Expedited Radiation Biodosimetry by Automated Dicentric Chromosome Identification (ADCI) and Dose Estimation

Ben Shirley; Yanxin Li; Joan H.M. Knoll; Peter K. Rogan

doi:10.3791/56245

JoVE Journal > Genetics

Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.

Genética

Versnelde straling Biodosimetry geautomatiseerde door Dicentric chromosoom identificatie (ADCI) en de schatting van de dosis

Published: September 04, 2017

doi:

10.3791/56245

Ben Shirley*¹, Yanxin Li*¹, Joan H.M. Knoll^1,2, Peter K. Rogan^1,3

¹CytoGnomix Inc., ²Department of Pathology and Laboratory Medicine,Western University, ³Department of Biochemistry,Western University

Summary

De bepaling van de cytogenetische dicentric chromosoom (DC) kwantificeert blootstelling aan ioniserende straling. De geautomatiseerde Dicentric chromosoom id en dosis Estimator software schat nauwkeurig en snel biologische dosis van DCs in metafasecellen. Het bod chromosomen en andere objecten onderscheidt van DCs, en schat van biologische stralingsdosis van de frequentie van DCs.

Abstract

Biologische stralingsdosis kan van dicentric chromosoom frequenties in de metafasecellen worden geschat. Het uitvoeren van deze cytogenetische dicentric chromosoom testen is traditioneel een handmatig, arbeidsintensief proces niet geschikt voor het afhandelen van de omvang van de monsters die onderzoek in de nasleep van een ongeval massa-evenement vereisen. Geautomatiseerde Dicentric chromosoom-id en dosis Estimator (ADCI) software automatiseert dit proces door het onderzoek van sets van metafase beelden met behulp van machine learning gebaseerde image processing technieken. De software selecteert passende beelden voor analyse door het verwijderen van ongeschikt beelden, classificeert elk object als een centromeer-bevattende chromosoom of niet-chromosoom, verder onderscheidt chromosomen als bod chromosomen (MCs) of dicentric chromosomen (DCs), bepaalt de frequentie van de DC binnen een monster, en schat van biologische stralingsdosis door DC samplefrequentie te vergelijken met de kalibratiekrommen die zijn berekend met behulp van kalibratie monsters. Dit protocol beschrijft het gebruik van ADCI software. Meestal worden zowel kalibratie (bekende dosis) en test (onbekende dosis) sets van metafase beelden geïmporteerd voor het uitvoeren van nauwkeurige dosis schatting. Optimale beelden voor analyse kunnen worden gevonden automatisch met behulp van vooraf ingestelde beeldfilters of kunnen ook worden gefilterd via handmatige inspectie. De software verwerkt afbeeldingen in elk monster en DC frequenties op verschillende niveaus van vergaande subopties overwogen voor het bellen van DCs, met behulp van een machine learning aanpak worden berekend. Lineaire-kwadratische kalibratiekrommen worden gegenereerd op basis van DC frequenties in kalibratie monsters blootgesteld aan bekende fysieke doses. Doses van analysemonsters blootgesteld aan onzeker stralingswaarden zijn geschatte vanuit hun DC frequenties met behulp van deze kalibratiekrommen. Verslagen kunnen worden gegenereerd op verzoek en verstrekken samenvatting van de resultaten van een of meer monsters, van één of meer kalibratiekrommen of schatting van de dosis.

Introduction

Straling biodosimetry maakt gebruik van biologische markers, meestal chromosoomafwijkingen zoals dicentric chromosomen (DCs) en chromosoom translocaties voor het meten van stralingsdoses die personen zijn blootgesteld aan. Een biologisch geabsorbeerde dosis kan afwijken van de fysieke dosis gemeten door instrumenten als gevolg van de variabiliteit tussen personen. Ook kan straling van een bepaalde fysieke dosis produceren verschillende biologische risico’s als gevolg van onderliggende fysiologische of ecologische omstandigheden. Kennis van de biologische dosis is van bijzonder belang voor zowel de diagnose en de behandeling.

De DC-bepaling is de gouden standaard van de World Health Organization (WHO) en het Internationaal Atoomenergie Agentschap (IAEA) voor de beoordeling van de blootstelling aan biologische straling in mensen. Het was de eerste bepaling geadviseerd door de IAEA en die voor straling dosis beoordeling. DC frequentie is ongeveer 4 weken na straling blootstelling¹ relatief stabiel en hun kwantitatieve correlatie met de uitgezonden stralingsdosis is nauwkeurig, waardoor DCs de ideale biomerker. De verhouding tussen de stralingsdosis (waarnaar wordt verwezen in Gray [Gy] eenheden), en DC frequentie (aantal DCs per cel genoemd) kan worden uitgedrukt als lineaire-kwadratische functie.

De cytogenetische test DC geweest de industrie standaard voor ongeveer 55 jaar². Handmatig is uitgevoerd waarbij 1-2 dagen voor het analyseren van Microscoop gegevens uit een enkel bloedmonster. Enkele honderden tot enkele duizenden beelden nodig zijn om de blootstelling aan straling afhankelijk van de dosis³nauwkeurig te schatten. Bij toepassing van doses meer dan 1 Gy, IAEA raadt aan een minimum van 100 DCs worden gedetecteerd. Onderzoek van 250-500 metafase beelden is gebruikelijk in biodosimetry cytogenetische laboratoria. Voor monsters met belichtingen < 1 Gy, 3000-5000 beelden worden voorgesteld als gevolg van de lagere waarschijnlijkheid van DC vorming. In beide gevallen is het een arbeid-intensieve taak.

Cytogenetische biodosimetry laboratoria hun eigen maken in vitro straling biodosimetry kalibratiekrommen voordat de beoordeling van de biologische doses van analysemonsters. Bloedmonsters van normaal, controle personen zijn blootgesteld aan straling en lymfocyten zijn vervolgens gekweekt en chromosoom metafaseanalyse voorbereid. Met behulp van deze monsters, zijn biologische doses ontvangen geijkt aan de bekende fysieke doses wordt uitgestraald door een standaard stralingsbron. Na de metafase cel beelden zijn geregistreerd, deskundigen onderzoeken van beelden, tellen DCs en DC frequenties voor elk monster berekenen. Een kalibratiekromme is gebouwd door het aanbrengen van een lineaire-kwadratische curve op de DC-frequenties op alle doses. Posities in monster van individuen kunnen vervolgens worden afgeleid overeenkomen met de DC-frequenties aan de geijkte doses op de curve of door te geven hen in de corresponderende lineaire kwadratische formule.

We hebben zowel de detectie van DCs geautomatiseerd en dosis wil versnellen deze procedure met behulp van software. Geautomatiseerde Dicentric chromosoom id dosis Estimator (ADCI) machine leren gebaseerde beeldverwerking technieken gebruikt om te ontdekken en discrimineren dicentric chromosomen (DCs) van bod chromosomen (MCs) en andere objecten en automatiseert straling schatting van de dosis. De software heeft tot doel te aanzienlijk verminderen of elimineren de noodzaak voor handmatige verificatie van DC graven en te versnellen van de schatting van de dosis via automatisering. Het is ontwikkeld met medewerking van biodosimetry referentielaboratoria op gezondheid Canada (HC) en Canadese nucleaire laboratoria (CNL). Hun feedback zal ervoor zorgen dat de prestaties zullen blijven voldoen aan de criteria van de IAEA voor deze test.

De software voert de volgende functies: 1) filteren DCs en selecteren van optimale-metafase cel beelden voor analyse, 2) chromosoom erkenning, DC detectie en bepaling van de frequentie van de DC, en 3) raming van de stralingsdosis van de dosis-gekalibreerd, cytogenetische straling gegevens. Deze software verwerkt groepen metafase afbeeldingen van dezelfde individuele (genoemd een monster), telt het aantal DCs in elk met afbeelding technieken voor gegevensverwerking en de geschatte stralingsdosis ontvangen door elk monster in eenheden van grijswaarden (Gy) retour.

De software is ontworpen om een bereik van chromosoom structuren, graven en dichtheden. Echter presteert het algoritme optimaal in de metafase beelden met een in de omgeving van volledige aanvulling van goed gescheiden, lineaire chromosomen⁴. Beelden met zeer overlappende sets chromosomen, meerdere cellen, onvolledige metafasecellen, zuster chromatide scheiding, kernen, niet-chromosomale objecten en andere gebreken kunnen verminderen de nauwkeurigheid van het algoritme. Afbeelding selectie modellen en andere object segmentatie drempels op de meeste sub-optimale beelden en valse positieve DCs filteren kunnen gewijd.

Dicentric chromosoom detectie wordt uitgevoerd wanneer een afbeelding wordt verwerkt. Het algoritme probeert om te bepalen welke objecten in een afbeelding zijn chromosomen en zoekt vervolgens de twee regio’s meest waarschijnlijk centromeren op elk chromosoom. Vervolgens een reeks van verschillende Support Vector Machine (SVM) leren modellen onderscheiden chromosomen als DCs of normaal, bod chromosomen. De modellen van de SVM verschillen in gevoeligheid en specificiteit van de detectie van de DC (zie stap 3.1.4 hieronder), die kan invloed hebben op de DC-frequenties die worden bepaald bij een steekproef.

