l’aide de la courbe d’étalonnage précalculées même. En outre, une fois que le traitement est terminé, la sélection de l’image et le DC filtrage des modèles peuvent être itéré par l’utilisateur. Application d’un modèle de sélection d’image appropriée dépend des caractéristiques et automatisée de la qualité de l’image métaphase, qui à son tour s’appuie sur le protocole de laboratoire utilisées pour préparer les cellules et les critères de rigueur utilisées pour sélectionner des cellules avec systèmes de capture de métaphase. Morphologies de chromosome différera entre biodosimétrie et laboratoires de cytogénétiques, et par conséquent, les modèles de sélection d’image devraient être évaluées par l’utilisateur à déterminer si les modèles de sélection image prédéfinis fournis avec le logiciel sera suffisantes pour produire des estimations de la dose exacte, ou si personnalisé modèles définis par l’utilisateur seuils doivent être créées. Selon notre expérience, l’efficacité des modèles de sélection d’image est influencée par la source et la qualité de l’image de la cellule. Les utilisateurs peuvent concevoir leurs propres critères de sélection d’image à l’aide de différentes combinaisons de filtres pour éliminer les fausses positifs DCs et modèles de sélection d’image et les valeurs seuils correspondants pour sélectionner les images souhaitées. Il y a flexibilité en entrée de courbes d’étalonnage et d’estimation de la dose, comme les coefficients de la courbe quadratique linéaire et fréquences DC peuvent être modifiés ou saisies manuellement.

Bien que le logiciel est entièrement automatisé, les images peuvent être manuellement revus et sélectionnés. Cette fonctionnalité est disponible à inclure ou à supprimer les images individuellement traitées grâce à la fonction visionneuse Microscope dans l’interface utilisateur principale. Néanmoins, en raison de l’automatisation, le logiciel est significativement plus efficace contre le Guide de notation des images de la métaphase et comptage DCs. Un échantillon composé de 1000 images peut être traité dans 20 (tiff) à 40 min (jpg) sur une station de travail multi-core. Ce logiciel sera particulièrement utile dans des situations urgentes ou beaucoup de travail, tels que les événements dans lequel plusieurs personnes ont été exposés ou étaient soupçonnés d’avoir été exposé à des radiations, ou où périmable diagnostique et traitement les décisions sont critiques.

Détection d’un débit élevé et une précision de DCs comme estimation de la dose sont nécessaires pour l’évaluation de rayonnement sans surveillance. Autres solutions de rechange disponibles au logiciel ne remplissent pas ces deux exigences. Une analyse cytogénétique (DCScore, métasystèmes¹⁷) assistée par utilisateur, basé sur une image système nécessite une vérification manuelle des candidats DCs, en raison d’une erreur haute taux imputable à non corrigée chevauche entre les chromosomes et le système ne détermine pas dose de rayonnement. DCScore ne serait pas aussi efficace que l’ADCI dans un événement de rayonnement impliquant un grand nombre de personnes potentiellement exposées. Systèmes de microscope grande ouverture peuvent recueillir des images de plusieurs métaphase cellules¹⁸, cependant, ils ne pas les analyser. « CABAS »¹⁹ et²⁰ « Estimation de la Dose » de logiciels peuvent générer d’étalonnage courbes et estimation de dose, mais ne score pas de contrôleurs de domaine. Autres essais de biodosimétrie qui ne reposent pas sur une analyse DC incluent H2AX fluorescence, sondes d’hybridation in situ fluorescence avec ADN ciblées spécifiques de chromosomes, expression génique, test du micronoyau et urine et biomarqueurs respiratoires. Ces méthodes sont moins précis et moins sensible aux rayonnements ionisants, peuvent être plus coûteux, dans certains cas, prennent beaucoup plus de temps et n’ont généralement pas été normalisés à travers de multiples laboratoires de référence. La plupart de ces techniques ne détecte pas les réponses de rayonnement stable, afin qu’ils ne peuvent pas être utilisés pour évaluation à long terme (> post-exposition 7 jours) de la dose de rayonnement. En revanche, cela peut évaluer des individus vers le haut à l’exposition après 90 jours et peut traiter les données de n’importe quel microscope de laboratoire de cytogénétique système d’imagerie. Toutefois, si un échantillon est prélevé > 4 semaines après l’exposition, sensibilité est réduite en raison de la désintégration des aberrations dicentriques¹^,²^,³ et le logiciel ne corrige pas actuellement les fréquences DC pour les retards dans l’échantillonnage personnes exposées.

