ठहराव की बहुतायत और चार्ज करने के स्तर के हस्तांतरण RNAs में ई कोलाई
Summary
यहाँ हम सीधे हस्तांतरण शाही सेना के स्तर के साथ-साथ हस्तांतरण आरएनए, या किसी अन्य लघु आरएनए के सापेक्ष स्तर की तुलना करने के लिए एक तरीका है, स्पाइक के अलावा के आधार पर विभिन्न नमूनों के साथ-साथ स्थानांतरण आरएनए चार्ज स्तरों को मापने के लिए एक विधि प्रस्तुत एक संदर्भ जीन व्यक्त कोशिकाओं ।
Abstract
स्थानांतरण आरएनए (tRNA) किसी भी जीव में शोधों की मशीनरी का एक अनिवार्य हिस्सा है । tRNAs बाँध और अनुवाद ribosome करने के लिए अमीनो एसिड हस्तांतरण. अलग tRNAs के सापेक्ष स्तर, और कुल tRNA के लिए aminoacylated tRNA के अनुपात, चार्ज स्तर के रूप में जाना जाता है, सटीकता और अनुवाद की गति निर्धारित करने में महत्वपूर्ण कारक हैं । इसलिए, बहुतायत और tRNAs के स्तर चार्ज महत्वपूर्ण चर को मापने जब प्रोटीन संश्लेषण का अध्ययन कर रहे हैं, विभिंन तनाव की स्थिति के तहत उदाहरण के लिए । यहां, हम कटाई tRNA के लिए एक विधि का वर्णन और सीधे दोनों रिश्तेदार बहुतायत और ई कोलाईमें विशिष्ट tRNA प्रजातियों के निरपेक्ष चार्ज स्तर को मापने । tRNA को इस तरह से काटा जाता है कि tRNA और उसके अमीनो अम्ल के बीच labile बंधन को संरक्षित रखा जाता है । आरएनए तो जेल ट्रो और उत्तरी सोख्ता, जो आरोप लगाया और uncharged tRNAs की जुदाई में परिणाम के अधीन है । विभिन्न नमूनों में विशिष्ट tRNAs का स्तर सामान्यीकरण के लिए स्पाइक-इन कक्षों के अतिरिक्त होने के कारण तुलना की जा सकती है. आरएनए शुद्धि करने से पहले, हम ई. कोलाई कोशिकाओं है कि प्रत्येक नमूने के लिए दुर्लभ tRNAselC reproducing के 5% जोड़ें । इसके बाद एक नमूने में ब्याज की tRNA प्रजातियों की मात्रा को एक ही नमूने में tRNAselC की मात्रा को सामान्यीकृत कर लिया जाता है । स्पाइक के अलावा-इन कोशिकाओं में आरएनए शुद्धि से पहले, यह भी नमूने के बीच सेल lysis दक्षता में किसी भी मतभेद के लिए खातों कि शुद्ध स्पाइक के अलावा अधिक लाभ है RNAs में ।
Introduction
निंनलिखित में, हम विशिष्ट tRNAs को बढ़ाता है और उत्तरी सोख्ता द्वारा उनके चार्ज स्तरों को मापने के लिए एक विधि प्रस्तुत करते हैं । विधि एक पहली Varshney एट अल द्वारा विकसित की तकनीक पर आधारित है । 1. trichloroacetic एसिड (टीसीए) में कोशिकाओं की कटाई और आरएनए शुद्धि भर में 0 डिग्री सेल्सियस पर नमूनों रखने के द्वारा, tRNA और एमिनो एसिड के बीच एस्टर बांड2,3,4संरक्षित है । Aminoacylated tRNAs जेल ट्रो और उत्तरी सोख्ता द्वारा अपने nonacylated समकक्षों से प्रतिष्ठित किया जा सकता है, जेल में Aminoacylated tRNA की कमी गतिशीलता के कारण, covalently बाउंड अमीनो एसिड की वजह से5. इसके अतिरिक्त, हम tRNA मात्रा में स्पाइक-इन कोशिकाओं के अलावा शायद ही कभी इस्तेमाल किया tRNAselC 4का उपयोग करके सामांय के लिए एक प्रोटोकॉल मौजूद ।
