Prøveforberedelse til Endopeptidomic analyse i menneskelige cerebrospinalvæske
Summary
En metode til massespektrometrisk analyse af endogene peptider i menneskelige cerebrospinalvæske (CSF) er præsenteret. Ved hjælp af Molekylær vægt cut-off filtrering, kromatografisk pre fraktionering, massespektrometrisk analyse og en efterfølgende kombination af peptid identifikation strategier, var det muligt at udvide den kendte CSF peptidome næsten ti gange sammenlignet til tidligere undersøgelser.
Abstract
Denne protokol beskriver en metode udviklet til at identificere endogene peptider i menneskelige cerebrospinalvæske (CSF). Til dette formål, en tidligere udviklet metode baseret på Molekylær vægt cut-off (MWCO) filtrering og massespektrometriske analyse blev kombineret med en offline høj pH omvendt fase HPLC pre fraktionering trin.
Sekretion i CSF er den vigtigste vej for fjernelse af molekyler kaste af cellerne i centralnervesystemet. Således er mange processer i det centrale nervesystem afspejlet i CSF, gengivelse sig en værdifuld diagnostisk væske. CSF er en kompleks sammensætning, som indeholder proteiner, der spænder over et koncentrationsområde på 8-9 størrelsesordener. Udover proteiner, har tidligere undersøgelser også vist tilstedeværelsen af et stort antal af endogene peptider. Mens mindre grundigt undersøgt end proteiner, kan disse også afholde potentielle interesse som biomarkører.
Endogene peptider blev adskilt fra CSF proteinindhold gennem MWCO filtrering. Ved at fjerne et flertal af proteinindholdet fra prøven, er det muligt at øge den sample volumen studerede og dermed også det samlede beløb af de endogene peptider. Kompleksiteten af filtreres peptid blandingen blev behandlet ved at inkludere en omvendt fase (RP) HPLC pre fraktionering skridt på alkalisk pH forud for LC-MS analyse. Fraktionering blev kombineret med en simpel sammenkædning ordningen hvor 60 fraktioner var samlet til 12, kunne analyse tidsforbrug derved reduceres samtidig stadig i vid udstrækning undgå Co eluering.
Automatiseret peptid identifikation blev udført ved hjælp af tre forskellige peptid/protein identifikation softwareprogrammer og efterfølgende kombinerer resultaterne. De forskellige programmer var komplementære snarere end sammenlignelige med mindre end 15% af identifikationer overlappet mellem tre.
Introduction
Biomarkører i cerebrospinalvæske (CSF) i øjeblikket omdanne forskning til neurodegenerative lidelser. I Alzheimers sygdom, den mest almindelige neurodegenerativ sygdom, der påvirker over 60 millioner mennesker verden over1,2, en biomarkør triplet bestående af den amyloid beta peptid, mikrotubulus-stabiliserende protein tau, og en fosforyleret tau form, kan påvise sygdommen med høj følsomhed og specificitet, og er blevet inkluderet i den diagnostiske forskning kriterier3. I andre neurodegenerative sygdomme som Parkinsons sygdom og dissemineret sklerose, har proteom undersøgelser identificeret talrige biomarkør kandidater, hvoraf nogle er i øjeblikket under evaluering i kliniske studier4,5 ,6.
Sammen med proteiner indeholder CSF også et væld af endogene peptider7,8,9,10,11,12. Der udgør spaltningsprodukter af mange hjernen-afledte proteiner, repræsenterer disse peptider også et potentielt vigtig kilde til sygdommen biomarkører. For at øge lageret af identificerede endogene peptider i menneskelige CSF og aktiverer CSF endopeptidomic analyser i kliniske studier, blev udviklet en metode til forberedelse af prøver og LC-MS analyse (en kort protokolskemaet er blevet medtaget i figur 1 ). Anvendelsen af denne metode i en nylig undersøgelse resulterede i identifikation af næsten 16,400 endogene CSF peptider i poolede CSF prøver fra flere personer af ikke-specifik diagnose, udvide den kendte CSF endopeptidome billeddetaljerne13. Metoden kan eventuelt bruges i forbindelse med Isobar mærkning tilgang til kvantificering.