ADCI verwerkt sets van Giemsa – (of DAPI) gekleurd metafase digitale beelden (in TIFF of JPG-formaat) van één of meer steekproeven. De software analyseert DCs in zowel kalibratie monsters en analysemonsters. De fysieke doses (in Gy) van kalibratie monsters zijn bekend en worden gebruikt in de generatie van een kalibratiekromme. De fysische en biologische doses van personen met een onbekende posities zijn afgeleid door de software van de machine-gegenereerde ijkcurve. Hoewel laboratoria vergelijkbare technieken gebruiken, variëren de kalibratiekrommen uit verschillende laboratoria vaak³. Beide kalibratie curve en test samples uit hetzelfde laboratorium moeten worden verwerkt voor nauwkeurige dosis schatting van analysemonsters.

Deze software biedt schaalbaarheid voor snelheid en nauwkeurigheid welke adressen die de productiviteit moet omgaan met een gebeurtenis waarin veel mensen gelijktijdig moeten worden getest. Het werd ontwikkeld uit 2008-2017⁴^,⁵^,⁶^,⁷^,⁸^,⁹^,¹⁰^,¹¹^,¹² ^,,¹³. Met behulp van recente computerhardware, dit bureaubladPC-software kan verwerken en raming stralingsdosis in een patiënt monster van 500 metafase genoom equivalenten in 10-20 min ⁴. De code is gebaseerd op een set van eigen beeldsegmentatie en machine leren algoritmen voor analyse van het chromosoom. Deskundige analyse van elk chromosoom blootgesteld aan 3 Gy straling gaf vergelijkbare nauwkeurigheden aan ADCI. In een set van 6 monsters van de onbekende risico’s (vroeger in de uitoefening van een internationale vaardigheid), de software geschat doses binnen 0,5 Gy van de waarden die zijn verkregen door de handmatige controle van dezelfde gegevens door HC en CNL, die voldoet aan de eisen van de IAEA voor triage biodosimetry. Bovendien, interlaboratorium standaardisatie en uiteindelijk reproduceerbaarheid van dosis schat voordeel van het hebben van een gemeenschappelijke, geautomatiseerde DC scoren algoritme. Niettemin, de software laat aanpassing van beeld filteren en selectie criteria, zodat verschillen in chromosoom bereidingswijzen en kalibratie stralingsbronnen in aanmerking worden genomen.

Deze software is een grafische gebruikersinterface (GUI) – gebaseerd systeem dat analyseert sets van chromosoom beelden met Giemsa (of DAPI) – gekleurd metafasecellen voor afwijkingen die het gevolg zijn van blootstelling aan ioniserende straling. De afbeelding sets zijn digitaal gefotografeerd met een licht (of epifluorescerende) Microscoop systeem en elke set komt overeen met een ander monster. De software maakt gebruik van beeldverwerking technieken te detecteren en discrimineren van DCs van MCs en andere objecten. Empirisch-afgeleide segmentatie filters elimineren vervolgens automatisch valse positieve DCs zonder echte DCs. Tot slot, de software automatisch gefilterd uit ongewenste afbeeldingen gebaseerd op diverse afbeeldingseigenschappen slechte kwaliteit metafase beelden met precomputed (of gebruiker opgegeven) beeld selectie modellen gevonden. Deze afbeeldingen bevatten die met overmatige of onvoldoende aantal “luidruchtig” objecten, meerdere overlappende chromosomen, afbeeldingen ontbreekt metafase chromosomen, buitensporige aantal zuster chromatiden⁴. De automatisch curator afbeeldingsgegevens worden gebruikt voor het genereren van de kalibratiekromme dosis van monsters van bekende stralingsdosis en schatting van de blootstelling van analysemonsters blootgesteld aan onbekende doses worden gebruikt.

Output van de software kan worden bekeken en opgeslagen als: 1) tekst gebaseerde uitvoer weergegeven in de console, 2) percelen die kunnen worden opgeslagen als beelden en 3) rapporten in HTML-indeling. Vele aspecten van de software kunnen worden aangepast aan de specifieke behoeften van verschillende laboratoria. Individuele laboratoria verstrekken gewoonlijk zowel kalibratie en test monsters opgesteld en verzameld op basis van de cytogenetische protocol in dat laboratorium gevalideerd. Hierdoor behoudt uniformiteit van de bereiding van de monsters en kunt kalibratiekrommen gegenereerd op basis van kalibratie monsters zinvol om te testen monsters afgeleid met behulp van hetzelfde protocol worden toegepast. Kalibratiekrommen kunnen ook worden gemaakt uit kromme coëfficiënten of DC frequenties bij gedefinieerde doses. De meest nauwkeurige schattingen van de dosis worden verkregen door te filteren op lagere kwaliteitsbeelden en valse positieve DCs (FPs). Selectie van optimale beeld deelverzamelingen binnen elk monster wordt bereikt met behulp van ‘Image selectie modellen’, die subpar beelden die neiging elimineren om FPs. Een reeks van vooraf gevalideerde modellen zijn opgenomen in de software, maar extra modellen met aangepaste drempels en filters kunnen worden gemaakt en opgeslagen, door de gebruiker.

Zodra de software met succes is geladen, de belangrijkste grafische gebruikersinterface (GUI) wordt gepresenteerd (Zie Figuur 1). Vanuit deze interface, monsters, elk bestaande uit een map met beeldbestanden van metafase cel, kunnen worden geselecteerd en verwerkt om te identificeren DCs kalibratiekrommen kunnen worden gemaakt en kan worden vergeleken en blootstelling stralingsdosis van monsters kan worden vastgesteld.

Figuur 1: De belangrijkste sectoren van de grafische User Interface omvatten: een lijst van monsters (1), een lijst van kalibratie curven (2), het proces wachtrij (3), die toezicht houdt op de status van DC detectie in elke set afbeeldingen van elk monster, een perceel (4), die bevat een overzicht van statistische of andere kwantitatieve eigenschappen van een reeks beelden in monsters of kalibratiekrommen en een console (5) waarin beschrijvende tekst als uitgangen van elke bewerking die wordt uitgevoerd door het programma worden weergegeven. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Protocol