tRNAs जीवाणु कोशिका में सबसे प्रचुर मात्रा में अणुओं और अनुवाद मशीनरी का एक बिल्कुल महत्वपूर्ण हिस्सा हैं । tRNAs अमीनो एसिड बाँध और अनुवाद ribosomes करने के लिए उन्हें हस्तांतरण. अमीनो अम्ल की बाइंडिंग को tRNAs (aminoacylation या चार्जिंग) को aminoacyl tRNA synthetases द्वारा सुकर बनाया जाता है. विभिंन आरोप लगाया tRNAs के सापेक्ष बहुतायत प्रोटीन संश्लेषण की निष्ठा को सुनिश्चित करने के लिए महत्वपूर्ण है, क्योंकि cognate के प्रतिनिधित्व एक दी दूत आरएनए (mRNA) codon के लिए आरोप लगाया tRNA संभावना बढ़ जाती है कि एक के पास-cognate tRNA होगा ग़लती से ribosome6पर बढ़ती पॉलीपेप्टाइड श्रृंखला के लिए अपने एमिनो एसिड उद्धार । शुल्क tRNA के महत्व को एक tRNA के चार्ज स्तरों में एक गंभीर गिरावट के लिए ई. कोलाई सेल की व्यापक प्रतिक्रिया में परिलक्षित होता है; कड़े जवाब । कड़े जवाब के दौरान tRNAs के संश्लेषण, राइबोसोमल RNAs और सबसे mRNAs विशिष्ट एमिनो एसिड के साथ जुड़े mRNAs की प्रतिलेखन के पक्ष में कम है और तनाव से बचने, और कोशिकाओं की वृद्धि दर नाटकीय रूप से कम है7 . इसके अलावा, हमारे द्वारा हाल ही में काम और दूसरों को पता चला है कि ई. कोलाई सक्रिय रूप से प्रतिक्रिया में अपने tRNA के बहुमत को नीचा दिखा दिया है कि सीमा अनुवाद4,8, सुझाव है कि tRNA स्तर के समायोजन हो सकता है ऐसे तनावों से मुकाबला करने के लिए महत्वपूर्ण है । इस प्रकार, tRNA बहुतायत और चार्ज स्तरों के विश्वसनीय माप पूरी तरह से बैक्टीरियल तनाव प्रतिक्रियाओं को समझने के लिए एक महत्वपूर्ण उपकरण होगा ।
ई. कोलाई आमतौर पर संयोजक प्रोटीन और प्रजातियों के बीच codon उपयोग में अंतर के कारण व्यक्त करने के लिए प्रयोग किया जाता है, इष्टतम अभिव्यक्ति एक समस्या अक्सर9का सामना करना पड़ा है । यह अतिरिक्त tRNAs की अभिव्यक्ति से दरकिनार किया जा सकता है संयोजक mRNA10अनुवाद की जरूरत है । ऐसे उपभेदों में tRNA चार्ज स्तरों की माप समस्या निवारण के प्रयासों का मार्गदर्शन और मदद का अनुकूलन प्रोटीन अभिव्यक्ति सकता है ।
इस विधि भी “का निर्वहन” का पता लगाने में सक्षम बनाता है; एक tRNA अणु एक गैर cognate एमिनो एसिड के साथ aminoacylated । अलग एमिनो एसिड द्वारा Aminoacylation एक tRNA polyacrylamide जैल1,11के माध्यम से थोड़ा अलग वेग के साथ स्थानांतरित करने के लिए कारण हो सकता है । कुछ मामलों में, विधि भी अन्यथा समान tRNAs पर विभिन्न संशोधन पैटर्न भेद करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता3.
