إنشاء "الكثيفة ينقول الإدراج المكتبة استخدام البكتيرية التصريف" في "انتيروباكتيريال سلالات مثل" الإشريكيّة القولونية أو دوسنتاريا فليكسنيري
Summary
قدم هنا طريقة بسيطة لإنشاء مكتبة إدراج ينقول عالي الكثافة في الإشريكيّة القولونية أو دوسنتاريا فليكسنيري استخدام اقتران جرثومية. هذا البروتوكول يسمح بإنشاء مجموعة من مئات آلاف طفرات فريدة من نوعها في البكتيريا بإدراج الجينوم عشوائي ينقول.
Abstract
ينقول الطفرات هو أسلوب يسمح تعطيل الجينات عن طريق الإدراج الجينوم عشوائية من قطعة من الحمض النووي يسمى ينقول. ويحدد البروتوكول أدناه أسلوب لنقل عالية الكفاءة بين السلالات البكتيرية من بلازميد إيواء ينقول التي تحتوي على علامة مقاومة كاناميسين. يتم ترميز ترانسبوساسي بلازميد المنقولة بجين البديل tnp يدرج في ينقول في جينوم سلالة المتلقي مع التحيز إينسيرشونال منخفضة جداً. وهكذا يسمح هذا الأسلوب إنشاء مكتبات متحولة الكبيرة التي تم إدراجها ترانسبوزونات في المناصب الجينوم فريدة من نوعها في سلالة المستفيدة من بكتيريا الإشريكيّة القولونية أو دوسنتاريا فليكسنيري أما. باستخدام اقتران البكتيرية، بدلاً من الأساليب الأخرى مثل انهانسر أو تحويل المواد الكيميائية، يمكن إنشاء مكتبات كبيرة مع مئات الآلاف من الحيوانات المستنسخة فريدة من نوعها. هذا تؤدي المكتبات الإدراج عالي الكثافة، مع الملاحق التي تحدث بشكل متكرر ككل زوج قاعدي 4-6 في الجينات غير الضرورية. هذا الأسلوب متفوقة إلى أساليب أخرى كما أنها تسمح بطريقة غير مكلفة وسهلة الاستخدام وعالية كفاءة لإنشاء مكتبة الإدراج ينقول الكثيفة. مكتبة ينقول يمكن استخدامها في تطبيقات المصب مثل ينقول التسلسل (Tn-Seq)، إلى استنتاج شبكات التفاعل الوراثية، أو أكثر بساطة، حيث (إلى الأمام الوراثية) شاشات.
Introduction
إنشاء مكتبات الطفرات ينقول في البكتيريا مفيد لمجموعة واسعة من التطبيقات، بدءاً من الاكتشافات للجينات الفوعة في مسببات الأمراض البكتيرية1،2، لدراسات الجينات الأساسية3، 4 , 5 , 6، لتحديد التفاعل الوراثية شبكات7،،من89. حاسمة بالنسبة لهذه الدراسات القدرة على إنشاء مكتبة كبيرة من طفرات. استخدام ترانسبوزونات (قصيرة شظايا من الحمض النووي أن إدراج جينوم شكل عشوائي) وسيلة بسيطة لتعطيل وظيفة الجينات، حيث غالباً ما سيتم تعطيل إدراج ينقول داخل إطار القراءة المفتوحة أو المنطقة التنظيمية للجينات الدالة أو التعبير من الجينات.
المبين هنا طريقة لإنشاء مكتبة ينقول كولاي أو س. فليكسنيري بالاقتران البكتيري باستخدام pJA1 بلازميد10. هناك اثنين من المزايا الرئيسية لاستخدام هذا بلازميد. الميزة الأولى هي أن البديل ترانسبوساسي Tn10 من بلازميد pJA1 إيندوسيبلي والإدراج منخفضة التحيز11،12، مما يعني أن ينقول سوف تدمج عشوائياً في الجينوم عند الأيزوبروبيل Β-د-1-ثيوجالاكتوبيرانوسيدي (إيبتج) إضافة إلى وسائل الإعلام. ينقول يحتوي على علامة مقاومة كاناميسين، مما يسمح لاختيار طفرات مع إدراج ينقول في الكروموسوم سلالة المتلقية. والميزة الثانية من بلازميد pJA1 يحتوي مصدر متحولة R6K للنسخ المتماثل. أصل النسخ المتماثل متحولة R6K يتطلب الجينات لامدا شرطة التدخل السريع من أجل الحفاظ على بلازميد13. كما لا يمكن إجراء نسخ متماثل بلازميد في بير- سلالات، سوف تضيع في سلالة المتلقية (الشكل 1). وهذا ما يضمن أن ترانسبوساسي Tn10 هو إزالتها من الخلية ولم تعد نشطة، الحد كذلك من الطفرات بعد حدث تبديل الأولية.