Ce logiciel a quelques limitations. Les modèles existants de sélection image sélectionner pour la plupart des images de métaphase acceptable, mais dans certains cas, ne parviennent pas à éliminer des images peu satisfaisantes, qui peuvent réduire l’exactitude de la détection de DC. C’est toujours une question ouverte comment concevoir un modèle de sélection d’image satisfaisante qui élimine toutes les cellules en métaphase inadaptés. Le logiciel fournit des estimations précises pour les échantillons exposés à des doses de rayonnement plus élevées (≥ 2 Gy). Malgré des progrès considérables en réduisant le nombre de faux positifs DCs¹⁶, ces objets n’ont pas été éliminés. Abaisser les cellules en métaphase qualité à dose faible rayonnement (en particulier < 1 Gy) sont plus sujettes aux fausses détections positives de DC. Par conséquent, faible dose ne sont pas présentées lors de la génération de la courbe d’étalonnage utilisée pour l’estimation de la dose des échantillons pour essai HC. Si vous souhaitez une courbe contenant des échantillons de faible dose, une valeur inférieure à SVM Sigma réduit les fausses chiffres positifs dans des échantillons de faible dose mais peut entraîner des rendements plus faibles de DC dans les échantillons de dose élevée. La figure 8 compare la courbe HC utilisée pour l’estimation de la dose (Sigma = 1,5) avec une courbe d’étalonnage s’inscrivent avec des échantillons de la plus faible dose à plus faible valeur de sigma SVM (1.0). Dans les échantillons avec un nombre insuffisant de cellules en métaphase et/ou images de métaphase de qualité médiocre, il peut être pas possible d’estimer avec précision les risques biologiques à faible dose, entraînant potentiellement des déviations physique dose supérieure à 0,5 Gy.

Le logiciel peut évaluer précisément pas des types de rayonnement si leurs courbes dose-réponse mieux ajustement un modèle linéaire ou quasi-linéaire. Jusqu’ici, il a été testé qu’avec les échantillons exposés à X et rayons Gamma. Si une autre source de rayonnement est examinée, les utilisateurs doivent s’assurer d’échantillons d’étalonnage et d’essai sont exposés au même type de rayonnement. Le logiciel utilise le maximum de vraisemblance ou moindres carrés raccord pour construire une courbe dose-réponse à l’aide d’un modèle linéaire quadratique. Il n’y a actuellement aucune option pour imposer une stricte linéaire ajustement de la courbe, approprié pour les expositions de particules de haute énergie, toutefois une telle fonctionnalité sera disponible dans le futur.

Développement futur

Nos efforts sont concentrent sur l’amélioration des modèles de sélection d’image et de mesure de dose précise, en particulier des échantillons exposés à des doses de rayonnement faible. Versions logicielles ultérieures fournira des mesures de l’écart-type sur les estimations de la dose et intervalles de confiance sur les courbes d’étalonnage. En outre, une calcul haute-performance version du logiciel pour le supercalculateur Blue Gene (BG/Q, IBM) est en cours d’élaboration pour l’évaluation opportune des personnes exposées à un événement de rayonnement du grand nombre de victimes. Certains composants du logiciel ont déjà été testées et déployées sur cette plate-formeLass = « xref » > 11.

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Nous sommes reconnaissants à Dr Ruth Wilkins, de radiobiologie et de Division de la Protection à Santé Canada et Farrah Flegal, laboratoires nucléaires canadiens et leur personnel de laboratoire pour l’accès aux données d’image de métaphase de leurs laboratoires de cytogénétique biodosimétrie. Cet article a été pris en charge par un contrat de construction dans le programme d’Innovation du Canada à CytoGnomix (n° de série EN579-172270/001/SC). La version initiale de l’ADCI et développement d’algorithmes ont été pris en charge par le Fonds d’Innovation de l’ouest ; Sciences naturelles et en génie conseil de recherches du Canada (CRSNG découverte Grant 371758-2009) ; U.S. Public Health Service (DART-DOSE CMCR, 5U01AI091173-0) ; la Fondation canadienne pour l’Innovation ; Chaires de recherche du Canada et CytoGnomix Inc.

Materials

Automated Dicentric Chromosome Identifier and Dose Estimator (ADCI)	CytoGnomix	NA	ADCI software is released in a binary installation package file for Microsoft Windows 7, 8, 8.1 and 10; 235 Mb of disk storage are required for a typical installation. The software has been tested with Intel or AMD x86-64 processors; at least 1 Gb RAM is recommended. Analyses have been benchmarked on a computer configured with an Intel I7 processor and 16 Gb RAM. Operation of ADCI requires an active license and a USB-based hardware dongle, which must remain plugged in while the software is executing. The dongle encodes the software expiry date. Each time the software is started, this date is read. The software will allow access to the program if the current date and time precedes the expiration time-date stamp. Extending an expired software license can be accomplished by obtaining a new dongle or by renewing the license with an updated key at startup.
Digital images of metaphase cell nuclei	Examples: Metasystems, Leica Microsystems	M-Search (Metasystems), Cytovision (Leica) software	High resolution TIFF format; typically >250 digital images generated with a microscope imaging capture system (minimum 63x magnification objective, 10x magnification ocular).
MSI Leopard Pro (recommended, optional)	Micro-Star International	MSI GP62 6QF 480CA Leopard Pro	Multi-core performance workstation.