tRNA चार्ज स्तरों की जांच के लिए एक और स्थापित जैव रासायनिक प्रक्रिया periodate ऑक्सीकरण है । विधि अवलोकन कि aminoacylated tRNA periodate ऑक्सीकरण और uncharged tRNA से सुरक्षित नहीं है पर निर्भर करता है । tRNA के रिचार्जिंग periodate ऑक्सीकरण उपचार के बाद काटा आरएनए के चार्ज स्तरों का अनुमान लगाने के लिए प्रयोग किया जाता है । हालांकि, कई tRNAs के रिचार्जिंग इस प्रकार कुछ अशुद्धि12उपलब्ध कराने के उपचार से प्रभावित होना दिखाया गया है । विधि यहां प्रस्तुत उपायों शुद्ध आरएनए से सीधे चार्ज, इस प्रकार रासायनिक या एंजाइमी प्रतिक्रियाओं से किसी भी पूर्वाग्रह को छोड़कर । इस विधि की एक सीमा है कि केवल एक tRNA प्रजातियों एक समय में पता चला है, इसलिए हालांकि एक ही उत्तरी दाग छीन लिया जा सकता है और कई tRNAs के लिए फिर से जांच की, यह समय लेने वाली है और कुछ हद तक tRNAs पर डेटा इकट्ठा करने के लिए श्रमसाध्य है ।
एक दूसरे के लिए नमूनों को सामान्य करने का एक विश्वसनीय तरीका है जहां लक्ष्य विभिन्न नमूनों में एक अणु के सापेक्ष स्तर की तुलना करने के लिए है अध्ययन में महत्वपूर्ण है. यहां हम आरएनए के लिए एक सामान्यता प्रक्रिया का परिचय देते हैं जहां दुर्लभ tRNAselC को व्यक्त करने वाले ई. कोलाई कोशिकाओं की एक छोटी सी aliquot को आरएनए शुद्धि से पहले सभी प्रायोगिक नमूनों में स्पाइक के रूप में जोड़ा जाता है । इस विधि जब प्रयोगात्मक सेटअप ऐसी है कि कोई अंतर्जात आरएनए सभी नमूनों में एक ही सेलुलर एकाग्रता पर उपस्थित होने के लिए भरोसा किया जा सकता है जब tRNAs की जांच लेकिन आरएनए के किसी भी प्रजाति के रिश्तेदार ठहराव के लिए उपयोगी है । उदाहरण के लिए, एक “गृह व्यवस्था” आरएनए की तरह राइबोसोमल आरएनए का स्तर अक्सर एक अंतर्जात संदर्भ के रूप में विभिन्न नमूनों के बीच एक और आरएनए के सापेक्ष मात्रा13की तुलना करने के लिए प्रयोग किया जाता है. लेकिन इस छोटे से उपयोग की है अगर संदर्भ आरएनए के सेलुलर एकाग्रता नमूनों के बीच बदलता है, राइबोसोमल आरएनए के लिए मामला हो सकता है के रूप में अगर नमूना एक तनाव प्रतिक्रिया के दौरान होता है15,16,17 या दौरान स्थिर चरण17में प्रवेश । कील-आरएनए शुद्धि करने से पहले प्रयोगात्मक नमूनों को स्पाइक में कोशिकाओं के अलावा नमूना सेटअप के स्वतंत्र सामान्यीकरण का एक ठोस और सही तरीका प्रदान करता है. मानकीकरण का एक अन्य तरीका आरएनए शुद्धि के बाद प्रयोगात्मक नमूनों को RNAs में एक या अधिक स्पाइक के अलावा है. हालांकि, इस विधि के नमूनों के बीच आरएनए वसूली में किसी भी अंतर के लिए खाता नहीं है ।