استخدام الاقتران البكتيري لنقل بلازميد pJA1 من سلالة المانحين إلى سلالة المتلقي مفيد لعدة أسباب. بسيطة وغير مكلفة لإجراء اقتران ولا تحتاج إلى معدات خاصة مثل اليكتروبوراتور. بالإضافة إلى ذلك، يسمح كفاءة عالية لتصريف البكتيرية لمكتبة كبيرة جداً (> 2 × 105 عمليات الإدراج فريدة من نوعها) أن يتحقق مع عدد قليل ملليلتر (مل) من بين عشية وضحاها ثقافة البكتيرية6. تستغرق العملية حوالي ساعتين وقت العملي جنبا إلى جنب مع الوقت للحضانة ونمو البكتيريا. لانجريدجي et al. 14 الإبلاغ عن أداء 130 اليكتروبوريشنز لإنشاء مكتبة الطفرات ينقول ذات حجم مماثل لوصف هنا8، الذي يتحقق باقتران واحدة. يتطلب استخدام اليكتروبوريشنز 130 إعداد العمل المكثف وتستغرق وقتاً طويلاً من الخلايا اليكتروكومبيتينت واستخدام العديد من مواد باهظة الثمن (مثلاً، الترعة انهانسر)، بتكلفة لأكثر من 1000 دولار في المواد الاستهلاكية وحدها. دراسات أخرى10 استخدمت أساليب مماثلة، لكن مع السلالات البكتيرية مختلفة، وأحجام مكتبة حقق أصغر بكثير (وحدات تشكيل مستعمرة من 5 × 104 ) مما ذكرته هنا.
ملاحظات عن سلالة المانحة: سلالة المانحة المستخدمة هنا هي سلالة كولاي BW2076715 تتضمن بلازميد ينقول pJA116. يمكن متزاوجة سلالة BW20767 إلى السلالات الأخرى، مما يجعل نقل بلازميد pJA1 ذات كفاءة عالية. أيضا، والأهم من ذلك، BW20767 لامدا بير +- وكما ذكر سابقا، pJA1 بلازميد فقط قادرة على الاحتفاظ في السلالات التي تحتوي على الجين شرطة التدخل السريع لامدا. هذه السلالة هو كاناميسين والامبيسلين مقاومة. بلازميد pJA1 يحتوي على علامة المقاومة الأمبيسلّين، ويرد علامة مقاومة كاناميسين داخل ينقول. ونمت هذه السلالة بالتحديد على بلازميد استخدام الأمبيسلّين في 100 ميكروغرام/مل. أنها أيضا الجدير بالذكر أن سلالات أخرى تأوي مؤثرا وأعربت عن ترانسبوساسي الجينات معروفة لتكون غير مستقرة، وبينما ترانسبوساسي المستخدمة هنا هو تحت إيندوسيبلي التحكم، لا يزال هناك خطر منخفض للتعبير راشح. ولهذا السبب، اقترح أنه ينبغي التقليل من مرور هذه السلالة، وينبغي أن تؤخذ مسحه جديدة من ثقافة مجمدة لكل إعداد مكتبة جديدة. سلالة المانحة تستخدم هنا تتوفر لدينا مختبر عند الطلب.
ملاحظات عن سلالة المستلم: سلالة المستلم يمكن أن سلالة خيار، مثل سلالات مختبر K12-مشتقة من كولاي أو سلالات من S.flexneri (انظر المناقشة أيضا،). يجب أن يكون الضغط المستفيدة علامة إضافية مقاومة المضادات الحيوية ليست مقاومة كاناميسين، حتى يمكن تحديد سلالة المانحة ضد. لسلالة المتلقية، يستخدم عبئا MG1655 كولاي هنا مع طفرة حمض الناليديكسيك عفوية أدخلت. كان اختارها المسخ حمض الناليديكسيك عفوية الطلاء إلى 2 مل ثقافة بين عشية وضحاها في 200 ميليلتر مختبرين على لوحات تحتوي على حمض الناليديكسيك في 30 ميكروغرام/مل. واختير استنساخ واحد من MG1655 التي كان مقاوم لحمض الناليديكسيك لتصبح سلالة المتلقية. بالإضافة إلى ذلك، يجب أن تكون سلالة المتلقية لامدا بير السلبية، كما هو موضح أعلاه.