1. import en proces monsters Klik ' monsters ' in de menubalk en selecteer ' nieuwe steekproef '. Blader naar een geschikte map met een groep metafase afbeeldingen en klik op ' map selecteren '. Typ een unieke ID voor het monster in de ' geeft u een unieke ID voor de nieuwe monster ' tekstveld. Deze ID zal het identificeren van het monster in de werkruimte. Monster-id moeten bevatten alfanumerieke, ' _ ', of '-' alleen tekens. Opname van de bron laboratorium en fysieke dosis (voor kalibratie monsters) in het monster ID is bekend. (Optioneel) Geef een beschrijving van het monster indien gewenst binnen de ' beschrijving van het monster (optioneel) ' tekstgebied. Klik op ' OK ' de nieuwe monster toevoegen aan de werkruimte. Herhaal stap 1.1 tot en met 1.4 toe te voegen aanvullende monsters. Een minimum van 3 kalibratie monsters (zeven of meer aanbevolen 3 van verschillende belichtingen) en ten minste één monster uit te voeren van de schatting van de dosis. Markeer alle monsters gemaakt in stap 1.1 tot en met 1.5 in de ' monsters ' lijst en klik op ' toevoegen elk exemplaar naar proces wachtrij ' () pictogram. Klik ' alle monsters in de wachtrij te verwerken ' () pictogram voor het verwerken van alle monsters achter elkaar in de wachtrij – een ' ADCI verwerking ' dialoogvenster verschijnt met alle monsters in de wachtrij samen met een vooruitgang bar. Wanneer alle monsters hebt voltooid verwerking, klikt u op de . Monsters nu opslaan, of klik op ' opslaan in een verwerkte monster een voorbeeldbestand van ADCI ' () pictogram om een verwerkte monster later opslaan. 2. bekijken en selectie van afbeeldingen (optioneel, aanbevolen stap) Opmerking: deze stap beschrijving van het gebruik van de metafase Image Viewer en het scheppen van een image Keuzemodel arbeidsvoorwaarden. Sommige gevalideerde beeld selectie modellen zijn opgenomen in de software die kan worden gebruikt in de kalibratie kromme generatie en schatting van de dosis. Dus, deze stap is niet vereist, maar het kan worden gebruikt als een beschrijving van de stappen die nodig zijn om dit te doen indien gewenst gids. Markeer een monster in de ' monsters ' lijst, klikt u op ' monsters ' in het menu bar, en selecteer ' Image View ' om te openen de ' metafase Image Viewer ' . Navigeren tussen beelden Kies een afbeelding uit de vervolgkeuzelijst om een specifiek beeld te bekijken. Klik op de pijlpictogrammen-links en rechts om te bladeren door afbeeldingen. Selecteer een SVM Sigma-waarde uit de vervolgkeuzelijst DC detectie om resultaten te bekijken op deze Sigma-waarde. Selecteer " Unprocessed " uit de dropdown box bekijken ruwe beelden zonder chromosoom omtrekken. Controleren de ' omkeren ' checkbox kleur en helderheid waarden voor elke pixel in de afbeelding omkeren. Controleren de ' afbeelding in de monitorlijst ' checkbox om toe te voegen van de zichtbare afbeelding een ' monitorlijst '. Klik op ' the Watch-lijst naar een tekstbestand opslaan ' () pictogram op te slaan van de namen van alle afbeeldingen in de horloge-lijst naar een tekstbestand. Image selectie modellen Klik ' alle foto’s ' (de standaardinstelling) om op te nemen van alle afbeeldingen in het vak afbeelding selectie dropdown. Observeren van de tekst naast ' beelden opgenomen ' om te ontdekken de breuk van beelden geselecteerd door de momenteel toegepaste afbeelding keuzemodel. Klik op ' weergave opgenomen beelden ' op te nemen alleen deze beelden die niet zijn uitgesloten door de afbeelding Keuzemodel arbeidsvoorwaarden in het uitklapmenu. Klik op ' weergave uitgesloten beelden ' te nemen beelden die zijn uitgesloten door de toegepaste afbeelding Keuzemodel arbeidsvoorwaarden in het uitklapmenu. Check de ' uitsluiten ' checkbox te handmatig sluiten een enkele afbeelding. Opmerking: Handmatig uitgesloten afbeeldingen worden teruggezet naar de geselecteerde afbeelding instellen als een afbeelding Keuzemodel arbeidsvoorwaarden wordt vervolgens toegepast. Een selectie van beelden opslaan door te klikken op de ' selectie opslaan ' knop. Voer een bestandsnaam voor de opgeslagen selectie wanneer daarom wordt gevraagd. Klik op ' selectie laden ' toe te passen van een eerder opgeslagen selectie. Klik op ' Afbeeldingfilters toepassen ' om te openen de ' Filter toepassen gebaseerde beeld Keuzemodel arbeidsvoorwaarden aan huidige monster ' dialoog, die maakt, opslaat, of toepassing van de criteria voor de selectie van de metafase beelden in een monster. Selecteer een afbeelding Keuzemodel arbeidsvoorwaarden in de ingevulde lijst. Klik op ' OK ' toe te passen van het huidige model. Geef een omschrijving voor een gewenste nieuw model, definiëren ' uitsluiting beeldfilters ', definiëren ' afbeelding Ranking en integratie ', en klik op ' Model selectie opslaan ' om een afbeelding te maken Keuzemodel. Opmerking: Definities van ' afbeelding Ranking en integratie ' methoden en elk ' afbeelding uitsluiting Filter ' kan worden gevonden in de software on line documentatie 14. 3. Generatie van de kromme (Recommended optional step) Curve kalibratie Wizard garanderen een minimum van drie kalibratie monsters zijn aanwezig in de werkruimte voordat u verdergaat. Klik op ' Wizards ' in de menubalk en selecteer ' Curve kalibratie ' om de Curve kalibratie Wizard te openen. Opmerking: Hoewel slechts drie monsters wiskundig vereist zijn om fit en berekenen van een ijkcurve, zeven of meer monsters verspreid over een aantal posities tussen 0 en 5 Gy worden aanbevolen. De extra monsters nodig zijn om te passen van de kalibratiekromme naar een lineaire-kwadratische dosis-respons, maar de optimale Sigma-waarden mogelijk lager om te bekomen van de curven die bruikbaar voor lage dosis schatting zijn (< 1 Gy); de optimale waarden van de Sigma voor doseringen boven deze drempel zijn verschillende (zie stap 3.1.4). Ga verder via de inleidende wizard scherm en plaats een vinkje naast elk gewenste kalibratie-monster. Geef voor elke kalibratie steekproef geselecteerd op deze manier, de fysieke dosis (Gy) het monster was blootgesteld aan binnen het veld van de aangrenzende tekst. Het volgende scherm van de wizard blijven. Selecteer een afbeelding Keuzemodel arbeidsvoorwaarden indien gewenst uit de lijst met modellen met vooraf ingestelde afbeelding selectie modellen gebundeld met de software naast eventuele handmatig gemaakte modellen. Het volgende scherm van de wizard blijven. Een SVM Sigma waarde selecteren in de vervolgkeuzelijst. Doorgaan naar het volgende scherm van de wizard . Opmerking: Een SVM Sigma 1.4 of 1.5 is de aanbevolen waarde voor schatting van de dosis > 1 Gy, en een waarde van 1,0 voor schattingen onder 1 Gy ( Figuur 2). Controleer alle voorgaande selecties op het scherm summary en klik op ' afwerking ' op en voltooi de wizard, veroorzaakt een prepopulatEd ' maakt een curve ' dialoogvenster moet worden weergegeven. Figuur 2: visualisatie van het Effect van het wijzigen van de waarde van de Sigma SVM van het algoritme op de ware positief (TP) en vals positief (FP) DC graven, de positief voorspellende Calue (PPV), en de echte positieve stem (TPR). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer. maken een kromme-dialoogvenster. (Sla deze stap als wizard werd gebruikt) Klik op ' curven ' in de menubalk en selecteer ' nieuwe Curve '. Kies ' montage bocht naar dosis-responsgegevens ' uit de dropdown box gepresenteerd in het dialoogvenster en klik op ' OK '. Geven een unieke identiteit voor de curve in de ' geeft u een unieke identiteit voor de nieuwe curve ' tekstvak binnen de ' maakt een curve ' dialoogvenster. (Facultatief) Typ een beschrijving voor de nieuwe curve binnen de ' toevoegen van een korte beschrijving voor de curve moet worden gemaakt ' tekstvak. (Skip de volgende stappen uit als de kromme wizard werd gebruikt voor het maken van een ijkcurve) curve waarden instellen. Opmerking: De wizard van de Curve kalibratie beschreven in stap 3.1 prepopulates velden in de ' maakt een curve ' dialoogvenster. De volgende stappen wordt beschreven hoe deze velden handmatig te vullen. Als de wizard werd gebruikt, kunnen sommige stappen nog steeds worden gevolgd indien gewenst om aanvullende gegevens toevoegen of verwijderen. Een SVM Sigma waarde selecteren in opties in de ' SVM ' dropdown box – het is ten zeerste aanbevolen dat de waarde van de Sigma hier gekozen overeenkomen met de waarde van de Sigma gekozen bij het gebruik van deze curve voor het uitvoeren van de schatting van de dosis. (Optioneel) Geef een keuzemodel afbeelding door te klikken op de ' bestand opgeven ' knop. Klik op ' Input ' een nieuwe lege vermelding toevoegen aan de lijst van de dosis-respons onder de rubriek ' Input reactie-dosis gegevens maken een kromme '. Voert u de dosis van een monster van de kalibratie in Gy in de rubriek ' dosis '. Enter ' reactie (DC/cel) ' ontleend aan voorbeelduitvoer binnen de console als een monster wordt gemarkeerd. Zoek de juiste DC/cel waarde voor de eerder geselecteerde SVM Sigma waarde vanuit de console of via de bijbehorende voorbeeldrapport (stap 5.1, indien beschikbaar) en voer het ter zake. Herhaal de vorige drie stappen totdat alle van de kalibratie monsters bijgekomen. Pers ' valideren gegevens ' om de inhoud van de reactie-dosis lijst correct is opgemaakt – controleren of alle velden in de lijst van de reactie-dosis zijn gemarkeerde groen die aangeeft validatiegegevens. Pers ' OK ' om af te ronden van de oprichting van de curve. Opslaan van de nieuwe curve in de ' Curve opslaan? ' dialoogvenster dat op dringende verschijnt ' OK '. Of klik op ' opslaan curve naar een bestand van de kromme ADCI ' () pictogram gemarkeerd binnen de ' curven ' lijst later. 