Aquí presentamos un método para medir directamente el ARN de transferencia carga niveles de purificada de Escherichia coli RNA como una forma de comparar niveles relativos de ARN de transferencia, o cualquier otro RNA corto, a través de diferentes muestras basadas en la adición de espiga en células expresan un gen de referencia.
ARN de transferencia (tRNA) es una parte esencial de la maquinaria traduccional en cualquier organismo. ARNt se unen y transferir los aminoácidos al ribosoma traduciendo. Los niveles relativos de tRNAs distintos y la proporción de aminoacylated tRNA al tRNA total, conocido como el nivel de carga, son factores importantes en la determinación de la exactitud y velocidad de traducción. Por lo tanto, la abundancia y niveles de carga de tRNAs son variables importantes a medir en el estudio de la síntesis de proteínas, por ejemplo en diversas condiciones de estrés. Aquí, describimos un método para cosechar tRNA y medición directa de la abundancia relativa y el nivel absoluto de la carga de la especie específica del ARNt en Escherichia coli. El tRNA se recolecta de tal manera que se conserve el vínculo inestable entre el ARNt y su aminoácido. El RNA entonces se somete a electroforesis en gel y Northern Blot, que resulta en la separación de los tRNAs cargados y descargados. Los niveles de tRNAs específicos en diferentes muestras se pueden comparar debido a la adición de espiga en las células para la normalización. Antes de la purificación del ARN, agregamos 5% de células de e. coli que sobreproducción la tRNA raraselC a cada muestra. La cantidad de las especies de tRNA de interés en una muestra luego se normaliza la cantidad de tRNAselC en la misma muestra. Además de la espiga en las células antes de la purificación del ARN tiene la ventaja sobre adición de purificada spike en RNAs que también explica las diferencias en la eficiencia de la lisis de células entre las muestras.
A continuación, presentamos un método para cuantificar el ARNt específico y medir su carga niveles por borrar norteño. El método se basa en una técnica desarrollada por Varshney et al. 1. recolección de las células en ácido tricloroacético (TCA) y manteniendo las muestras a 0 ° C a lo largo de la purificación de RNA, el enlace éster entre el tRNA y el aminoácido es conservado2,3,4. TRNAs Aminoacylated pueden distinguirse de sus contrapartes nonacylated por electroforesis y blotting norte, debido a una movilidad disminuida de la aminoacylated tRNA en el gel, causado por el ácido amino covalentemente5. Además, presentamos un protocolo para normalizar la cantidad de tRNA por adición de spike en células overexpressing el tRNA raramente usadoselC 4.
tRNAs son algunas de las moléculas más abundantes en la célula bacteriana y una parte esencial de la maquinaria de traducción. tRNAs unen aminoácidos y transfieren a los ribosomas traduciendo. La Unión de aminoácidos para tRNAs (aminoacilación o carga) facilita el aminoacil tRNA sintetasas. La abundancia relativa de diferentes tRNAs cargados es importante para asegurar la fidelidad de la síntesis de proteínas, debido a insuficiente representación del cognado cargado que tRNA para un codón determinado ARN mensajero (ARNm) aumenta la probabilidad de que un tRNA cerca de cognado entregar erróneamente su aminoácido a la cadena polipeptídica creciente en el ribosoma6. La importancia del tRNA cargado se refleja en la amplia respuesta de la célula de e. coli a una severa caída en los niveles de carga de un tRNA; la respuesta estricta. Durante la respuesta estricta disminuye la síntesis de ARNt, ARN ribosómico y mRNAs mayoría a favor de la transcripción de los mRNAs específicos asociados con aminoácido biosíntesis y estrés de supervivencia, y disminuye drásticamente la tasa de crecimiento de las células7 . Además, trabajos recientes y otros ha demostrado que e. coli activamente degrada a la mayoría de su tRNA en respuesta a las tensiones que limitan la traducción4,8, sugiriendo que puede ser el ajuste de los niveles de tRNA importante para hacer frente a dichas tensiones. Así, mediciones fiables de abundancias del tRNA y los niveles de carga será una herramienta importante para comprender plenamente las respuestas de estrés bacteriano.
E. coli se utiliza comúnmente para expresar proteínas recombinantes y debido a las diferencias en la utilización de codones entre especies, expresión óptima es un problema a menudo9. Esto puede eludirse por expresión de tRNAs adicionales necesarios para traducir el mRNA recombinante10. Las medidas de tRNA carga niveles en estas cepas podrían guiar los esfuerzos de solución de problemas y ayudar a optimizar la expresión de la proteína.
Este método también permite la detección de “confusiones”; un aminoacylated de molécula de ARNt con un aminoácido no cognado. Aminoacilación por diferentes aminoácidos puede causar un tRNA migrar con velocidades ligeramente diferentes a través de geles de poliacrilamida1,11. En algunos casos, el método también puede utilizarse para distinguir patrones de modificación diferentes tRNAs idéntico3.