نظرة عامة: بمجرد حدث الاقتران البكتيري وبلازميد pJA1 قد اقتحمت سلالة المستفيدة من إجهاد المانحين، ستؤدي إضافة إيبتج لوسائل الإعلام التعبير عن الجين tnp ، الذي يخضع للسيطرة على إيبتج-إيندوسيبلي المروج لاسك/Ptac (الشكل 1). هو الجين tnp على pJA1 ترانسبوساسي المسخ الذي تردد أقل للإدراج في البقع الساخنة6،،من1011. عند إضافة والاستقراء مع إيبتج، تنشيط ينقول وإدراج عشوائياً في الجينوم. لا يمكن الحفاظ على في سلالة بير-المستلم لامدا بلازميد ويضيع.
Protocol
Representative Results
Discussion
يسمح البروتوكول هو موضح هنا لبناء مكتبة الإدراج كثيفة. يسمح هذا الأسلوب لإنشاء مكتبة ينقول مع ما يزيد على 2 × 105 ينقول فريد طفرات تحت باستخدام 5 مل من الثقافة المجلد6. أنه من السهل نسبيا لتنفيذ، يستخدم الكواشف المتوفرة في مختبرات الميكروبيولوجيا الأساسية، قابلة، وتتطلب القليل من المعدات باهظة الثمن أو المواد الاستهلاكية مثل الترعة انهانسر.
وهناك فائدة كبيرة من هذا الأسلوب، من الناحية النظرية، لدى المستخدم حرية واسعة في اختيار سلالات المتلقي انتيروباكتيريال. هذا الورق، فضلا عن آخرين11، استخدام كولاي سلالة المتلقية، لكن بلازميد pJA1 قد استخدمت بنجاح مع الأنواع الأخرى المستفيدة انتيروباكتيريال مثل انتيريكا فليكسنيري دوسنتارياالسالمونيلا6 و سرفار تيفيموريوم سلالة SL134410. نظرياً، يسمح أصل γ النسخ المتماثل (أوريR6Kγ) في pJA1 هذا بلازميد الإبقاء في مضيف واسعة نطاق19، مما يسمح أن سلالة المتلقي بير +- في الآونة الأخيرة، وقد وصف أساليب جديدة تسمح بالبناء شرطة التدخل السريع + في مجموعة من سلالات انتيروباكتيريال20، مما يتيح مرونة إضافية. بالإضافة إلى ذلك، تسمح المنطقة300 زوج قاعدي الغوغاء من بلازميد RP4 في pJA1 كونجوجاتيفي نقل هذا بلازميد إلى طائفة واسعة من السلالات البكتيرية سالبة الغرام19. ببساطة، هذا الأسلوب يمكن نظرياً استخدامها مع مجموعة متنوعة من السلالات المتلقية، طالما يتم استيفاء عدة شروط: السلالة من شرطة التدخل السريع+، ويتميز بمقاومة المضادات الحيوية خلاف كاناميسين وخلاف سلالة المانحين.
خطوة حاسمة في البروتوكول يكمن في تقدير عدد مناسب من الخلايا لوحة بها في الخطوة 4، 1. إذا كانت مستعمرات متباعدة جداً عن كثب، يتنافسون للمواد الغذائية على اللوحة وهي تتغلب طفرات أقل ملاءمة. قد يؤدي هذا إلى انخفاض في العدد الكلي لطفرات. بدلاً من ذلك، إذا المستعمرات متباعدة جداً متباعدة، سيكون هناك عدد قليل جداً من المستعمرات على اللوحة، ويصبح العدد الإجمالي للوحات أجار اللازمة لتحقيق مكتبة كبيرة مرهقة. ولذلك، من المهم تحقيق التوازن الصحيح من حيث أرقام مستعمرة للوحة الواحدة.
