AFM en Microrheology in de cel van de dooier Zebrafish de Embryo

De fysische principes die ten grondslag liggen aan de biomechanische controle van morfogenetische processen zijn grotendeels ongedefinieerd. Terwijl biomechanische studies op de moleculaire en cellulaire niveau zijn het verzamelen van aanzienlijke dynamiek, is de verkenning van biomechanische parameters op het niveau van het weefsel/organisme in de kinderschoenen. Hydrodynamische regressie¹ of Video kracht microscopie² onderzoekers onderscheiden van actieve en passieve krachten, terwijl de laser microchirurgie³, of de minder opdringerig atomaire kracht microscopie (AFM) van gedissocieerde cellen⁴ of in vivo ⁵ of nanoparticle microrheology⁶ toestaan de anticipatie van een weefsel van mechanische eigenschappen en reacties.

AFM is een driedimensionale topografische techniek met hoge atomaire resolutie oppervlakteruwheid en naleving van de uitwijking van cantilever tips bij contact met een peilden oppervlakte⁷oplossen. Verschillende methodologieën AFM in dienst hebben ontwikkeld om te onderzoeken van de oppervlakte-eigenschappen, met inbegrip van het meten van de wrijving, hechting krachten en visco eigenschappen van verschillende materialen. Onlangs, AFM heeft ontpopt als een krachtig hulpmiddel voor het ophalen van informatie over de mechanische eigenschappen van biologische monsters. In het bijzonder kan AFM niet-gebeurt pak de complexe afschuifmodulus uit afzonderlijke cellen door oscillerende inkepingen met een micro tip gekoppeld aan een cantilever van bekende buigende constante⁸toe te passen. Dit laat ons afleiden van de resulterende krachten. Nog, AFM is niet uniek en verschillende methodes kunnen uitpakken Rheologische gegevens en mechanische eigenschappen van afzonderlijke cellen (bijvoorbeeld micropipet aspiratie⁹, magnetische cytometry (MTC)¹⁰draaien, of eenassige treksterkte testen van¹¹).

De toepassing van deze nieuwe methodologieën op complexe morfogenetische processen is echter niet eenvoudig. De belangrijkste uitdagingen bij de bepaling van de mechanische eigenschappen van embryonale weefsels worden de kleine (µm tot mm), zacht (in de 10² – 10⁴ Pa bereik) en visco-elastisch (die aanleiding geven tot tijdafhankelijke verschijnselen) aard van de materiële¹². Daarom is het belangrijk aan te passen van de toegepaste methoden voor de bepaling van de mechanische eigenschappen (stijfheid, viscositeit, adhesie) op het specifieke geval van embryo’s en ontwikkelende organismen. Twee belangrijke kwesties moeten worden rekening gehouden bij het analyseren van de reologische benaderingen te bestuderen ontwikkeling: opdringerig interferentie te voorkomen en te zorgen voor gemakkelijke toegankelijkheid. In dit scenario vertonen micropipet aspiratie, MTC en testen van de treksterkte beperkingen. In het eerste geval, kan de hoge vervorming dat een cel lijdt zijn fysiologische en mechanische eigenschappen⁹worden gewijzigd. In het tweede geval kon moet stevig vasthouden de experimentele weefsel op een substraat om ervoor te zorgen dat de stress toegepast het cytoskelet lokaal vervormen ook gevolgen voor de activeringsstatus van de cellen en, vandaar, in hun mechanische eigenschappen¹⁰ voeren . Laatste, eenassige treksterkte benaderingen zijn beperkt door de geometrie van de ontwikkeling van organismen en toegankelijkheid¹¹.

AFM lijkt beter geschikt voor de studie van de ontwikkelings processen als het toelaat de studie van biologische monsters rechtstreeks in hun natuurlijke omgeving zonder enige omslachtig monstervoorbereiding. Bovendien, zoals dissociatie van embryonale weefsels over het algemeen moeilijk is, de beperkte grootte van AFM sondes biedt een hoge mate van veelzijdigheid zonder beperking in de keuze van het type medium (waterige of niet-waterige), temperatuur van het monster of chemische samenstelling van het monster. AFM is veelzijdig genoeg om te worden toegepast op grote domeinen en tijd schalen en om op te halen van de materiaaleigenschappen van weefsels in verschillende ontwikkelingsstadia of fysiologische omstandigheden heeft gewerkt. Geheel eigen weefsels zoals slagaders¹³ of botten¹⁴ zijn bestudeerd vanuit het oogpunt van topografische en in sommige gevallen, zoals de sclera, mechanische eigenschappen zijn ook ontvangen¹⁵. Topografie is ook onderzocht in levende embryo’s waardoor de visualisatie van, bijvoorbeeld, cel omlegging tijdens morfogenese in Xenopus¹⁶. Laatste, uitgebreide steekproef voorbereiding protocollen hebben ontwikkeld om te bepalen van mechanische parameters tijdens verschillende ontwikkelings processen. Nanoindentation kaarten zijn gegenereerd op inheemse nietgefixeerde weefselsecties voor de chick embryonale spijsverteringskanaal¹¹; zelfklevend en mechanische eigenschappen opgehaald voor individuele ectoderm, mesoderm en endoderm voorlopercellen geïsoleerd van gastrulating zebrafish embryo’s⁴; stijfheid metingen voor de epiblast en de primitiefstreek op explantaten van aviaire embryo’s¹⁷; en een verschillend patroon van stijfheid verlopen rechtstreeks gedefinieerd in het embryonale brein van Xenopus⁵.