Forberedelse af prøver
Den vigtigste kilde til protein massen i CSF er plasma bestanddele (fx albumin og immunglobuliner) passerer over blod hjerne barrieren14,15. Deres høje overflod hæmmer påvisning af lav-rigelige, hjerne-afledte prøve komponenter. Endogene peptider kan adskilles let fra de høj-rigelige proteiner, hvorved en betydeligt større volumen af CSF peptid ekstrakt anvendes til LC-MS analyse, hvorved påvisning af lavere-rigelige peptider.
I protokollen præsenteres her, blev molekylvægt cut-off (MWCO) filtrering brugt til at adskille CSF peptider fra proteinfraktion; en metode, der er blevet brugt i flere tidligere undersøgelser8,9,10,11,12,16. Filtrering trin blev fulgt af en offline RP HPLC pre fraktionering trin udføres over en høj pH Mobil fase gradient. Ved at udføre to RP HPLC trin i tandem, med pH er den vigtigste forskel, forskellen i selektivitet mellem de to trin resultater hovedsagelig fra ændrede peptid opbevaring som følge af forskellige peptid afgift stater. Anvendelsen af høj pH peptid pre fraktionering forud for LC-MS under sure forhold har vist sig effektive i at øge peptid identifikation17,18, og selv at være overlegen i forhold til dette formål i komplekse biologiske prøver i forhold til flere ortogonale adskillelse tilstande19, såsom stærk kat-ion exchange (SCX) og RP20. For at forkorte tid, analyse, blev en sammenkædning ordningen benyttet, samle alle 12th brøkdel (fx, brøker 1, 13, 25, 37 og 49), som på grund af høj opløsningsevne af RP HPLC stadig i vid udstrækning undgået Co eluering af peptider fra forskellige fraktioner i LC-MS trin20,21.
Peptid identifikation
Peptid identifikation i peptidomic undersøgelser er forskellig fra proteom undersøgelser, ingen enzym spaltning kan være angivet i til databasesøgning, og som følge heraf identifikation priser er normalt lavere11. En nylig undersøgelse13 viste, at identifikation satser for endogene peptider fremstillet med Sequest og Mascot blev væsentligt forbedret, når standard scoring algoritme af respektive softwareprogram er blevet ændret ved hjælp af den adaptive scoring algoritme kaffemaskine, der angiver, at optimal scoring algoritmer for endogene peptider adskiller sig fra tryptic peptider13. I denne undersøgelse, identifikation baseret på automatiske peptid de novo sekventering bruger software toppe (BSI) blev anset for at være et supplement til to fragment ion fingeraftryk-baseret søgning motorerne, identificeret hvilket resulterer i en betydeligt større sæt af peptider.
Protocol
Representative Results
Discussion
Indførelsen af et high-pH RP HPLC pre fraktionering skridt til en tidligere udviklet protokol for inddrivelse af endogene peptider ved molekylvægt ultrafiltrering11 reduceret relative prøve kompleksitet og mulighed dermed for en 5-fold større Sample volumen skal undersøges. Dette, til gengæld øget koncentration af delmængden af peptider til stede i hver fraktion og bedre dermed chancer for at afsløre lav rigelige peptider.
Ved at udføre en identifikation strat…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Mange tak Tanveer Batth og kolleger til rådgivning i opsætning af metoden før fraktionering.
Dette arbejde blev støttet af midler fra det svenske Forskningsråd, Wallström og Sjöblom Foundation, pistolen og Bertil Stohne Foundation Stiftelse, Magnus Bergwall Foundation, Åhlén Foundation, Alzheimerfonden, Demensförbundet, Stiftelsen för Gamla Tjänarinnor, Knut og Alice Wallenberg Foundation, Frimurarestiftelsen og FoU-Västra Götalandsregionen.