من المهم تنفيذ الضوابط المدرجة في البروتوكول لضمان العمل بالخطوات كما هو موضح. جدير بالذكر أن عند استخدام حمض الناليديكسيك كتحديد مكافحة ضد سلالة الجهات المانحة، من المهم أن تضمن لوحات التحكم المانحة السلبية خالية من المستعمرات. وهذا لأنه قد يكون هناك انخفاض معدل (حوالي 1 × 10-10)21 من مقاومة عفوية لحمض الناليديكسيك، تسفر عن إيجابيات كاذبة. عادة ما يكون معدل التصريف والنقل هو حوالي 2 × 10-4 19. ولذلك، معدل التصريف وتبديل عدة أوامر من حجم أكبر من معدل مقاومة عفوية لحمض الناليديكسيك. ولذلك، معدل المغلوطة مقارنة بأحداث التحول الحقيقي منخفض جداً وتعتبر ضئيلة عندما تعمل البروتوكول. ومع ذلك، إذا كان خفض معدلات تصريف أو تبديل إلى حد كبير، (من انخفاض كفاءة التزاوج و/أو عدم وجود تحريض الجينات ترانسبوساسي مع إيبتج) وهو الارتقاء بالبروتوكول للتعويض عن هذا، ثم العدد من إيجابيات كاذبة (استنساخ التي لم يكن لديك ينقول إدراج) قد يزيد أيضا.
يمكن إجراء بعض التعديلات لأوقات الاحتضان في “الخطوات 3-2” و 3، 10. خطوة 3.2 الدول التي ينبغي أن يحدث الاقتران لح 6، ولكن في تجربتنا، يمكن أن تكون هذه الخطوة وقت متنوعة (أي، 4-7 ح) دون تغيير النتائج إلى حد كبير. بالإضافة إلى ذلك، في الخطوة 3، 10، يمكن أيضا ضبط طول الفترة الزمنية هي المحتضنة المستعمرات على لوحات أجار. وهذا يمكن أن تختلف تبعاً لمتوسط مضاعفة معدل نمو أو الوقت سلالة المتلقية. بالإضافة إلى ذلك، حققت ح 18 في تجربتنا، مجموعة متنوعة من أحجام مستعمرة، مما يشير إلى مكتبة للياقة البدنية المتنوعة. ومع ذلك، المستعمرات مع إلى حد كبير انخفاض لياقة قد يستغرق وقتاً أطول للنمو وبالتالي قد لا تكون مرئية بعد 18 ساعة. إذا كان يستخدم هذا الأسلوب للبحث عن الحيوانات المستنسخة للغاية انخفاض لياقة، يمكن استخدام أوقات أطول في الحضانة والمستعمرات أقل على اللوحة للحد من الازدحام (أي، ح 48، 50-300 المستعمرات).
وتشمل المخاطر الإضافية لهذا الأسلوب أنه ليس من الممكن استخدام سلالة مستلم بالفعل مقاومة كاناميسين. قد يكون من الممكن لمبادلة خارج علامة المقاومة كاناميسين في بلازميد pJA1 لعلامة اختيار بديلة، مثل مقاومة الكلورامفينيكول للتغلب على هذه العقبة. أيضا قد يكون من الجدير بالذكر أنه، من الناحية النظرية، من الممكن استخدام سلالة المتلقي مقاومة الأمبيسلّين، كما pJA1 بلازميد يحتوي على علامة المقاومة الأمبيسلّين المفقودة بعد وقت قصير من تبديل.
إنشاء مكتبة ينقول الكثيفة في الخلفية الوراثية للاختيار يحتمل أن تكون مفيدة للعديد من التطبيقات المتلقين للمعلومات. على سبيل المثال، يمكن استخدام مكتبة ينقول كثيفة لتحديد طفرات أوكسوتروفيك باستخدام النسخة المتماثلة تصفيح22 أو لتحديد طفرات المعيبة في إقامة عدوى1،2. في الآونة الأخيرة، كما انخفضت تكاليف تسلسل الحمض النووي، وقد أصبحت التكنولوجيات الجديدة مثل تسلسل الجيل القادم أمرا مألوفاً، ينقول المكتبات قد استخدمت مع تسلسل الحمض النووي العميق إلى التبصر في الجينات أكفاء، وظيفة الجينات، والوراثية التفاعلات. بعض هذه الأساليب ويعاد النظر في 23 وتشمل أساليب مثل الإدراج توجه ينقول الموقع التسلسل (تراديس)، ينقول التسلسل (Tn-seq)، الإدراج الفائق تتبع حسب تسلسل العميق (يضرب)، و (تسلسل الإدراج إينسيق). جميع هذه الأساليب المصب تعتمد على تشييد المكتبات الإدراج ينقول الكثيفة. بينما ناقلات أخرى قد تحتاج إلى استخدامها لأساليب المصب خاصة، يعطي البروتوكول الموصوفة هنا لمحة عامة عن أبرز النقاط الإجرائية لمتابعة.