4. Schatting van de dosis (Recommended optional step) dosis schatting Wizard Klik op ' Wizards ' in de menubalk en selecteer ' schatting van de dosis '. Ga verder door het scherm van de inleidende wizard en selecteer een eerder gemaakte kalibratiekromme uit de dropdown box – de eigenschappen worden weergegeven onder. Het volgende scherm van de wizard blijven. Plaatst u een vinkje naast de monsters van de onbekende blootstelling te nemen in de schatting van de dosis. Het volgende scherm van de wizard blijven. Let op de beschrijving en de eigenschappen van de afbeelding Keuzemodel arbeidsvoorwaarden tijdens de kalibratie kromme generatie toegepast. Let op dat het dezelfde afbeelding Keuzemodel arbeidsvoorwaarden wordt toegepast op de geselecteerde analysemonsters. Het volgende scherm van de wizard blijven. Opmerking: Hieronder de beschrijving van de afbeelding Keuzemodel arbeidsvoorwaarden, hetzelfde model is vooraf ingevuld en zal worden toegepast op de selectie analysemonsters. De dezelfde afbeelding Keuzemodel arbeidsvoorwaarden gelden voor kalibratie en test monsters. Hoewel het mogelijk is te gelden andere afbeelding selectie modellen door een ander model in de dropdown te selecteren, dit wordt niet aanbevolen. Selecteer een SVM Sigma-waarde in de dropdown. Het volgende scherm van de wizard blijven. Opmerking: De waarde van de SVM Sigma wordt gebruikt tijdens de kalibratie kromme generatie is vooraf ingevuld. Het wordt aanbevolen dat deze waarde ongewijzigd. Bekijk de vorige selecties op het scherm summary en klik op ' afwerking ' op en voltooi de wizard – een ingevulde ' dosis Calculator ' dialoogvenster verschijnt. Dosis Calculator (Sla deze stap over als wizard werd gebruikt) markeren van een ijkcurve uit de lijst met curven in de rubriek ' curven ', klikt u op ' curven ' in het menu bar, en selecteer ' Berekenen dosis ' om te openen de ' dosis Calculator ' dialoogvenster. (Overslaan deze stappen als wizard werd gebruikt) Stel waarden in voor de schatting van de dosis. Opmerking: De wizard van de schatting van de dosis beschreven in stap 4.1 prepopulates velden in de ' dosis Calculator ' dialoogvenster. De volgende stappen wordt beschreven hoe deze velden handmatig te vullen. Als de wizard werd gebruikt, kunnen sommige stappen nog steeds worden gevolgd indien gewenst om aanvullende gegevens toevoegen of verwijderen. Klik ' Gebruik elk exemplaar in de werkruimte te vullen DC frequenties ' () pictogram en hoogtepunt testopnames binnen de ' monsters verwerkt in ADCI Werkruimte ' lijst toe te voegen van de geselecteerde monsters naar de ' DC frequenties voor de schatting van de dosis ' lijst. Selecteer een model van de SVM Sigma waarde en beeld de selectie voor deze monsters uit de dropdown dozen. Opmerking: De waarde van een SVM Sigma overeenkomen met de waarde van de Sigma wordt gebruikt in de kalibratie kromme generatie is vereist voor nauwkeurige dosis schatting. De waarde van de Sigma die hoort bij de kalibratiekromme wordt weergegeven aan de onderkant van de ' dosis Calculator ' dialoogvenster. (optioneel) toevoegen extra monsters door de vorige twee stappen te herhalen. U kunt ook meerdere monsters tegelijk en door te wijzen op meerdere monsters in toevoegen de ' monsters verwerkt in werkruimte ' lijst. (optioneel) Klik op de ' de invoerwaarde van een DC-frequentie ' () pictogram handmatig in te voeren een DC frequentie niet geassocieerd met een monster indien gewenst – de nieuwe DC-frequentie zal worden toegevoegd aan de ' DC aberraties voor schatting van de dosis ' lijst. (optioneel) Dubbelklik het ' naam ' van een handmatig ingevoerde DC frequentie te wijzigen van de naam veld. (optioneel) hoogtepunt geschikte monsters en klik op ' verwijderen DC frequentie ' () pictogram verwijderen van monsters die zijn toegevoegd aan de ' DC Afwijkingen voor de schatting van de dosis ' lijst in fout. Klik op ' OK ' te sluiten de ' dosis Calculator ' en uitvoeren van de schatting van de dosis – resultaten zijn uitvoer naar de console. Zoals dosis schatting resultaten worden weergegeven in de console in tabelvorm voor elk monster, observeren ' DC frequentie ', ' SVM ', ' geschatte dosis ' (bevat de geschatte biologische dosis van het monster in Gy), en ' toegepast afbeelding Keuzemodel arbeidsvoorwaarden ' velden. 5. Rapportage Opmerking: de methode gebruikt om een rapport een naam en selecteer een map waarin het is opgeslagen is gemeenschappelijk voor alle rapporttypen. A ' rapportnaam ' moet worden verstrekt. Wanneer een rapport wordt gegenereerd, zal een map met rapportbestanden worden gemaakt met behulp van deze naam automatisch. Deze map zal worden geplaatst binnen is de ' verslag map '. Standaard, de ' verslag map ' is een map met de naam ' rapporten ' gevonden in de opgegeven tijdens de installatie gegevensmap. Voorbeeldrapport Klik op ' verslag ' in de menubalk en selecteer ' voorbeeldrapport ' om te openen de ' genereren voorbeeldrapport ' dialoogvenster. Voer een naam voor het rapport in de ' rapportnaam ' tekstveld. Klik op ' bladeren ' om te wijzigen de ' verslag map ' indien gewenst. Selecteer ten minste één verwerkte monster wilt opnemen in het rapport door het plaatsen van een vinkje naast de nodige monsters in de ' monsters ' lijst. Geven een bereik van SVM Sigma waarden voor die voor het genereren van DC distributie percelen door het selecteren van waarden in ' Min ' en ' Max ' dropdown dozen binnen de ' distributie van DCs in monster ' gebied. DC distributie percelen van het rapport uitsluiten indien gewenst door unchecking de ' omvatten ' checkbox in de ' distributie van DCs in monster ' gebied. Opgeven welke percelen met filter statistieken wilt opnemen in het rapport door het plaatsen van de vinkjes naast passende kavels in de ' Selecteer percelen ' gebied. Klik op ' OK ' om het rapport te genereren. Curve verslag Klik op ' verslag ' in de menubalk en selecteer ' Curve verslag ' om te openen de ' kromme rapport genereren ' dialoogvenster. Voer een naam voor het rapport in de ' rapportnaam ' tekstveld. Klik op ' bladeren ' om te wijzigen de ' verslag map ' indien gewenst. Selecteer ten minste één bocht naar het opnemen in de lijst door het plaatsen van een vinkje naast de juiste rondingen in de ' bochten om te worden opgenomen in de lijst Selecteer ' lijst. Klik op ' OK ' om het rapport te genereren. Dosis schatting verslag uitvoeren dosis schatting stappen die worden beschreven in sectie 4. Opmerking: Dosis schatting rapporten worden gegenereerd uit de resultaten in de plot en console gebieden aangegeven. Dus, een dosis schatting perceel aanwezig moet zijn in het tekengebied geplaatst op het moment een rapport gegenereerd. Klik op ' verslag ' in de menubalk en selecteer ' dosis schatting verslag ' om te openen de ' genereren dosis schatting verslag ' dialoogvenster. Voer een naam voor het rapport in de ' rapportnaam ' tekstveld. Klik op ' bladeren ' om te wijzigen de ' verslag map ' indien gewenst. Klik op ' OK ' om het rapport te genereren. 6. Controle mogelijkheden Opmerking: de software registreert alle bewerkingen uitgevoerd tijdens een sessie in een logboekbestand. Het programma biedt een accessoire software-applicatie waarmee de log-bestanden worden bekeken, gezocht, gebruikt voor het evalueren van de integriteit van een analyse en in sommige gevallen, om te herstellen van de voorbeeldgegevens uit onvolledige of voortijdig beëindigd sessies. Klik op ' Help ' in de menubalk en selecteer ' View Logs ' te openen van de log file viewer aanvullende software. Zorg ervoor log-bestanden worden weergegeven in de navigatiekolom aan de linkerkant van het venster. Als geen bestanden zichtbaar zijn, klikt u op ' bestand ', kies ' Select Logboekmap ', en blader naar een map met logboekbestanden. Dubbelklik op de naam van een logboekbestand in de zijbalk te bekijken log bestandsinhoud in de ' Viewer ' tab. Selecteer de ' Zoek ' tabblad en input zoektermen om te zoeken een of meer logboekbestanden. Input zoekparameters indien gewenst de ' van ', ' te ', ' gebruiker ', ' licentie ', ' operatie ', en ' Parameters ' velden. Gebruik de schuifregelaar om te selecteren de ' Max zoekresultaten voor elk bestand '. Opmerking: Sommige zoekparameters, zoals gebruikersnaam, zal veel resultaten geretourneerd uit elke overeenkomende logboekbestand. Deze parameter beperkt het aantal zoekresultaten weergegeven in elk logboekbestand. Plaatst u een vinkje in het ' zoeken alleen bestanden gemarkeerd ' checkbox (alle log bestanden worden gezocht standaard) en hoogtepunt logboekbestanden in de zijbalk te zoeken slechts een subset van log-bestanden. Controleren de '-volledigheidscontrole uitvoeren ' checkbox (standaard ingeschakeld) te onderzoeken van elk logboekbestand in aanmerking om te worden doorzocht op fouten met betrekking tot de beëindiging van een onverwachte software. Klik op ' Zoek ' om te zoeken van logboekbestanden en observeren Zoek resultaten aan de rechterkant van het venster. Klik op de ' View log file ' knop naast een zoekresultaat te markeren en te bekijken van de aangegeven regel in de ' Viewer ' tab. Log bestand integriteit kwesties Klik op de ' integriteit ' tabblad weergeven van fouten gevonden tijdens de integriteitscontrole (als de cheque is aangevraagd). Opmerking: Een zoekopdracht moet worden uitgevoerd om de logboekbestanden voor integriteit kwesties te onderzoeken. Voor het uitvoeren van een integriteitscontrole zonder het zoeken van logboekbestanden voor eeny zoektermen, gewoon laat alle zoekvelden parameter zwart van de ' Zoek ' tab, zorgen voor de ' volledigheidscontrole uitvoeren ' wordt gecontroleerd, en klik op ' Zoek '. Als integriteit kwesties worden gevonden, de ' integriteit ' de kleur van de achtergrond van het tabblad wordt red. Vastberadenheid integriteit kwesties (uitvoer wordt gegroepeerd op logboekbestand) waarmogelijk. Opmerking: Raadpleeg voor meer informatie over stappen integriteit kwesties op te lossen, de on line documentatie 14. 7. Curve en dosis schatting statistieken opties Klik op ' instellingen ' in de menubalk en selecteer ' statistieken opties ' om te openen de ' statistieken opties ' dialoogvenster. Een kalibratiecurve passend methode (kleinste kwadraten of maximaal-waarschijnlijkheid) uit de vervolgkeuzelijst selecteren. Plaatst u een vinkje naast ' weergeven kalibratie kromme 95% CI, indien van toepassing ' 95%-betrouwbaarheidsintervallen weergegeven wanneer het uitzetten van een kalibratiekromme. Plaatst u een vinkje naast ' dosis schatting berekent 95% CI als gevolg van Poisson ' voor het berekenen van de 95% betrouwbaarheidsgrenzen op dosis schattingen op basis van de aard van de Poisson DC opbrengstpercentage. Plaatst u een vinkje naast ' dosis schatting berekent 95% CI als gevolg van de curve, indien van toepassing ' voor het berekenen van de 95% betrouwbaarheidsgrenzen op dosis schattingen op basis van onzekerheid aan de kalibratiekromme gerelateerde.

