Di seguito, presentiamo un metodo per quantificare specifico tRNAs e misurare la loro carica livelli mediante Northern blotting. Il metodo si basa su una tecnica sviluppata da Varshney et al. ¹. raccolta delle cellule in acido tricloroacetico (TCA) e mantenere i campioni a 0 ° C durante la purificazione di RNA, il legame estere tra il tRNA e l’aminoacido è conservata^2,3,4. Aminoacylated tRNAs si distinguono dalle loro controparti nonacylated gel elettroforesi e macchiare nordico, dovuto ad una mobilità in diminuzione del aminoacylated tRNA nel gel, causato dalla covalentemente aminoacido⁵. Inoltre, vi presentiamo un protocollo per la normalizzazione della quantità di tRNA con aggiunta di spike-in cellule che overexpressing il raramente usato tRNA^{selC 4}.

tRNAs sono alcune delle molecole più abbondanti nella cellula batterica e una parte vitale dell’apparato di traduzione. tRNAs legano gli amminoacidi e trasferirli i ribosomi traduzioni. L’associazione di aminoacidi per tRNAs (aminoacylation o ricarica) è facilitato dalla sintetasi del tRNA di aminoacyl. L’abbondanza relativa di diversi tRNAs carica è importante per assicurare la fedeltà della sintesi proteica, poiché sottorappresentanza delle cognate carica che tRNA per un codone determinato RNA messaggero (mRNA) aumenta la probabilità che un tRNA vicino cognate sarà erroneamente consegnare suo aminoacido a catena del polipeptide crescente sul ribosoma⁶. L’importanza della carica tRNA si riflette nella vasta risposta della cella e. coli a un drastico calo dei livelli di carica di un tRNA; la risposta rigorosa. Durante la risposta rigorosa la sintesi di tRNA, RNA ribosomiale (rRNA) e maggior parte dei mRNAs è abbassata a favore di trascrizione di mRNA specifici connessi con la sopravvivenza dell’amminoacido biosintesi e stress, e il tasso di crescita delle cellule è abbassato drasticamente⁷ . Inoltre, il recente lavoro da noi e gli altri ha mostrato che e. coli degrada attivamente la maggior parte dei suoi tRNA in risposta alle sollecitazioni che limitano traduzione^4,8, suggerendo che la regolazione dei livelli di tRNA può essere importante per far fronte a tali sollecitazioni. Così, misurazioni affidabili delle abbondanze di tRNA e livelli di ricarica sarà uno strumento importante per comprendere pienamente le risposte batteriche di sforzo.

E. coli è comunemente usato per esprimere la proteina ricombinante e a causa delle differenze nell’uso di codone tra specie, espressione non ottimale è un problema spesso affrontato⁹. Questo può essere aggirato da espressione di tRNAs aggiuntive necessarie per tradurre il mRNA ricombinante¹⁰. Misurazioni di tRNA livelli in tali ceppi di ricarica potrebbero guidare gli sforzi sulla risoluzione dei problemi e ottimizzare l’espressione della proteina.

Questo metodo consente anche la rilevazione di “orifizio”; una molecola di tRNA aminoacylated con un aminoacido non-affine. Aminoacylation di aminoacidi diversi può causare un tRNA per la migrazione con velocità leggermente diverse attraverso i gel di poliacrilammide^1,11. In alcuni casi, il metodo utilizzabile anche per distinguere diversi modifica modelli altrimenti identici tRNAs³.

Un altro istituita procedura biochimica per l’indagine di tRNA livelli di carica è periodato ossidazione. Il metodo si basa sull’osservazione che periodato aminoacylated tRNA è protetto dall’ossidazione e uncharged tRNA non è. Periodato dopo trattamento di ossidazione della ricarica del tRNA viene utilizzata per stimare i livelli di carica del RNA raccolto. Tuttavia, la ricarica dei diversi tRNAs ha dimostrata di essere colpiti dal trattamento fornendo così qualche inesattezza¹². Il metodo qui presentato misure carico direttamente da RNA purificato, escludendo quindi eventuali pregiudizi da reazioni chimiche o enzimatiche. Una limitazione di questo metodo è che solo una specie di tRNA viene rilevato in un momento, così anche se la stessa Northern blot può essere spogliato e reprobed per più tRNAs, è che richiede tempo e un po ‘ laborioso per raccogliere dati su molti tRNAs.

Un modo affidabile di normalizzazione dei campioni a vicenda è fondamentale negli studi dove l’obiettivo è quello di confrontare i livelli relativi di una molecola attraverso diversi campioni. Qui introduciamo una procedura di normalizzazione per RNA dove una piccola aliquota di Escherichia coli cellule che overexpressing il tRNA rara^selC è aggiunto come spike-in per tutti i campioni sperimentali prima Purificazione RNA. Questo metodo è utile non solo quando si esaminano i tRNAs ma per quantificazione relativa di ogni specie di RNA quando la messa a punto sperimentale è tale che nessun RNA endogeno può essere attendibile per essere presenti alla stessa concentrazione cellulare in tutti i campioni. Ad esempio, il livello di una “pulizia” RNA ribosomiale RNA-come spesso viene utilizzato come un riferimento endogeno per confrontare le relative quantità di RNA un altro tra i diversi campioni¹³. Ma questo è di scarsa utilità se la concentrazione cellulare del RNA riferimento varia tra i campioni, come può essere il caso per il RNA ribosomiale (rRNA) se il campionamento avviene durante un sforzo risposta^15,16,17 o durante entrata in fase stazionaria¹⁷. L’aggiunta di spike-in cellule di campioni sperimentali prima Purificazione RNA fornisce un modo solido e preciso di normalizzazione indipendenti del setup di campionamento. Un altro modo di standardizzazione è l’aggiunta di uno o più RNA di spike ai campioni sperimentali dopo la purificazione di RNA. Tuttavia, questo metodo non tiene conto delle eventuali differenze di recupero di RNA tra campioni.

Utilizzando cellule di Escherichia coli che iperesprimere il riferimento RNA come spike-in celle (Vedi Figura 1) in un esperimento su Escherichia coli ha lo svantaggio che risulta inoltre di una piccola quantità di esogeno Escherichia coli totale RNA per la campioni. Correggiamo per questa aggiunta analizzando un campione contenente solo spike-in celle in parallelo con i campioni sperimentali (Vedi il Northern blot nel Figura 2, lane etichettato “selC”). Il protocollo presentato è stato sviluppato per e. coli K-12 ma è probabile che sia applicabile per la maggior parte delle specie batterica.