De vigtigste modtagere af midlerne til dette projekt blev Kaj Blennow, Henrik Zetterberg og Johan Gobom.
Materials
| 1 M Triethylammonium bicarbonate | Fluka, Sigma-Aldrich | 17902-100ML | TEAB |
| 8 M Guanidinium hydrochloride | Sigma-Aldrich | G7294-100ML | GdnHCl |
| Tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride | Pierce | 20490 | TCEP |
| Iodoacetamide | SIGMA | I1149-5G | IAA |
| Hydroxylamine 50% (w/w) | Sigma-Aldrich | 457804-50ML | |
| Acetonitrile, Far UV, HPLC gradient grade | Sigma-Aldrich | 271004-2L | AcN |
| Formic acid | Fluka, Sigma-Aldrich | 56302-1mL-F | FA |
| Triflouroacetic acid | Sigma-Aldrich | T6508-10AMP | TFA |
| Ammonium hydroxide solution | Sigma-Aldrich | 30501-1L-1M | NH4OH |
| Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Unit with Ultracel-30 membrane | Merck Millipore | UFC903024 | MWCO-filter |
| Sep-Pak C18, 100 mg | Waters | WAT023590 | SPE-column |
| Resprep 12-port SPE Manifold | Restek | 26077 | Vacuum manifold |
| TMT10plex Isobaric Label Reagent Set | Thermo Fisher Scientific | 90110 | TMT10plex |
| UltiMate 3000 RSLCnano LC System | Dionex | 5200.0356 | Online sample separation |
| Ultimate 3000 RPLC Rapid Separation Binary System | Dionex | IQLAAAGABHFAPBMBEZ | Offline high-pH fractionation |
| Orbitrap Fusion Tribrid mass spectrometer | Thermo Scientific | IQLAAEGAAPFADBMBCX | Mass spectrometer for sample analysis |
| Proteome Discoverer 2.0 | Thermo Fisher Scientific | IQLAAEGABSFAKJMAUH | Proteomics search platform |
| Mascot v2.4 | Matrix Science | - | Proteomics search engine |
| Sequest HT | Thermo | - | Proteomics search engine |
| PEAKS v7.5 | Bioinformatic Solutions Inc.) | - | Proteomics search engine |
| Acclaim PepMap 100, 75 µm x 2 cm, C18, 100 Å pore size, 3 µm particle size | Thermo Fisher Scientific | 164535 | Trap column (nano HPLC) |
| Acclaim PepMap C18, 75 µm x 500 mm, 100Å pore size, 2 µm particle size | Thermo Fisher Scientific | 164942 | Separation Column (nano HPLC) |
| Savant SpeedVac High Capacity Concentrators | Thermo Fisher Scientific | SC210A-230 | SpeedVac/Vacuum concentrator |
| XBridge Peptide BEH C18 Column, 130Å, 3.5 µm, 2.1 mm X 250 mm | Waters | 186003566 | Separation Column (micro HPLC) |
Referências
- Wimo, A., et al. The worldwide costs of dementia 2015 and comparisons with 2010. Alzheimers Dement. 13 (1), 1-7 (2017).
- Scheltens, P., et al. Alzheimer’s disease. Lancet. 388 (10043), 505-517 (2016).
- Dubois, B., et al. Advancing research diagnostic criteria for Alzheimer’s disease: the IWG-2 criteria. Lancet Neurol. 13 (6), 614-629 (2014).
- Olsson, B., et al. CSF and blood biomarkers for the diagnosis of Alzheimer’s disease: a systematic review and meta-analysis. Lancet Neurol. 15 (7), 673-684 (2016).
- Spellman, D. S., et al. Development and evaluation of a multiplexed mass spectrometry based assay for measuring candidate peptide biomarkers in Alzheimer’s Disease Neuroimaging Initiative (ADNI) CSF. Proteomics Clin Appl. 9 (7-8), 715-731 (2015).