Representative Results

Testen van de software werd uitgevoerd met metafase chromosoom afbeeldingsgegevens HC en CNL verkregen. Bloedmonsters werden door een XRAD-320-eenheid bestraald (250 kV x-stralen, 12,5 mA, 2mm Al filtratie, dosering: 0,92 of 1.7 Gy/min) met een ion-kamer op HC gekalibreerd en op beide laboratoria verwerkt. Monsters van perifeer bloed lymfocyten werden gekweekt, vaste en gekleurd bij elke faciliteit volgens vaste protocollen3,15. Metafase beelden uit Giemsa gebeitste dia’s werden onafhankelijk gevangen door elk lab met behulp van een geautomatiseerde microscopie systeem. Deskundigen in elk laboratorium scoorde DCs in een aantal van deze monsters handmatig, hun eigen kalibratiekrommen gebouwd en geraamd doses van monsters van de onbekende risico’s. Een gedetailleerde beschrijving van deze datasets is gegeven in tabel 1. Fysieke dosis Doel HC voorbereiding CNL voorbereiding De naam van de bedoelde # van beelden De naam van de bedoelde # van beelden 0 Gy Kalibratie HC0Gy 731 CNL0Gy 798 0.1 Gy Kalibratie HC01Gy 2162 NB NB 0,25 Gy Kalibratie HC025Gy 1826 NB NB 0,5 Gy Kalibratie HC05Gy 1054 CNL05Gy 1532 0,75 Gy Kalibratie HC075Gy 1233 NB NB 1 Gy Kalibratie HC1Gy 1566 CNL1Gy 841 2 Gy Kalibratie HC2Gy 1147 CNL2Gy 996 3 Gy Kalibratie HC3Gy 1212 CNL3Gy 1188 4 Gy Kalibratie HC4Gy 909 CNL4Gy 1635 5 Gy Kalibratie HC5Gy 1019 NB NB 3.1 Gy Test HCS01 540 CNLS01 500 2.3 Gy Test HCS08 637 CNLS08 500 1.4 Gy Test HCS10 708 NB NB 1.8 Gy Test HCS04 600 CNLS04 957 2.8 Gy Test HCS05 1136 CNLS05 1527 3.4 Gy Test HCS07 477 CNLS07 735 Tabel 1: Bronnen van afbeeldingsgegevens verleend door HC en CNL voor evaluatie van de Software.Voetnoot: Van tabel 1 in Rogan et al., 20164gewijzigd. Alleen handmatig geselecteerde afbeeldingen waren aan ons voorheen wel beschikbaar van CNL. Ongefilterde afbeeldingen beschikbaar zijn gekomen en de graven van de afbeelding worden dienovereenkomstig bijgewerkt. Bovendien, nieuw verworven HC monsters (0.25Gy, 0.75Gy en 5Gy) worden hier gepresenteerd. Automatische Image selectie in monsters Beeldkwaliteit is cruciaal voor de juiste DC detectie in DC analyse. Afbeelding selectie door cytogenetische specialisten wordt meestal handmatig uitgevoerd in conventionele DC analyse. ADCI kwantitatieve afbeelding criteria gebruikt om automatisch te selecteren afbeeldingen voordat DC frequentie berekening16. Gebruikers kunnen ofwel filter uit afbeeldingen op basis van specifieke chromosoom morphologies en/of soort cellen volgens het relatieve aandeel van de lengtes van objecten volgens bekende lengtes van cytogenetische gedefinieerde groepen van chromosomen in een normale menselijke karyotype (aangeduid als de groep-bin afstand methode). De beschikbare morfologische filters gebruiken schaal-invariant drempels te verwerpen cel beelden met onvolledige chromosoom sets of met meerdere metafasen, met prometaphase chromosomen, met prominente zus chromatide dissociatie, met zeer gebogen en gedraaide chromosomen, met objecten met vloeiende contouren karakteristiek van intact kernen, en degenen die minder objecten worden herkend als chromosomen. Figuur 3 (a) en (b) voorbeelden van geselecteerde afbeeldingen, overwegende dat Figuur 3 (c) en (d) zijn voorbeelden van afbeeldingen die door de software worden uitgefilterd. Deze beelden zijn afgeleid van monster HCS05 (beschreven in tabel 1), en zijn geselecteerd door de vooraf gedefinieerde afbeelding Keuzemodel arbeidsvoorwaarden die gelederen alle afbeeldingen door groep bin afstand, dan selecteert de beste 250 foto’s. Chromosomen in Figuur 3 (A), (b) zijn goed gescheiden, en bevredigende morfologie vertonen. Figuur 3 (c) bevat buitensporige aantal overlappende chromosoom clusters. Figuur 3 (d) toont ernstige zus chromatide scheiding. Zuster chromatiden zijn volledig gescheiden voor minstens 8 van de chromosomen en de centromeric beperkingen zijn dubbelzinnig in de meeste van de andere chromosomen. Figuur 3: voorbeelden van metafase beelden in monster HCS05 (vergroting: 63 X), zowel Unselected en geselecteerd door het Model ‘Groep Bin afstand, Top 250 afbeeldingen’. (A) en (B) zijn geselecteerde afbeeldingen. (C) en (D) zijn afbeeldingen die door het model zijn afgeschaft. (C) werd uitgesloten omdat het bevat teveel overlappende chromosomen en (D) had buitensporige aantallen gescheiden zuster chromatiden. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer. De gevolgen van de toepassing van deze afbeelding selectie modellen is duidelijk door het betrouwbaarheidsniveau voor DC detection in een steekproef te onderzoeken. Voorvallen van DCs in een bevolking van cellen uit een bestraalde monster gaat u als volgt een Poisson-verdeling. De Chi-kwadraat goedheid-van-fit test vergelijkt de waargenomen frequentieverdeling van DC naar de verwachte aanpassen aan de Poisson-verdeling. Modellen dat goed filter voorbeeldgegevens DC frequenties niet sterk afwijkt van de verwachte Poisson vertonen afgeleide waarden (meestal significantieniveau > 0,01). Figuur 4 geeft DC voorvallen en de daarbij horende past op Poisson uitkeringen voor het HC4Gy monster van alle afbeeldingen vs. alleen afbeeldingen geselecteerd door de “groep bin afstand, top 250 foto’s” model. Figuur 4 (b) toont een beter passen bij de Poisson-verdeling. De p-waarde (0.36) van de gefilterde set van beelden aanzienlijk hoger ligt dan dat van de ongefilterde DC distributie in Figuur 4 (a). Bij 5% of 1% belang niveaus, het ongefilterde monster in Figuur 4 (a) minder betrouwbaar is, omdat het bevat gegevens van lagere kwaliteit-DC, als de null-hypothese van een Poisson-verdeling van DCs is verworpen. Figuur 4: Screenshots van evenredige DC frequenties aanpassen aan Poisson van monster HC4Gy in de Software Dstributions. (A) alle afbeeldingen zijn opgenomen, (B) alleen beelden geselecteerd door model (groep bin afstand, top 250 afbeeldingen) zijn opgenomen. De legenda (rechtsboven) toont u de statistieken van de aanpassen aan de Poisson-verdeling (dispersie Index, Mu test en Lambda) en de Chi-kwadraat goedheid van fit test (p-waarde) Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer. Detectie van dicentric chromosoom (DC) Nauwkeurige detectie van DC is de kritische vereiste eis van ADCI. Correct gedetecteerd DCs en die gemist door de software worden respectievelijk gedefinieerd als ware positieven (TPs) en valse negatieven (FNs). Objecten die niet DCs, maar onjuist gedetecteerd als DCs, worden aangeduid als valse positieven (FPs). FPs omvatten bod chromosomen, chromosoomfragmenten, gescheiden zuster chromatiden, overlappende chromosoom clusters en niet-chromosomale objecten. Figuur 5 toont de resultaten van DC detectie in twee metafase beelden. Objecten 1 en 3 zijn TPs, terwijl 4-object is een FP bestaande uit twee verschillende bod chromosomen conjoined langs hun korte armen. In Figuur 5 (a), 2 object was oorspronkelijk een FP, maar vervolgens gecorrigeerd door FP filters in de software. Objecten 5 en 6 in Figuur 5 (b) zijn waarschijnlijk voorbeelden van FNs. Figuur 5: Screenshots geven metafase chromosoom classificatie van potentiële DCs. (A) Een afbeelding in monster CNL1Gy (vergroting: 63 X) tonen 1 TP, object “1”; en 1 gecorrigeerd FP, object “2”. (B) een beeld in monster CNL4Gy (vergroting: 63 X) tonen 1 TP, object “3”; 1 FP, object “4”; en 2 potentiële FNs, objecten “5” en “6”. TPs, gecorrigeerde FPs, normale bod en niet-geclassificeerde chromosomen worden respectievelijk met rode, gele, groene en blauwe contouren beschreven. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer. Schatting van de dosis van proefmonsters Het uiteindelijke resultaat van ADCI analyses zijn de dosis schat van monsters die zijn afgeleid van de kalibratiekrommen. Dosis schattingen gemaakt door de software voor de analysemonsters in tabel 1 worden aangegeven in de tabellen 2 en 3. Ter vergelijking: de fysieke stralingsdosis uitgestoten en de handmatige scoorde doses door deskundigen op HC voor monsters HCS01, HCS08 en HCS10 worden vermeld. Ook de fysieke and manual scoorde doses door CNL deskundigen staan voor CNLS04, CNLS05 en CNLS07. Figuur 6 toont kalibratiekrommen met straling dosis schattingen voor laboratoriummonsters van Health Canada biodosimetry HCS01, HCS08, HCS10, HCS04, HCS05 en HCS07. De kalibratiekromme wordt gegenereerd met behulp van de monsters, HC0Gy, HC1Gy, HC2Gy, HC3Gy en HC4Gy. De afbeelding Keuzemodel arbeidsvoorwaarden met 3 Z-score-gebaseerde filters + “groep bin afstand, top 250 afbeeldingen” wordt toegepast op alle monsters. Dosis ramingen samen met bijbehorende statistische analyses worden weergegeven in tabel 2. Figuur 6: Screenshot van schatting van de dosis van HC analysemonsters. Zwarte vierkantjes vertegenwoordigen kalibratie monsters. Afbeeldingen in gereduceerde monsters en kalibratie monsters worden geselecteerd door het model (3 FP filters + groep bin afstand, top 250 afbeeldingen). Dik gestippelde lijnen vertegenwoordigen de toewijzing van DCs/metafase via de kalibratiekromme aan naar schatting van de dosis. Dunne stippellijnen duiden hogere en lagere 95% betrouwbaarheidsgrenzen van DCs/metafase. Kleur codes van analysemonsters: knalrood, HC S01 (fysieke dosis: 3.1Gy, HC afgeleid dosis: 3.4Gy, ADCI: 3Gy); donker groen, HC S04 (fysieke dosis: 1.8Gy, ADCI: 1.85Gy); koboltblauw, HC S05 (fysieke dosis: 2.8Gy, ADCI: 2.95Gy); donkerblauw, HC S07 (fysieke dosis: 3.4Gy, ADCI: 2.35Gy); donker rood, HC S08 (fysieke dosis: 2.3Gy, HC afgeleid dosis: 2.5Gy, ADCI: 2Gy); helder groen, HC S10 (fysieke dosis: 1.4Gy, HC afgeleid dosis: 1.4Gy, ADCI: 0.95Gy). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer. Monsters Fysieke dosis HC afgeleid dosis ADCI geschat dosis Geschatte dosis LCL Geschatte dosis UCL P-waarde * HCS01 3.1 3.4 3 2.3 3.8 0.117 HCS08 2.3 2.5 2 1.4 2.7 0.815 HCS10 1.4 1.4 0.95 0,5 1.55 0.211 HCS04 1.8 NB 1,85 1,25 2,55 0.0293 HCS05 2.8 NB 2.95 2,25 3,75 0.00354 HCS07 3.4 NB 2.35 1.7 3.1 0.0002 Tabel 2: Dosis schatting resultaten van HC analysemonsters.Voetnoot: Bewerkt uit tabel 3 in Rogan et al., 20164. ADCI dosis schattingen eerder gemeld waren gebaseerd op ongefilterde beelden en curve-fitting werd uitgevoerd met behulp van de methode van de kleinste kwadraten. Hier, de kalibratiekromme was passen met behulp van de methode maximaal-waarschijnlijkheid en een afbeelding Keuzemodel arbeidsvoorwaarden met 3 FP filters + “groep bin afstand, top 250 afbeeldingen” werd toegepast voordat de schatting van de dosis. Geschatte dosis UCLen LCL verwijzen naar dosis schatting hogere en lagere 95%-betrouwbaarheidsgrenzen, op basis van de aard van de Poisson DC opbrengst. * Chi vierkante goedheid van fit naar theoretische Poisson-verdeling; NB: De resultaten van handmatig afgeleid dosis waren niet verstrekt. Stralingsdosis schat voor monsters van Canadese nucleaire laboratoria CNLS04, CNLS05, CNLS07, CNLS01 en CNLS08 staan in Figuur 7. De kalibratiekromme wordt gegenereerd met behulp van de monsters, CNL0Gy, CNL0.5Gy, CNL1Gy, CNL2Gy, CNL3Gy en CNL4Gy. We een afbeelding Keuzemodel arbeidsvoorwaarden bestaande uit 6 FP filters om alle monsters hebt toegepast. De resultaten met statistische analyses worden weergegeven in tabel 3. Figuur 7: Screenshot van schatting van de dosis van CNL analysemonsters. Zwarte vierkantjes vertegenwoordigen kalibratie monsters. Afbeeldingen in gereduceerde monsters en kalibratie monsters worden geselecteerd met behulp van 6 FP filters. Dik gestippelde lijnen vertegenwoordigen de toewijzing van DCs/metafase via de kalibratiekromme aan naar schatting van de dosis. Dunne stippellijnen duiden hogere en lagere 95% betrouwbaarheidsgrenzen van DCs/metafase. Kleur codes van analysemonsters: knalrood, CNL S04 (fysieke dosis: 1.8Gy, CNL afgeleid dosis: 1.7Gy, ADCI: 1.95Gy); donker rood, CNL S05 (fysieke dosis: 2.8Gy, CNL afgeleid dosis: 2.7Gy, ADCI: 3.05Gy); helder groen, CNL S07 (fysieke dosis: 3.4Gy, CNL afgeleid dosis: 3.1Gy, ADCI: 3.4Gy); donkergroen, CNL S01 (fysieke dosis: 3.1Gy, ADCI: 3.75Gy); blauw, CNL S08 (fysieke dosis: 2.3Gy, ADCI: 2.8Gy). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer. Monsters Fysieke dosis CNL afgeleid dosis ADCI geschat dosis Geschatte dosis LCL Geschatte dosis UCL P-waarde * CNLS04 1.8 1.7 1.95 1,25 2.45 0.0545 CNLS05 2.8 2.7 3,05 2,75 3.35 0.325 CNLS07 3.4 3.1 3.4 3 3,75 0.473 CNLS01 3.1 NB 3,75 3.35 > 4 7.63E-11 CNLS08 2.3 NB 2.8 2,25 3.3 0.777 Tabel 3: Dosis schatting resultaten van CNL testopnames.Voetnoot: Uit tabel 3, Rogan et al., 20164gewijzigd. ADCI dosis schattingen eerder gemeld waren gebaseerd op ongefilterde (HC) of handmatig geselecteerd (CNL) beelden en curve-fitting werd uitgevoerd met behulp van de methode van de kleinste kwadraten. Hier, de kalibratiekromme was passen met behulp van de methode maximaal-waarschijnlijkheid en een afbeelding Keuzemodel arbeidsvoorwaarden met 3 FP filters + “groep bin afstand, top 250 afbeeldingen” werd toegepast voordat de schatting van de dosis. Geschatte dosis UCL en LCL, respectievelijk verwijzen naar dosis geschatte hogere en lagere 95%-betrouwbaarheidsgrenzen, op basis van de aard van de Poisson DC opbrengst.* Chi vierkante goedheid van fit naar theoretische Poisson-verdeling; NB: Resultaten van handmatig afgeleid dosis niet beschikbaar waren. Schatting van de stralingsdosis binnen het lineaire bereik van de ijklijn (< 1 Gy) kunnen worden uitgevoerd met de software, maar een Sigma is de aanbevolen waarde van 1.0 is een verdere verlaging van de frequentie van misclassified DCs (Figuur 8). Figuur 8: Screenshots van twee kalibratiekrommen afgeleid van HC kalibratie monsters op verschillende Sigma waarden. (A) HC kalibratie monsters: 0Gy, 2Gy, 3Gy, 4Gy, en 5Gy bij Sigma = 1.5. (B) HC kalibratie monsters: 0Gy, 0.25Gy, 0.5Gy, 0.75Gy, 1Gy, 2Gy, 3Gy, 4Gy, en 5Gy met behulp van SVM Sigma = 1.0. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer. Deze analyses laten zien dat er kleine, maar aanvaardbare verschillen tussen fysieke en biologisch afgeleid dosis uitgelegd door deskundigen en door de software. Het verschil tussen handleiding of software schatting van de fysieke dosis is de “error” genoemd. De fout in de afgeleid doses van monsters handmatig gescoord door HC en CNL is ≤0.3 Gy. Geautomatiseerde verwerking door de software is minder nauwkeurig dan de deskundigen, maar over het algemeen binnen de grenzen van de IAEA-opgegeven triage van ± 0,5 Gy3. Voor de meeste van de proefstukken benadert in de tabellen 2 en 3, de software correct opgeleverd binnen deze drempel. Echter, HCS07 en CNLS01 vertonen een arme goedheid-van-aanpassen aan de Poisson-verdeling, suggereren dat er potentiële problemen in beeld en DC kwaliteit in deze monsters die niet werden opgelost door toepassing van de afbeelding en FP selectie modellen. De p waarde betekenis drempel lijkt overdreven strenge in het geval van HCS05, waar de software niet nauwkeurig de juiste dosis bepaald.