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
أشكر “مختبر كنيسة جورج” لهدية بلازميد pJA1 الرقيقة. أشكر همبرغر Fabienne وأليكس بويهم من “مختبر كويتي ينال” في بيوزينتروم في بازل للمساعدة في تصريف البكتيرية وتوفير سلالة BW20767. وأشكر أيضا سيملاندير أولين تحريرات مفيدة. تم توفير التمويل لهذه الأبحاث بأموال من جامعة ماسي في نيوزيلندا والمبادرة السويسرية في “بيولوجيا الأنظمة” (مشروع “X معركة” منح ديرك بومان) في جامعة بازل، سويسرا.
Materials
| 0.45 micron nitrocellulose filters (sterile) | Millipore | HAWP02500 | Alternatively blotting paper can be used (listed below) |
| Blotting paper cut into ~ 1 inch circles, then autoclave/sterilized in foil. There is no difference in efficiency between the nitrocellulose filters or blotting paper | GE life Sciences: product Grade 3MM Chr Blotting Paper, sheet, 46 × 57 cm | 3030-917 | Alternatively nitrocellose filters can be used (listed above) |
| Metal Forceps, sterile | VWR/Global Science New Zealand | MURRE009/01 | |
| Petri dishes, sterile, 90 mm diameter, 68 mL volume, 12.5 mL working volume. | Interlab New Zealand | 2303-1090 | |
| Sterile glass spreaders | VWR/Global Science New Zealand | NZNZSPREADER | Alternatively sterile glass beads can be used for spreading culture onto plates (listed below) |
| Sterile glass beads | VWR/Global Science New Zealand | HERE1080603 | Alternatively a sterile glass spreader can be used for spreading culture onto plates (listed above) |
| Nalidixic acid (optional) | GoldBio.com | N-015-250 | |
| Ampicillin sodium salt BioChemica | VWR/Global Science New Zealand | APLIA0839.0025 | prepare according to manufacturer recommendation |
| Kanamycin sulfate BioChemica | VWR/Global Science New Zealand | APLIA1493.0010 | |
| IPTG (Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside) | Thermofisher New Zealand | FMTR0393 | |
| Difco Agar granulated | Fort Richard Laboratries/Interlab New Zealand | 214530 | |
| Luria Broth Base (Miller's LB Broth Base) | Thermofisher | 12795-084 | |
| Glycerol bidistilled 99,5 % | VWR/Global Science New Zealand | VWRC24388.320 | |
| 15 ml polypropelene sterile conical vials | VWR/Global Science New Zealand | CORN430791 | |
| Microcentrifuge tubes, flat cap, 1.7ml, Ultra-clear PP, graduated, autoclavable and freezable | VWR/Global Science New Zealand | AXYGMCT-175-C | |
| 50ml Centrifuge tubes, Falcon, PP, conical, printed graduation, with flat screw caps, sterile | VWR/Global Science New Zealand | BDAA352070 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Incubator at 37C | |||
| Autoclave for sterilizing media |
Referências
- Camacho, L. R., Ensergueix, D., Perez, E., Gicquel, B., Guilhot, C. Identification of a virulence gene cluster of Mycobacterium tuberculosis by signature-tagged transposon mutagenesis. Mol Microbiol. 34 (2), 257-267 (1999).
- Hensel, M., Shea, J. E., Gleeson, C., Jones, M. D., Dalton, E., Holden, D. W. Simultaneous identification of bacterial virulence genes by negative selection. Science. 269 (5222), 400-403 (1995).
- Glass, J. I., Assad-Garcia, N., et al. Essential genes of a minimal bacterium. PNAS. 103 (2), 425-430 (2006).