ई. कोलाई कोशिकाओं का प्रयोग जो संदर्भ आरएनए को स्पाइक-इन कोशिकाओं के रूप में व्यक्त करता है ( चित्रा 1) ई. कोलाई पर एक प्रयोग में यह दोष है कि यह exogenous ई. कोलाई कुल आरएनए की एक छोटी राशि के अतिरिक्त परिणाम है नमूने. हम प्रयोगात्मक नमूनों के साथ समानांतर में कोशिकाओं में केवल स्पाइक युक्त नमूने का विश्लेषण करके इस इसके अलावा के लिए सही ( चित्रा 2में उत्तरी दाग देखें, लेन लेबल “selC”). प्रस्तुत प्रोटोकॉल ई. कोलाई K-12 के लिए विकसित की है, लेकिन सबसे जीवाणु प्रजातियों के लिए लागू होने की संभावना है ।
Protocol
1. बैक्टीरियल संस्कृतियों की तैयारी । एक संस्कृति के साथ Erlenmeyer कुप्पी में सभी संस्कृतियों बढ़ने/सबसे अधिक 1/6 पर की कुप्पी मात्रा अनुपात । एक ठेठ प्रयोगात्मक सेटअप में, ३७.० & #176 पर संस्कृतियों बढ़ती ह…
Representative Results
Discussion
इस प्रोटोकॉल का वर्णन कैसे एक साथ विशिष्ट ई. कोलाई tRNAs के चार्ज स्तर को मापने के लिए और विभिंन नमूनों में tRNAs के सापेक्ष स्तर की तुलना करें । प्रोटोकॉल के महत्वपूर्ण बिंदुओं 1 हैं) इस तरह के नमूनों में सं?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
लेखकों ने उत्कृष्ट तकनीकी सहायता के लिए मेरीट वरर का धन्यवाद किया । इस काम के लिए स्वतंत्र अनुसंधान के लिए डेनिश परिषद द्वारा समर्थित था । प्राकृतिक विज्ञान [1323-00343B] और डेनमार्क नेशनल रिसर्च फाउंडेशन [DNRF120] ।
Materials
| Urea | Merck | 57-13-6 | Purity >99% |
| Polyacrylamide | Serva | 79-06-7 | |
| Bis (N,N'-Methylene-bis-acrylamide) | BIO-RAD | 161-0201 | |
| Trichloroacetic acid (TCA) | Sigma | 76-03-9 | |
| Phenol | Merck | 108-95-2 | |
| IPTG | |||
| Glucose | |||
| Sodium Acetate | |||
| EDTA | |||
| Ethanol | |||
| Tris | |||
| Hydrochloric acid | |||
| Sodium Chloride | |||
| NaH2PO4 | |||
| Sodium Citrate | |||
| SDS | |||
| Herring Sperm DNA | Sigma | 100403-24-5 | |
| BSA | |||
| Polivinylpyrrolidone | |||
| Ficoll | |||
| P32 γATP | Perkin Elmer | ||
| DNA oligos (probes) | TAG Copenhagen | ||
| Hybond N+ membrane | GE Healthcare | RPN203B | |
| Crosslinker | |||
| Electroblotter | BIO-RAD | ||
| Typhoon FLA 7000 Scanner | GE Healthcare | 28955809 | |
| Spectrophotometer | |||
| Hydridization oven | |||
| Geiger-Müller tube | |||
| Phosphor imager screen | GE Healthcare | ||
| Hybridization tube | |||
| Culture Flasks | |||
| 1.5 ml microcentrifuge tubes | |||
| 20 ml centrifuge tubes | |||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Software | |||
| ImageQuant | GE Healthcare | ||
| Excel | Microsoft |
Referências
- Varshney, U., Lee, C. -. P., RajBhandary, U. L. Direct analysis of aminoacylation levels of tRNAs in vivo. Application to studying recognition of Escherichia coli initiator tRNA mutants by glutaminyl-tRNA synthetase. J Biol Chem. 266 (36), 24712-24718 (1991).
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