Dans ce qui suit, nous présentons une méthode pour quantifier les ARNt spécifiques et mesurer leur charge niveaux par Northern blot. La méthode est basée sur une technique développée par verite et al. ¹. par récolte des cellules dans l’acide trichloracétique (TCA) et de garder les échantillons à 0 ° C tout au long de la purification de RNA, la liaison ester entre l’ARNt et l’acide aminé est conservé^2,3,4. ARNt tRNALeu peut distinguer de leurs homologues nonacylated par électrophorèse sur gel et le transfert de Northern, dû à une diminution de la mobilité de la tRNALeu ARNt dans le gel, causé par l’ aminoacide covalente⁵. En outre, nous présentons un protocole pour normaliser les quantités ARNt par addition du spike-dans les cellules surexprimant la rarement utilisé tRNA^{selC 4}.

ARNt est des molécules plus abondants dans la cellule bactérienne et une partie indispensable de la machinerie de traduction. ARNt lie les acides aminés et les transférer sur les ribosomes traduction. La liaison des acides aminés d’ARNt (aminoacylation ou charge) est facilitée par l’aminoacyl tRNA synthétases. L’abondance relative des différents ARNt chargé est importante pour assurer la fidélité de la synthèse protéique, parce que la sous-représentation de l’apparenté facturés Qu’arnt pour un codon donné l’ARN messager (ARNm) augmente la probabilité d’un ARNt près-apparenté sera livrer par erreur son acide aminé à la chaîne de polypeptide croissant sur le ribosome⁶. L’importance de l’ARNt chargé est reflétée dans la vaste réponse de la cellule d’e. coli à une chute sévère dans les niveaux de charge d’un ARNt ; la réponse stricte. Au cours de la réponse stricte, la synthèse des ARNt, ARN ribosomal et la plupart des ARNm est abaissée en faveur de la transcription de l’ARNm spécifiques associées aux acides aminés la biosynthèse et du stress de survie, et le taux de croissance des cellules est abaissé de façon spectaculaire⁷ . En outre, des travaux récents par nous et d’autres ont montré qu’e. coli dégrade activement la majorité de son ARNt en réponse aux contraintes qui limitent la traduction^4,8, ce qui suggère que l’ajustement des niveaux ARNt peut être important pour faire face à ces contraintes. Ainsi, des mesures fiables de l’abondance de l’ARNt et niveaux de charge sera un outil important pour bien comprendre les réactions de stress bactérien.

E. coli est couramment utilisée pour exprimer la protéine recombinante et en raison des différences dans l’utilisation de codon entre espèces, expression sous-optimale est un problème souvent rencontré⁹. Ceci peut être contourné par l’expression des ARNt supplémentaires nécessaires pour la traduction des ARNm recombinants¹⁰. Mesures de tRNA charge niveaux dans ces souches pourraient orienter les travaux de dépannage et vous aider à optimiser l’expression de la protéine.

Cette méthode permet également la détection de « mischarging » ; une molécule de tRNA tRNALeu avec un aminoacide non apparenté. Aminoacylation par différents acides aminés peut entraîner un ARNt migrer avec des vitesses légèrement différentes à des gels de polyacrylamide^1,11. Dans certains cas, la méthode peut aussi servir à distinguer les modèles modification différente sur l’ARNt autrement identiques³.

Un autre a établi une procédure biochimique pour l’oxydation de l’enquête de l’ARNt niveaux de charge est périodique. La méthode repose sur l’observation que tRNALeu tRNA est protégé contre oxydation périodique et ARNt sans inculpation n’est pas. Le periodate après traitement d’oxydation la recharge de l’ARNt est utilisée pour estimer les niveaux de charge de l’ARN récolté. Toutefois, la recharge de plusieurs ARNt s’est avérée être affectées par le traitement, permettant ainsi une inexactitude¹². La méthode présentée ici des mesures directement à partir de l’ARN purifié de charge, ce qui exclut tout biais de réactions chimiques ou enzymatiques. Une des limites de cette méthode est qu’une seule espèce de tRNA est détectée à la fois, donc même si la même Northern blot peut être dépouillé et reprobed pour plusieurs ARNt, c’est beaucoup de temps et un peu laborieux à recueillir des données sur plusieurs ARNt.

Un moyen fiable de normaliser les échantillons entre eux est vital dans les études dont le but est de comparer les niveaux relatifs d’une molécule à travers différents échantillons. Ici, nous introduisons une procédure de normalisation pour l’ARN où une petite aliquote d’e. coli cellules surexprimant la rare tRNA^selC est ajoutée comme un épi-en à tous les échantillons expérimentaux avant purification RNA. Cette méthode est utile non seulement lors de l’examen des ARNt, mais pour la quantification relative de toutes les espèces d’ARN lorsque le montage expérimental est telle qu’aucun RNA endogène ne peut faire confiance pour être présents à la même concentration cellulaire dans tous les échantillons. Par exemple, le niveau d’un ARN ribosomal RNA-like « ménage » est souvent utilisé comme une référence endogène de comparer les quantités relatives d’un autre ARN entre les différents échantillons¹³. Mais cela est de peu d’utilité si la concentration cellulaire de l’ARN de référence varie selon les échantillons, comme peut être le cas pour les ARN ribosomiques en cas d’échantillonnage pendant un stress réponse^15,16,17 ou entrée en phase stationnaire¹⁷. L’ajout du spike-dans les cellules pour les échantillons expérimentaux avant purification RNA fournit un moyen solid et précis de normalisation indépendant de l’installation d’échantillonnage. Une autre façon de normalisation est l’ajout d’un ou plusieurs épi-en ARN aux échantillons expérimentaux après purification RNA. Toutefois, cette méthode ne tient pas compte des différences dans la récupération de RNA entre les échantillons.

À l’aide de cellules d’Escherichia coli qu’overexpress l’ARN de référence comme spike-dans les cellules (voir Figure 1) dans une expérience sur e. coli présente l’inconvénient qu’il résulte en outre d’une petite quantité d’exogène e. coli total ARN pour la échantillons. Nous corrigeons pour cet ajout en analysant un échantillon ne contenant que spike-dans des cellules en parallèle avec les échantillons expérimentaux (voir le Northern blot en Figure 2, lane, étiqueté « selC »). Le protocole présenté est développé pour e. coli K-12 mais est susceptible d’être applicable pour la plupart des espèces bactériennes.