In de volgende, presenteren we een methode voor het kwantificeren van de specifieke tRNAs en meten hun opladen niveaus door het noordelijke bevlekken. De methode is gebaseerd op een techniek die het eerst ontwikkeld door Varshney et al. ¹. door het oogsten van cellen in Trichloorazijnzuur (TCA) en het houden van de monsters bij 0 ° C gedurende de RNA-zuivering, is de ester-binding tussen het tRNA en het aminozuur geconserveerde^2,3,4. Aminoacylated tRNAs kunnen worden onderscheiden van hun nonacylated tegenhangers door elektroforese van het gel en het noordelijke bevlekken, zijner tijd voor een verminderde mobiliteit van de aminoacylated in de gel, veroorzaakt door de covalent gebonden aminozuur⁵tRNA. Daarnaast presenteren we een protocol voor het normaliseren van tRNA hoeveelheden door toevoeging van spike-cellen de zelden gebruikte tRNA^{selC 4}overexpressing.

tRNAs zijn enkele van de meest voorkomende moleculen in de bacteriële cel en een absoluut noodzakelijk onderdeel van de machine vertaling. tRNAs binden van aminozuren en deze overbrengen naar de vertalen ribosomen. De binding van aminozuren te tRNAs (aminoacylation of opladen) wordt vergemakkelijkt door het aminoacyl-tRNA-synthetases. De relatieve overvloed van verschillende geladen tRNAs is belangrijk om te zorgen voor de trouw van de eiwitsynthese, omdat ondervertegenwoordiging van de cognate betalen dat tRNA voor een bepaalde boodschapper-RNA (mRNA) codon verhoogt de waarschijnlijkheid dat een in de buurt van-cognate tRNA zal ten onrechte haar aminozuur aan de groeiende polypeptide-keten op het ribosoom⁶leveren. Het belang van geladen tRNA wordt weerspiegeld in de uitgebreide reactie van de E. coli cel tot een ernstige daling in de laden niveaus van een tRNA; de strenge reactie. Tijdens de strenge reactie is de synthese van tRNAs, ribosomaal RNAs en meeste mRNAs verlaagd ten gunste van de transcriptie van specifieke mRNAs aminozuur biosynthese en stress survival is gekoppeld en het groeitempo op jaarbasis van de cellen wordt drastisch verlaagd⁷ . Bovendien heeft recent werk van ons en anderen aangetoond dat E. coli actief de meerderheid van haar tRNA in reactie op benadrukt dat beperken vertaling^{4,8 degradeert}, suggereren dat aanpassing van het tRNA niveaus mogelijk belangrijk voor het omgaan met dergelijke benadrukt. Betrouwbare metingen van tRNA abundanties en opladen niveaus zullen dus een belangrijk instrument voor het volledig begrijpen van bacteriële stress reacties.

E.coli wordt vaak gebruikt om uit te drukken van recombinante eiwitten en vanwege de verschillen tussen soorten in het codon gebruik, suboptimaal expressie is een probleem dat vaak geconfronteerd⁹. Dit kan worden omzeild door expressie van extra tRNAs nodig om te vertalen van de recombinante mRNA¹⁰. Metingen van tRNA opladen niveaus in dergelijke spanningen kunnen begeleiden probleemoplossing inspanningen en optimaliseren van eiwit expressie.

Deze methode maakt het ook mogelijk de detectie van “mischarging”; een tRNA molecuul aminoacylated met een niet-cognate aminozuur. Aminoacylation door verschillende aminozuren kan veroorzaken een tRNA migreren met lichtjes verschillende snelheden t/m polyacrylamide gels^1,11. In sommige gevallen kan de methode ook worden gebruikt om te onderscheiden van andere wijziging patronen op identieke tRNAs³.

Andere vastgesteld biochemische procedure voor het onderzoek van tRNA opladen niveaus oxidatie is Perjodaat. De methode is gebaseerd op de observatie dat aminoacylated tRNA is beschermd tegen Perjodaat oxidatie en ongeladen tRNA niet. Na Perjodaat oxidatie behandeling het opladen van het tRNA wordt gebruikt voor het schatten van het opladen niveaus van de geoogste RNA. Echter, het opladen van verschillende tRNAs is aangetoond te worden beïnvloed door de behandeling waardoor sommige onnauwkeurigheid¹². De methode gepresenteerde maatregelen opladen rechtstreeks uit gezuiverde RNA, dus exclusief eventuele vooroordelen van chemische of enzymatische reacties. Een beperking van deze methode is dat slechts één soort tRNA wordt ontdekt tegelijkertijd, zodat hoewel het dezelfde Noord vlek kan worden gestript en reprobed voor meerdere tRNAs, is het tijdrovend en enigszins moeizaam gegevens te verzamelen over de vele tRNAs.

Een betrouwbare manier van normaliseren monsters aan elkaar is van vitaal belang in studies waar het doel is om het relatieve niveau van een molecule van verschillende monsters met elkaar vergelijken. Hier introduceren we een normalisatie-procedure voor RNA waar een kleine hoeveelheid van E. coli cellen overexpressing de zeldzame tRNA^selC wordt toegevoegd als een piek aan alle experimentele monsters vóór RNA zuivering. Deze methode is nuttig niet alleen bij de behandeling van tRNAs, maar voor relatieve kwantificering van elke soort van RNA wanneer de experimentele opzet is zodanig dat geen endogene RNA kan worden vertrouwd te presenteren in de dezelfde cellulaire concentraties in alle monsters. Bijvoorbeeld, wordt het niveau van een “schoonmaak” RNA-achtige ribosomaal RNA vaak gebruikt als een endogene verwijzing naar het vergelijken van de relatieve hoeveelheden van een andere RNA tussen verschillende monsters¹³. Maar dit is van weinig nut als de cellulaire concentratie van de referentie-RNA tussen de monsters varieert, zoals het geval voor ribosomaal RNA zijn kan als de bemonstering plaatsvindt tijdens een stress reactie^15,16,17 of inwerkingtreding van de stationaire fase¹⁷. De toevoeging van spike-cellen aan de experimentele monsters vóór RNA zuivering biedt een solide en nauwkeurige manier van normalisatie onafhankelijk is van de bemonstering setup. Een andere manier van normalisatie is de toevoeging van een of meer spike-in RNAs aan de experimentele monsters na zuivering van RNA. Echter, houdt deze methode geen rekening met eventuele verschillen in RNA herstel tussen de monsters.

Cuvetten van E. coli die overexpress de verwijzing RNA als spike-cellen (Zie Figuur 1) in een experiment met E. coli heeft het nadeel dat het resultaten bovendien van een kleine hoeveelheid exogene E. coli total RNA aan de monsters. We corrigeren voor deze toevoeging door het analyseren van een steekproef met alleen spike-in cellen parallel met de experimentele monsters (Zie de noordelijke vlek in Figuur 2, lane met het label “selC”). Het protocol gepresenteerd is ontwikkeld voor E. coli K-12 maar dreigt te worden die van toepassing zijn voor de meeste bacteriesoorten.