Discussion

Mogelijkheden en beperkingen van de software

Het protocol beschreven in deze paper introduceert de typische stapsgewijze procedure gebruikt in ADCI importeren en verwerken van cytogenetische metafase afbeeldingen, maken van straling kalibratiekrommen en biologische dosis in individuen of monsters blootgesteld aan onbekende schatten stralingsniveaus. Het is echter niet nodig voor het uitvoeren van deze instructies sequentieel. Bijvoorbeeld, veel proefmonsters van onbekende dosis kunnen worden verwerkt en geanalyseerd met behulp van dezelfde precomputed kalibratiecurve. Bovendien, zodra het conversieproces is voltooid, de selectie van de afbeelding en de DC filteren modellen kan worden herhaald door de gebruiker. Toepassing van een passende afbeelding Keuzemodel arbeidsvoorwaarden hangt af van de kenmerken en kwaliteit van de metafase-afbeeldingsgegevens, die op zijn beurt steunt zowel op het laboratorium-protocol gebruikt voor het bereiden van cellen en de striktheid criteria gebruikt voor het selecteren van cellen met geautomatiseerde metafase opname systemen. Chromosoom morphologies zal verschillen tussen biodosimetry en cytogenetische laboratoria, en dus de afbeelding selectie modellen moeten worden beoordeeld door de gebruiker om te bepalen of de vooraf gedefinieerde afbeelding selectie modellen meegeleverd met de software volstaan om te worden zal het opstellen van ramingen van de precieze dosis of of aangepaste met gebruiker gedefinieerde modellen drempels moeten worden gemaakt. Gebaseerd op onze ervaring, wordt de effectiviteit van afbeelding selectie modellen beïnvloed door de bron en de kwaliteit van de beelden van de cel. Gebruikers kunnen hun eigen selectiecriteria van de afbeelding met behulp van verschillende combinaties van filters te elimineren valse positieve DCs en beeld selectie modellen en de tegenwaarde van de drempel om te selecteren van de gewenste beelden ontwerpen. Er is flexibiliteit in de input van de kalibratiekrommen en schatting van de dosis, zoals coëfficiënten van de lineaire-kwadratische curve en DC frequenties kunnen worden gewijzigd of handmatig ingevoerd.

Hoewel de software is volledig geautomatiseerd, kunnen afbeeldingen handmatig worden beoordeeld en geselecteerd. Deze mogelijkheid is beschikbaar voor het opnemen of verwijderen van individueel verwerkte afbeeldingen via de Microscoop Viewer-functie in de belangrijkste GUI. De software is echter als gevolg van de automatisering, aanzienlijk efficiënter in vergelijking met de handleiding scoring van metafase beelden en tellen van DCs. Een steekproef bestaande uit 1000 afbeeldingen kan verwerkt worden in 20 (tiff) naar 40 (jpg) min op een multicore-prestaties-werkstation. Deze software zal bijzonder nuttig zijn in tijdkritische of arbeidsintensieve situaties, zoals gebeurtenissen waarin meerdere personen zijn blootgesteld of verdacht werden te zijn blootgesteld aan straling, of waar de tijd-gevoelige diagnose en behandeling besluiten zijn kritisch.

Precieze en accurate hoge doorvoer detectie van zowel DCs als schatting van de dosis straling zonder toezicht evaluatie noodzakelijk zijn. Andere beschikbare alternatieven aan de software voldoen niet aan deze voorwaarden. Een gebruiker-bijgewoonde, beeld-gebaseerde cytogenetische analysetechnieken (DCScore, Metasystems¹⁷) systeem vereist handmatige controle van kandidaat-DCs, als gevolg van een hoge fout tarief toe te schrijven aan niet-gecorrigeerde overlappingen tussen de chromosomen en het systeem niet herkent stralingsdosis. DCScore zou niet zo effectief als ADCI in een evenement van de straling waarbij een groot aantal potentieel blootgestelde personen. Groot diafragma Microscoop systemen kunnen het verzamelen van beelden van meerdere metafase cellen¹⁸, echter doen ze niet analyseren. “CABAS”¹⁹ pt²⁰ -software “Schatting van de dosis” kalibratie kunnen genereren curven en raming dosis, maar doen niet scoren DCs. Andere biodosimetry-tests die niet zijn gebaseerd op DC analyse omvatten H2AX fluorescentie, fluorescentie in situ hybridisatie met DNA-sondes gericht aan specifieke chromosomen, genexpressie, micronucleus assay, en urine en respiratoire biomarkers. Deze methoden zijn minder specifieke en minder gevoelig voor ioniserende straling, duurder, in sommige gevallen kunnen meer tijd vergen en niet over het algemeen over meerdere referentielaboratoria zijn gestandaardiseerd. De meeste van deze technieken niet gedetecteerd stabiele straling reacties, zodat ze niet worden gebruikt voor de lange termijn evaluatie (> 7 dagen na blootstelling) van de stralingsdosis. Daarentegen, dit resultaat kan personen tot 90 dagen na blootstelling, en gegevens uit elke cytogenetica laboratorium Microscoop imaging systeem kan verwerken. Echter, als een steekproef is getrokken > 4 weken na blootstelling, de gevoeligheid is verminderd als gevolg van het verval van dicentric aberraties¹^,²^,³ en de software niet momenteel DC frequenties voor vertragingen bij de bemonstering wordt opgelost blootgestelde personen.

Deze software heeft wat beperkingen. Bestaande afbeelding selectie modellen meestal acceptabel metafase afbeeldingen selecteren, maar in sommige gevallen niet elimineren onbevredigend beelden, waardoor de nauwkeurigheid van DC detectie kunnen verminderen. Het is nog steeds een open vraag over het ontwerpen van een bevredigende afbeelding Keuzemodel arbeidsvoorwaarden die alle ongeschikt metafasecellen elimineert. De software biedt nauwkeurige schattingen voor monsters die zijn blootgesteld aan hogere stralingsdoses (≥ 2 Gy). Ondanks de aanzienlijke vooruitgang bij het verminderen van het aantal valse positieve DCs¹⁶, zijn deze objecten niet afgeschaft. Lagere kwaliteit metafasecellen bij lage stralingsdosis (vooral < 1 Gy) zijn meer vatbaar voor onjuiste positieve detectie van de DC. Lage dosis monsters werden daarom niet opgenomen bij het genereren van de ijkcurve die is gebruikt voor de schatting van de dosis van HC analysemonsters. Indien een curve met lage dosis monsters is gewenst, een lagere waarde van de SVM Sigma vermindert valse positieve graven in lage dosis monsters maar kan resulteren in lagere DC rendementen in hoge dosis monsters. Figuur 8 vergelijkt de HC kromme gebruikt voor de schatting van de dosis (Sigma = 1.5) met een kalibratiekromme pasvorm met extra lage dosis monsters tegen lagere SVM sigma waarde (1.0). In monsters met een onvoldoende aantal metafasecellen en/of afbeeldingen van de metafase van slechte kwaliteit, het niet mogelijk te schatten juist biologische risico’s bij lage dosis, mogelijk resulterend in afwijkingen van fysieke dosis meer dan 0,5 Gy.