Een belangrijke kwalitatieve sprong voorwaarts voor de toepassing van AFM voor het verkennen van de embryonale ontwikkeling kan afkomstig zijn van het naderen van eenvoudige toegankelijk morfogenetische processen. Zebravis epiboly is een essentieel en geconserveerde evenement, waarin verschillende weefsels en in een beperkte sferische ruimte coördineren om de uitbreiding van de blastoderm in een paar uur. Op het begin van de zebravis epiboly (sferische fase) dekt een oppervlakkige laag van cellen, de omhullende laag (EVL), een semi-sferische cap van blastomeren gecentreerd op de paal dier van het embryo zittend op een massale dooier syncytieel cel. Epiboly bestaat uit de uitbreiding van de corticale plantaardige ward van de EVL, de diepe cellen (DCs) van de blastoderm, en de externe laag van de syncytieel dooier cel (E-YSL) rond de eidooier. Epiboly eindigt met de sluiting van de EVL en de DCs op de vegetal pole^18,19,20. Hoe en waar troepen worden gegenereerd tijdens epiboly en hoe zij wereldwijd zijn gekoppeld is nog niet duidelijk^1,21.

Hier beschrijven we in detail hoe toe te passen van de AFM om te concluderen passieve mechanische weefsel eigenschappen tijdens epiboly progressie in de zebravis dooier cel in vivo. Om dit te doen, we klein microsferen gekoppeld aan AFM uitkragingen als sondes gebruikt. Hierdoor is het ophalen van de precieze lokale informatie binnen het celoppervlak van niet-uniforme dooier en te bestuderen of spanning verlopen en hun dynamiek na verloop van tijd. Alternatieve AFM benaderingen zoals die gebruik maken van de wig uitkragingen²², zal niet render lokale gegevens die nauwkeurig genoeg is. De techniek van de wig, waarvoor zeer voorzichtig manipulatie vaardigheden naar een wig groter is dan de grootte van de steekproef aan het einde van de uitkraging lijm, is niet goed geschikt voor indringende embryo (~ 2-fold groter is dan de lengte van de uitkraging) mechanica.

Modellering en karakterisering van de visco-eigenschappen van de cellen in kwalitatieve en kwantitatieve manieren zorgt voor een beter begrip van hun biomechanica. Vanuit een biomechanische oogpunt is het essentieel om te begrijpen epiboly, en niet alleen vraag naar kennis over corticale spanning metingen en de dynamiek, die kunnen worden geëxtraheerd door AFM; Er is dus behoefte aan informatie over de biofysische eigenschappen van het weefsel. Om deze informatie, een verscheidenheid van cel reologie technieken zijn ontwikkeld door de jaren heen om het karakteriseren van verschillende celtypes onder verschillende fysiologische omstandigheden²³. Zij omvatten AFM, MTC en optisch pincet (OT). Deze methoden, echter hebben bewezen ontoereikend voor mesoscopische analyses op de schaal van embryo’s of organen. Als alternatief hebben wij met succes nanoparticle-tracking microrheology⁶ voor in vivo Rheologische metingen aangepast. Deze techniek analyseert de Brownse verplaatsingen van individuele deeltjes en eigenschappen van de lokale micromechanische afleidt.

Samen AFM en nanoparticle microrheology toestaan dat de definitie van corticale spanning dynamiek en interne mechanische eigenschappen van de dooier tijdens epiboly. Deze informatie onderschrijft volledig een model waarin anisotrope stress ontwikkelt als gevolg van de verschillen in de reactie van de vervorming van de EVL en de dooier cytoplasmatische laag (YCL) naar de isotrope actomyosine samentrekking van de E-YSL cortex is essentieel voor de directionele netto verplaatsing van de EVL en epiboly progressie¹.