- Salama, N. R., Shepherd, B., Falkow, S. Global transposon mutagenesis and essential gene analysis of Helicobacter pylori. J Bacteriol. 186 (23), 7926-7935 (2004).
- Akerley, B. J., Rubin, E. J., Camilli, A., Lampe, D. J., Robertson, H. M., Mekalanos, J. J. Systematic identification of essential genes by in vitro mariner mutagenesis. PNAS. 95 (15), 8927-8932 (1998).
- Freed, N. E., Bumann, D., Silander, O. K. Combining Shigella Tn-seq data with gold-standard E. coli gene deletion data suggests rare transitions between essential and non-essential gene functionality. BMC Microbiology. 16 (1), 1-14 (2016).
- van Opijnen, T., Bodi, K. L., Camilli, A. Tn-seq: high-throughput parallel sequencing for fitness and genetic interaction studies in microorganisms. Nature Methods. 6 (10), 767-772 (2009).
- Langridge, G. C., Phan, M. D., et al. Simultaneous assay of every Salmonella Typhi gene using one million transposon mutants. Genome Research. 19 (12), 2308-2316 (2009).
- Gawronski, J. D., Wong, S. M. S., Giannoukos, G., Ward, D. V., Akerley, B. J. Tracking insertion mutants within libraries by deep sequencing and a genome-wide screen for Haemophilus genes required in the lung. PNAS. 106 (38), 16422-16427 (2009).
- Chan, K., Kim, C. C., Falkow, S. Microarray-based detection of Salmonella enterica serovar Typhimurium transposon mutants that cannot survive in macrophages and mice. Infect and Immun. 73 (9), 5438-5449 (2005).
- Badarinarayana, V., Estep, P. W., et al. Selection analyses of insertional mutants using subgenic-resolution arrays. Nature biotechnol. 19 (11), 1060-1065 (2001).
- Bender, J., Kleckner, N. IS10 transposase mutations that specifically alter target site recognition. The EMBO Journal. 11 (2), 741-750 (1992).
- Shafferman, A., Helinski, D. R. Structural properties of the beta origin of replication of plasmid R6K. J Biol Chem. 258 (7), 4083-4090 (1983).
- Langridge, G. C., Phan, M. D., et al. Simultaneous assay of every Salmonella Typhi gene using one million transposon mutants. Genome Research. 19 (12), 2308-2316 (2009).
- Metcalf, W. W., Jiang, W., Daniels, L. L., Kim, S. K., Haldimann, A., Wanner, B. L. Conditionally replicative and conjugative plasmids carrying lacZ alpha for cloning, mutagenesis, and allele replacement in bacteria. Plasmid. 35 (1), 1-13 (1996).
- Badarinarayana, V., Estep, P. W., et al. Selection analyses of insertional mutants using subgenic-resolution arrays. Nature biotechnol. 19 (11), 1060-1065 (2001).
- Guyer, M. S., Reed, R. R., Steitz, J. A., Low, K. B. Identification of a Sex-factor-affinity Site in E. coli as γδ. Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology. 45, 135-140 (1981).
- Blattner, F. R., Plunkett, G., et al. The Complete Genome Sequence of Escherichia coli K-12. Science. 277 (5331), 1453-1462 (1997).
- Alexeyev, M. F., Shokolenko, I. N. Mini-Tn10 transposon derivatives for insertion mutagenesis and gene delivery into the chromosome of gram-negative bacteria. Gene. 160 (1), 59-62 (1995).
- Kvitko, B. H., Bruckbauer, S., et al. A simple method for construction of pir+ Enterobacterial hosts for maintenance of R6K replicon plasmids. BMC Res Notes. 5 (1), 157 (2012).
- Barrick, J. E., Yu, D. S., et al. Genome evolution and adaptation in a long-term experiment with Escherichia coli. Nature. 461 (7268), 1243-1247 (2009).
- Jacobs, M. A., Alwood, A., et al. Comprehensive transposon mutant library of Pseudomonas aeruginosa. PNAS. 100 (24), 14339-14344 (2003).
- van Opijnen, T., Camilli, A. Transposon insertion sequencing: a new tool for systems-level analysis of microorganisms. Nature Rev Microbiol. 11 (7), 435-442 (2013).