De software kan niet nauwkeurig beoordelen op straling typen als hun beste dosis / respons-curven een lineaire of in de buurt van-lineaire model past. Tot dusver is getest slechts met monsters die zijn blootgesteld aan X- en gammastralen. Indien een andere stralingsbron is onderzocht, moeten gebruikers zowel kalibratie en test monsters worden blootgesteld aan dezelfde soort straling. De software gebruikt maximale waarschijnlijkheid of kleinste kwadraten montage op een dosis-responscurve met behulp van een lineaire-kwadratisch model bouwen. Er is momenteel geen optie om op te leggen een strikte, lineaire curve past, geschikt voor hoge energie deeltjes belichtingen, maar dergelijke functionaliteit beschikbaar zal zijn in de toekomst.

Toekomstige ontwikkeling

Onze inspanningen zijn gericht op het verbeteren van de afbeelding selectie modellen en nauwkeurige dosis meting, met name van monsters aan lage stralingsdoses blootgesteld. Latere softwareversies geeft standaardfout metingen over dosis schattingen en betrouwbaarheidsintervallen op kalibratiekrommen. Daarnaast is een high-performance computing-versie van de software voor de Blue Gene (BG/Q, IBM) supercomputer in ontwikkeling voor tijdige evaluatie van personen blootgesteld in een massa-ongeval straling-gebeurtenis. Sommige onderdelen van de software zijn al getest en geïmplementeerd op dit platformlass = “xref” > 11.

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

We moeten dankbaar Dr Ruth Wilkins, radiobiologie en bescherming divisie van Health Canada, en Farrah Flegal, Canadese nucleaire laboratoria en hun laboratoriumpersoneel toegang metafase afbeeldingsgegevens uit hun laboratoria cytogenetische biodosimetry. Dit document werd ondersteund door een contract van Build in Canada innovatie programma aan CytoGnomix (Serienr. EN579-172270/001/SC). De eerste versie van ADCI en ontwikkeling van algoritmen werden gesteund door het innovatiefonds Western; de Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (NSERC ontdekking Grant 371758-2009); US Public Health Service (DART-dosis CMCR, 5U01AI091173-0); de Canadese basis voor innovatie; Canada Research Chairs, en CytoGnomix Inc

Materials

Automated Dicentric Chromosome Identifier and Dose Estimator (ADCI)	CytoGnomix	NA	ADCI software is released in a binary installation package file for Microsoft Windows 7, 8, 8.1 and 10; 235 Mb of disk storage are required for a typical installation. The software has been tested with Intel or AMD x86-64 processors; at least 1 Gb RAM is recommended. Analyses have been benchmarked on a computer configured with an Intel I7 processor and 16 Gb RAM. Operation of ADCI requires an active license and a USB-based hardware dongle, which must remain plugged in while the software is executing. The dongle encodes the software expiry date. Each time the software is started, this date is read. The software will allow access to the program if the current date and time precedes the expiration time-date stamp. Extending an expired software license can be accomplished by obtaining a new dongle or by renewing the license with an updated key at startup.
Digital images of metaphase cell nuclei	Examples: Metasystems, Leica Microsystems	M-Search (Metasystems), Cytovision (Leica) software	High resolution TIFF format; typically >250 digital images generated with a microscope imaging capture system (minimum 63x magnification objective, 10x magnification ocular).
MSI Leopard Pro (recommended, optional)	Micro-Star International	MSI GP62 6QF 480CA Leopard Pro	Multi-core performance workstation.

Referências

Brewen, J. G., Preston, R. J., Littlefield, L. G. Radiation-Induced Human Chromosome Aberration Yields Following an Accidental Whole-Body Exposure to60 Co γ-Rays. Radiat Res. 49 (3), 647-656 (1972).
Bender, M. A., Gooch, P. C. Persistent Chromosome Aberrations in Irradiated Human Subjects. Radiat Res. 16 (1), 44-53 (1962).
INTERNATIONAL ATOMIC ENERGY AGENCY. . Cytogenetic Dosimetry: Applications in Preparedness for and Response to Radiation Emergencies. , (2011).
Rogan, P. K., Li, Y., Wilkins, R. C., Flegal, F. N., Knoll, J. H. M. Radiation Dose Estimation by Automated Cytogenetic Biodosimetry. Radiat Prot Dosimetry. 172 (1-3), 207-217 (2016).
Arachchige, A. S., Samarabandu, J., Knoll, J., Khan, W., Rogan, P. An image processing algorithm for accurate extraction of the centerline from human metaphase chromosomes. 2010 IEEE International Conference on Image Processing. , 3613-3616 (2010).
Arachchige, A. S., Samarabandu, J., Knoll, J., Khan, W., Rogan, P. An Accurate Image Processing Algorithm for Detecting FISH Probe Locations Relative to Chromosome Landmarks on DAPI Stained Metaphase Chromosome Images. 2010 Canadian Conference on Computer and Robot Vision. , 223-230 (2010).
Arachchige, A. S., Samarabandu, J., Rogan, P. K., Knoll, J. H. M. Intensity integrated Laplacian algorithm for human metaphase chromosome centromere detection. 2012 25th IEEE Canadian Conference on Electrical and Computer Engineering (CCECE). , 1-4 (2012).
Li, Y., et al. Towards large scale automated interpretation of cytogenetic biodosimetry data. 2012 IEEE 6th International Conference on Information and Automation for Sustainability. , 30-35 (2012).
Ranjan, R., Arachchige, A. S., Samarabandu, J., Knoll, J. H. M., Rogan, P. K. Automatic Detection of Pale Path and Overlaps in Chromosome Images using Adaptive Search Technique and Re-thresholding. International Conference on Computer Vision Theory and Applications. , 462-466 (2017).
Arachchige, A. S., Samarabandu, J., Knoll, J. H. M., Rogan, P. K. Intensity Integrated Laplacian-Based Thickness Measurement for Detecting Human Metaphase Chromosome Centromere Location. IEEE Trans Biomed Eng. 60 (7), 2005-2013 (2013).
Rogan, P. K., et al. Automating dicentric chromosome detection from cytogenetic biodosimetry data. Radiat Prot Dosimetry. 159 (1-4), 95-104 (2014).
Li, Y., Knoll, J. H., Wilkins, R. C., Flegal, F. N., Rogan, P. K. Automated discrimination of dicentric and monocentric chromosomes by machine learning-based image processing. Microsc Res Tech. 79 (5), 393-402 (2016).
Subasinghe, A., et al. Centromere detection of human metaphase chromosome images using a candidate based method. F1000Res. 5, 1565 (2016).
Wilkins, R. C., et al. Evaluation of the annual Canadian biodosimetry network intercomparisons. Int J Radiat Biol. 91 (5), 443-451 (2015).
Liu, J., Li, Y., Wilkins, R., Flegal, F., Knoll, J. H. M., Rogan, P. K. Accurate Cytogenetic Biodosimetry Through Automation Of Dicentric Chromosome Curation And Metaphase Cell Selection. F1000Research. 6, 1396 (2017).
Schunck, C., Johannes, T., Varga, D., Lörch, T., Plesch, A. New developments in automated cytogenetic imaging: unattended scoring of dicentric chromosomes, micronuclei, single cell gel electrophoresis, and fluorescence signals. Cytogenet Genome Res. 104 (1-4), 383-389 (2004).
Ramakumar, A., Subramanian, U., Prasanna, P. G. S. High-throughput sample processing and sample management; the functional evolution of classical cytogenetic assay towards automation. Mutat Res Genet Toxicol Environ Mutagen. 2015, 132-141 (2015).
Deperas, J., et al. CABAS: a freely available PC program for fitting calibration curves in chromosome aberration dosimetry. Radiat Prot Dosimetry. 124 (2), 115-123 (2007).
Ainsbury, E. A., Lloyd, D. C. Dose estimation software for radiation biodosimetry. Health Phys. 98 (2), 290-295 (2010).

Play Video

PDF

DOI

DOWNLOAD MATERIALS LIST

Citar este artigo

Shirley, B., Li, Y., Knoll, J. H., Rogan, P. K. Expedited Radiation Biodosimetry by Automated Dicentric Chromosome Identification (ADCI) and Dose Estimation. J. Vis. Exp. (127), e56245, doi:10.3791/56245 (2017).