- Höglund, K., et al. Alzheimer’s disease—Recent biomarker developments in relation to updated diagnostic criteria. Clin Chim Acta. 449, 3-8 (2015).
- Stark, M., Danielsson, O., Griffiths, W. J., Jornvall, H., Johansson, J. Peptide repertoire of human cerebrospinal fluid: novel proteolytic fragments of neuroendocrine proteins. J Chromatogr B Biomed Sci Appl. 754 (2), 357-367 (2001).
- Yuan, X., Desiderio, D. M. Human cerebrospinal fluid peptidomics. J Mass Spectrom. 40 (2), 176-181 (2005).
- Berven, F. S., et al. Pre-analytical influence on the low molecular weight cerebrospinal fluid proteome. Proteomics Clin Appl. 1 (7), 699-711 (2007).
- Zougman, A., et al. Integrated analysis of the cerebrospinal fluid peptidome and proteome. J Proteome Res. 7 (1), 386-399 (2008).
- Holtta, M., et al. Peptidome analysis of cerebrospinal fluid by LC-MALDI MS. PLoS One. 7 (8), e42555 (2012).
- Holtta, M., et al. An integrated workflow for multiplex CSF proteomics and peptidomics-identification of candidate cerebrospinal fluid biomarkers of Alzheimer’s disease. J Proteome Res. 14 (2), 654-663 (2015).
- Hansson, K. T., et al. Expanding the cerebrospinal fluid endopeptidome. Proteomics. 17 (5), (2017).
- Guldbrandsen, A., et al. In-depth characterization of the cerebrospinal fluid (CSF) proteome displayed through the CSF proteome resource (CSF-PR). Mol Cell Proteomics. 13 (11), 3152-3163 (2014).
- Kroksveen, A. C., Opsahl, J. A., Aye, T. T., Ulvik, R. J., Berven, F. S. Proteomics of human cerebrospinal fluid: discovery and verification of biomarker candidates in neurodegenerative diseases using quantitative proteomics. J Proteomics. 74 (4), 371-388 (2011).
- Hölttä, M., et al. A single dose of the γ-secretase inhibitor semagacestat alters the cerebrospinal fluid peptidome in humans. Alzheimers Res Ther. 8 (1), 11 (2016).
- Cao, Z., Tang, H. Y., Wang, H., Liu, Q., Speicher, D. W. Systematic Comparison of Fractionation Methods for In-depth Analysis of Plasma Proteomes. J Proteome Res. 11 (6), 3090-3100 (2012).
- Chiu, C. W., Chang, C. L., Chen, S. F. Evaluation of peptide fractionation strategies used in proteome analysis. J Sep Sci. 35 (23), 3293-3301 (2012).
- Gilar, M., Olivova, P., Daly, A. E., Gebler, J. C. Orthogonality of separation in two-dimensional liquid chromatography. Anal Chem. 77 (19), 6426-6434 (2005).
- Batth, T. S., Francavilla, C., Olsen, J. V. Off-line high-pH reversed-phase fractionation for in-depth phosphoproteomics. J Proteome Res. 13 (12), 6176-6186 (2014).
- Yang, F., Shen, Y., Camp, D. G., Smith, R. D. High-pH reversed-phase chromatography with fraction concatenation for 2D proteomic analysis. Expert Rev Proteomics. 9 (2), 129-134 (2012).
- Blennow, K., Hampel, H., Weiner, M., Zetterberg, H. Cerebrospinal fluid and plasma biomarkers in Alzheimer disease. Nat Rev Neurol. 6 (3), 131-144 (2010).
- Moglich, A., Krieger, F., Kiefhaber, T. Molecular basis for the effect of urea and guanidinium chloride on the dynamics of unfolded polypeptide chains. J Mol Biol. 345 (1), 153-162 (2005).
- Hölttä, M., et al. An Integrated Workflow for Multiplex CSF Proteomics and Peptidomics Identification of Candidate Cerebrospinal Fluid Biomarkers of Alzheimer’s Disease. J Proteome Res. 14 (2), 654-663 (2014).
