I følgende præsenterer vi en metode til kvantificering af specifikke tRNAer og måling af deres opladning niveauer af nordlige blotting. Metoden er baseret på en teknik, først udviklet af Varshney et al. ¹. ved høst celler i trichloreddikesyre (TCA) og holde prøverne ved 0 ° C i hele RNA oprensning, ester obligation mellem tRNA og aminosyren er bevaret^2,3,4. Aminoacylated tRNAer kan skelnes fra deres nonacylated kolleger ved gelelektroforese og nordlige blotting, grund til en nedsat bevægelighed af aminoacylated tRNA i gelen, forårsaget af kovalent bundne aminosyre⁵. Derudover præsenterer vi en protokol til normalisering tRNA mængder ved tilsætning af spike-i celler overekspression af sjældent brugte tRNA^{selC 4}.

tRNAer er nogle af de mest udbredte molekyler i cellen bakteriel og en helt vitale del af oversættelse maskiner. tRNAer binder aminosyrer og overføre dem til at oversætte ribosomer. Bindingen af aminosyrer til tRNAer (aminoacylation eller opladning) lettes af aminoacyl tRNA synthetases. Den relative forekomst af forskellige ladede tRNAer er vigtig for at sikre troskab af proteinsyntesen, fordi underrepræsentation af cognate opkrævet tRNA for en given messenger RNA (mRNA) codon øger sandsynligheden for, at en nær cognate tRNA vil fejlagtigt levere sin aminosyre til den voksende polypeptid kæde på ribosom⁶. Betydningen af ladede tRNA afspejles i den omfattende svar af E. coli celle en alvorlig nedgang i Opladningsniveauet for en tRNA; den strenge svar. Under den strenge svar syntesen af tRNAer, ribosomale RNA’er og de fleste mRNAs er sænket til fordel for transskription af specifikke mRNAs tilknyttet aminosyre biosyntese og stress overlevelse og vækst af celler er sænket drastisk⁷ . Desuden har de seneste arbejde af os og andre vist, at E. coli aktivt nedbryder fleste af sine tRNA svar på understreger, at begrænser oversættelse^4,8, tyder på, at justering af tRNA niveauer kan være vigtigt for at håndtere sådanne belastninger. Således, pålidelige målinger af tRNA mængder og opladning niveauer vil være et vigtigt redskab for at fuldt ud forstå bakteriel stress svar.

E.coli er almindeligt anvendt til at udtrykke rekombinante protein og på grund af forskelle i codon skik mellem arter, suboptimal udtryk er et problem, der ofte står over for⁹. Dette kan omgås ved udtryk for yderligere tRNAer nødvendig for at oversætte den rekombinante mRNA¹⁰. Målinger af tRNA opladning niveauer i disse stammer kan guide fejlfinding bestræbelser og hjælpe med at optimere protein udtryk.

Denne metode giver også mulighed for påvisning af “mischarging”; en tRNA-molekyle aminoacylated med en ikke-cognate aminosyre. Aminoacylation af forskellige aminosyrer kan forårsage en tRNA overflytte med lidt forskellige hastigheder gennem polyacrylamidgeler^1,11. I nogle tilfælde kan metoden også bruges til at skelne mellem forskellige ændring mønstre på ellers identiske tRNAer³.

En anden etableret biokemiske procedure for undersøgelse af tRNA opladning niveauer er periodate oxidation. Metoden er baseret på den iagttagelse, at aminoacylated tRNA er beskyttet mod periodate oxidation og tomt tRNA er ikke. Efter periodate oxidation behandling genopladning af tRNA bruges til at beregne opladningsniveauet af den høstede RNA. Dog har genopladning af flere tRNAer vist sig at være påvirket af den behandling, hvilket giver nogle unøjagtighed¹². Metoden, der præsenteres her foranstaltninger opladning direkte fra oprensede RNA, således udelukke eventuelle afvigelser fra kemisk eller enzymatisk reaktioner. En begrænsning af denne metode er, at kun én tRNA arter opdages på et tidspunkt, så selv om den samme nordlige duppes kan strippet og reprobed for flere tRNAer, det er tidskrævende og noget besværlige at indsamle data på mange tRNAer.

En pålidelig måde at normalisere prøver til hinanden er afgørende i undersøgelser, hvor målet er at sammenligne de relative niveauer i et molekyle på tværs af forskellige prøver. Her har vi indføre en normalisering procedure for RNA hvor en lille alikvot af E. coli celler overekspression af sjældne tRNA^selC er tilføjet som en spike-i til alle de eksperimentelle prøver før RNA oprensning. Denne metode er nyttig ikke kun ved behandlingen af tRNAer men for relativ kvantificering af enhver art af RNA når opsætningen af eksperimenterende er sådan, at ingen endogene RNA kan have tillid til at være præsentere på den samme cellulære koncentration i alle prøver. For eksempel, bruges niveau af en “husholdning” RNA-lignende ribosomale RNA ofte som en endogen reference at sammenligne de relative mængder af et andet RNA mellem forskellige prøver¹³. Men dette er til megen nytte, hvis den cellulære koncentration af reference RNA varierer mellem prøver, som kan være tilfældet for ribosomale RNA, hvis prøveudtagningen sker under en stress reaktion^15,16,17 eller under indtræden i stationær fase¹⁷. Tilsætning af spike celler til de eksperimentelle prøver før RNA oprensning giver en solid og præcis måde af normalisering uafhængigt af opsætningen for prøveudtagning. En anden måde at standardisering er tilføjelsen af en eller flere spike-i RNA’er til de eksperimentelle prøver efter RNA oprensning. Men denne metode ikke tager højde for eventuelle forskelle i RNA opsving mellem prøver.

Ved hjælp af E. coli celler at overexpress reference RNA som spike-i celler (Se figur 1) i et eksperiment på E. coli har den ulempe, at det fremgår desuden af en lille mængde af eksogene E. coli alt RNA til den prøver. Vi korrigere for denne tilsætning ved at analysere en prøve, der indeholder kun spike-i celler sideløbende med de eksperimenterende prøver (se den nordlige duppes i figur 2, lane mærket “selC”). Protokollen præsenteret er udviklet til E. coli K-12 men er tilbøjelige til at være gældende for de fleste bakteriearter.