Otro había establecido procedimiento bioquímico para la investigación del tRNA carga niveles es periodato de oxidación. El método se basa en la observación que aminoacylated tRNA está protegido de periodato de oxidación y tRNA descargada no es. Después periodato de tratamiento de la oxidación la recarga de los tRNA se utiliza para estimar los niveles de carga del ARN cosechado. Sin embargo, la recarga de varios tRNAs se ha demostrado para ser afectado por el tratamiento proporcionando alguna inexactitud12. El método presentado aquí medidas de carga directamente del RNA purificado, excluyendo así cualquier sesgo de reacciones químicas o enzimáticas. Una limitación de este método es que sólo una especie de tRNA se detecta a la vez, aunque el mismo Northern blot puede ser despojado y reprobed para varios tRNAs, es lento y algo laborioso recopilar datos sobre muchos tRNAs.
Una manera confiable de normalización de las muestras entre sí es vital en los estudios donde el objetivo es comparar los niveles relativos de una molécula a través de diferentes muestras. Aquí presentamos un procedimiento de normalización para RNA donde una pequeña alícuota de e. coli las células overexpressing el tRNA raraselC se agrega como un punto en a todas las muestras experimentales antes de la purificación del ARN. Este método es útil no sólo al examinar tRNAs pero para la cuantificación relativa de cualquier especie de ARN cuando la configuración experimental es tal que no RNA endógeno puede confiar que presentan en la misma concentración celular en todas las muestras. Por ejemplo, el nivel de una “limpieza” del ARN ribosómico RNA-como a menudo se utiliza como una referencia endógena para comparar las cantidades relativas de otro ARN entre diferentes muestras13. Pero esto es de poca utilidad si la concentración celular de la RNA de referencia varía entre las muestras, como puede ser el caso de ARN ribosómico si muestreo ocurre durante un estrés respuesta15,16,17 o entrada en fase estacionaria17. La adición de spike en células en las muestras experimentales antes de purificación de RNA proporciona una forma sólida y precisa de normalización independiente de la configuración de muestreo. Otra forma de normalización es la adición de uno o más punto en RNAs a las muestras experimentales después de la purificación de RNA. Sin embargo, este método no tiene en cuenta para las diferencias en la recuperación de RNA entre muestras.
Usando células de e. coli que sobrexpresan la referencia RNA como spike-en las células (ver figura 1) en un experimento de e. coli tiene el inconveniente que resulta además de una pequeña cantidad de exógena e. coli total de RNA para la muestras. Se corrigen para esta incorporación mediante el análisis de una muestra que contiene solamente spike en células en paralelo con las muestras experimentales (véase el Northern blot en carril figura 2, con la etiqueta “selC”). El protocolo que se presenta está desarrollado para e. coli K-12 pero es probable que sea aplicable para la mayoría de las especies bacteriana.
Este protocolo describe cómo medir simultáneamente el nivel de carga de concreto e. coli tRNAs y comparar los niveles relativos de los tRNAs en diferentes muestras. Son los puntos críticos del protocolo 1) manejar las muestras de tal manera que se mantienen los niveles de carga celular tRNA, 2) para normalizar la cantidad de tRNA de tal manera que pueden compararse confiablemente niveles relativos del tRNA en diferentes muestras y 3) para el sp ecificity de las sondas seleccionadas para los tRNAs de interés….
The authors have nothing to disclose.
Los autores agradecen a Marit Warrer excelente asistencia técnica. Este trabajo fue financiado por el Consejo Danés de investigación independiente | Ciencias naturales [1323-00343B] y la Fundación Nacional Danés de investigación [DNRF120].
Urea | Merck | 57-13-6 | Purity >99% |
Polyacrylamide | Serva | 79-06-7 | |
Bis (N,N'-Methylene-bis-acrylamide) | BIO-RAD | 161-0201 | |
Trichloroacetic acid (TCA) | Sigma | 76-03-9 | |
Phenol | Merck | 108-95-2 | |
IPTG | |||
Glucose | |||
Sodium Acetate | |||
EDTA | |||
Ethanol | |||
Tris | |||
Hydrochloric acid | |||
Sodium Chloride | |||
NaH2PO4 | |||
Sodium Citrate | |||
SDS | |||
Herring Sperm DNA | Sigma | 100403-24-5 | |
BSA | |||
Polivinylpyrrolidone | |||
Ficoll | |||
P32 γATP | Perkin Elmer | ||
DNA oligos (probes) | TAG Copenhagen | ||
Hybond N+ membrane | GE Healthcare | RPN203B | |
Crosslinker | |||
Electroblotter | BIO-RAD | ||
Typhoon FLA 7000 Scanner | GE Healthcare | 28955809 | |
Spectrophotometer | |||
Hydridization oven | |||
Geiger-Müller tube | |||
Phosphor imager screen | GE Healthcare | ||
Hybridization tube | |||
Culture Flasks | |||
1.5 ml microcentrifuge tubes | |||
20 ml centrifuge tubes | |||
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Software | |||
ImageQuant | GE Healthcare | ||
Excel | Microsoft |