Nedenfor presenterer vi en metode for å kvantifisere bestemte tRNAs og måle deres lading nivåer av nordlige blotting. Metoden er basert på en teknikk utviklet av Varshney et al. ¹. ved høste celler i Trekloredikksyre (TCA) og holde prøvene ved 0 ° C hele RNA rensing, ester bindingen mellom tRNA og aminosyren er bevart^2,3,4. Aminoacylated tRNAs kan skilles fra sine nonacylated kolleger av gel gelelektroforese og nordlige blotting, grunn til en redusert mobilitet av aminoacylated tRNA i gel, forårsaket av covalently bundet aminosyre⁵. I tillegg presenterer vi en protokoll for å normalisere tRNA mengder av tillegg av spike celler overexpressing sjeldent brukte tRNA^{selC 4}.

tRNAs er noen av de rikeste molekylene i bakteriell cellen og en helt avgjørende del av oversettelse maskiner. tRNAs binde aminosyrer og overføre dem til oversette ribosomene. Binding av aminosyrer til tRNAs (aminoacylation eller lading) er tilrettelagt av aminoacyl tRNA synthetases. Den relative overfloden av ulike ladet tRNAs er viktig for å sikre at gjengivelsen av proteinsyntese, fordi underrepresentation beslektet belastet tRNA for en gitt budbringer RNA (mRNA) codon øker sannsynligheten for at en nær beslektet tRNA vil feilaktig levere sin aminosyre voksende polypeptid kjeden på ribosom⁶. Betydningen av ladet tRNA gjenspeiles i omfattende svaret av E. coli cellen en alvorlig nedgang i lading nivåer av en tRNA; strenge responsen. Under strenge svaret syntese av tRNAs, ribosomal RNAs og de fleste mRNAs er senket for transkripsjon av bestemte mRNAs tilknyttet aminosyre biosyntesen og stress overlevelse, og veksten av cellene senkes dramatisk⁷ . Videre har siste arbeid og andre vist at E. coli aktivt forringer mesteparten av sin tRNA svar understreker at begrenser oversettelse^4,8, tyder på at justering av tRNA kan være viktig for å takle slike påkjenninger. Dermed, pålitelige målinger av tRNA antall og lading nivåer vil være et viktig verktøy for å fullt ut forstå bakteriell stressresponser.

E.coli brukes vanligvis til å uttrykke rekombinante proteiner og på grunn av forskjeller i codon bruk mellom artene, suboptimal uttrykket er en problem ofte møter⁹. Dette kan circumvented uttrykk for flere tRNAs nødvendig å oversette de rekombinante mRNA¹⁰. Målinger av tRNA lading nivåer i slike stammer kan lede arbeidet med feilsøking og å optimalisere protein uttrykk.

Denne metoden kan også påvisning av “mischarging”; et tRNA molekyl aminoacylated med en ikke-beslektet aminosyre. Aminoacylation av ulike aminosyrer kan forårsake et tRNA overføre med litt annen fart gjennom polyakrylamid gels^1,11. I noen tilfeller kan metoden også brukes til å skille annen endring mønstre på ellers identiske tRNAs³.

En annen etablert biokjemiske prosedyre for etterforskningen av tRNA lading nivåer er periodate oksidering. Metoden er avhengig av observasjon at periodate aminoacylated tRNA er beskyttet mot oksidering ikke og uncharged tRNA. Etter periodate oksidasjon behandling opplading av tRNA brukes til å anslå lading nivåene av de høstes. Imidlertid har opplading av flere tRNAs vist påvirkes av behandlingen gir noen unøyaktighet¹². Metoden som presenteres her tiltak lading direkte fra renset RNA, dermed eksklusive eventuelle skjevheter fra kjemiske eller enzymatiske reaksjoner. En begrensning av denne metoden er den eneste tRNA arten er oppdaget på et tidspunkt, så selv om den samme nordlige blot kan være strippet og reprobed for flere tRNAs, det er tidkrevende og noe arbeidskrevende å samle inn data på mange tRNAs.

En pålitelig måte å normalisere prøver til hverandre er viktig i studier der målet er å sammenligne den relative nivået av et molekyl over forskjellige prøver. Her introduserer vi en normalisering prosedyre for RNA der en liten aliquot av E. coli celler overexpressing den sjeldne tRNA^selC er lagt til som en spiker til alle eksperimentelle prøvene før RNA rensing. Denne metoden er nyttig ikke bare når undersøke tRNAs men for relativ kvantifisering av alle arter av når eksperimentelle oppsettet er slik at ingen endogene RNA kan være klarert å være tilstede på samme mobilnettet konsentrasjonen i alle prøvene. Nivået på en “rydde” RNA-lignende ribosomal RNA brukes for eksempel ofte som en endogen referanse sammenligne de relative mengdene av en annen mellom ulike eksempler¹³. Men dette er til liten nytte hvis mobilnettet konsentrasjonen av referanse RNA varierer mellom eksempler, som kan være tilfelle for ribosomal RNA hvis utvalg forekommer under en stress reaksjon^15,16,17 eller under inn i stasjonære fase¹⁷. Tillegg av spike celler til de eksperimentelle prøvene før RNA rensing gir en solid og nøyaktig måte å normalisering uavhengig av prøvetaking. En annen måte for standardisering er én eller flere topp-i RNAs til de eksperimentelle prøvene etter RNA rensing. Men høyde denne metoden ikke for eventuelle forskjeller i RNA utvinning mellom eksempler.

Bruke E. coli celler som overexpress referansen RNA som spike celler (se figur 1) i et eksperiment på E. coli har ulempen at det resulterer i tillegg av en liten mengde eksogene E. coli totalt RNA til den prøver. Vi korrigere på denne ved å analysere et utvalg som inneholder bare spike celler parallelt med de eksperimentelle prøvene (se den nordlige blot i figur 2, lane kalt “selC”). Protokollen presenteres er utviklet for E. coli K-12 men sannsynligvis vil gjelde for de fleste bakterielle arter.