Referências

Brewen, J. G., Preston, R. J., Littlefield, L. G. Radiation-Induced Human Chromosome Aberration Yields Following an Accidental Whole-Body Exposure to60 Co γ-Rays. Radiat Res. 49 (3), 647-656 (1972).
Bender, M. A., Gooch, P. C. Persistent Chromosome Aberrations in Irradiated Human Subjects. Radiat Res. 16 (1), 44-53 (1962).
INTERNATIONAL ATOMIC ENERGY AGENCY. . Cytogenetic Dosimetry: Applications in Preparedness for and Response to Radiation Emergencies. , (2011).
Rogan, P. K., Li, Y., Wilkins, R. C., Flegal, F. N., Knoll, J. H. M. Radiation Dose Estimation by Automated Cytogenetic Biodosimetry. Radiat Prot Dosimetry. 172 (1-3), 207-217 (2016).
Arachchige, A. S., Samarabandu, J., Knoll, J., Khan, W., Rogan, P. An image processing algorithm for accurate extraction of the centerline from human metaphase chromosomes. 2010 IEEE International Conference on Image Processing. , 3613-3616 (2010).
Arachchige, A. S., Samarabandu, J., Knoll, J., Khan, W., Rogan, P. An Accurate Image Processing Algorithm for Detecting FISH Probe Locations Relative to Chromosome Landmarks on DAPI Stained Metaphase Chromosome Images. 2010 Canadian Conference on Computer and Robot Vision. , 223-230 (2010).
Arachchige, A. S., Samarabandu, J., Rogan, P. K., Knoll, J. H. M. Intensity integrated Laplacian algorithm for human metaphase chromosome centromere detection. 2012 25th IEEE Canadian Conference on Electrical and Computer Engineering (CCECE). , 1-4 (2012).
Li, Y., et al. Towards large scale automated interpretation of cytogenetic biodosimetry data. 2012 IEEE 6th International Conference on Information and Automation for Sustainability. , 30-35 (2012).
Ranjan, R., Arachchige, A. S., Samarabandu, J., Knoll, J. H. M., Rogan, P. K. Automatic Detection of Pale Path and Overlaps in Chromosome Images using Adaptive Search Technique and Re-thresholding. International Conference on Computer Vision Theory and Applications. , 462-466 (2017).
Arachchige, A. S., Samarabandu, J., Knoll, J. H. M., Rogan, P. K. Intensity Integrated Laplacian-Based Thickness Measurement for Detecting Human Metaphase Chromosome Centromere Location. IEEE Trans Biomed Eng. 60 (7), 2005-2013 (2013).
Rogan, P. K., et al. Automating dicentric chromosome detection from cytogenetic biodosimetry data. Radiat Prot Dosimetry. 159 (1-4), 95-104 (2014).
Li, Y., Knoll, J. H., Wilkins, R. C., Flegal, F. N., Rogan, P. K. Automated discrimination of dicentric and monocentric chromosomes by machine learning-based image processing. Microsc Res Tech. 79 (5), 393-402 (2016).
Subasinghe, A., et al. Centromere detection of human metaphase chromosome images using a candidate based method. F1000Res. 5, 1565 (2016).
Wilkins, R. C., et al. Evaluation of the annual Canadian biodosimetry network intercomparisons. Int J Radiat Biol. 91 (5), 443-451 (2015).
Liu, J., Li, Y., Wilkins, R., Flegal, F., Knoll, J. H. M., Rogan, P. K. Accurate Cytogenetic Biodosimetry Through Automation Of Dicentric Chromosome Curation And Metaphase Cell Selection. F1000Research. 6, 1396 (2017).
Schunck, C., Johannes, T., Varga, D., Lörch, T., Plesch, A. New developments in automated cytogenetic imaging: unattended scoring of dicentric chromosomes, micronuclei, single cell gel electrophoresis, and fluorescence signals. Cytogenet Genome Res. 104 (1-4), 383-389 (2004).
Ramakumar, A., Subramanian, U., Prasanna, P. G. S. High-throughput sample processing and sample management; the functional evolution of classical cytogenetic assay towards automation. Mutat Res Genet Toxicol Environ Mutagen. 2015, 132-141 (2015).
Deperas, J., et al. CABAS: a freely available PC program for fitting calibration curves in chromosome aberration dosimetry. Radiat Prot Dosimetry. 124 (2), 115-123 (2007).
Ainsbury, E. A., Lloyd, D. C. Dose estimation software for radiation biodosimetry. Health Phys. 98 (2), 290-295 (2010).

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Shirley, B., Li, Y., Knoll, J. H., Rogan, P. K. Expedited Radiation Biodosimetry by Automated Dicentric Chromosome Identification (ADCI) and Dose Estimation. J. Vis. Exp. (127), e56245, doi:10.3791/56245 (2017).