في ما يلي، نقدم طريقة لتحديد كمية محددة ترناس وقياس فرض رسوم على المستويات من النشاف الشمالية. الأسلوب الذي يستند إلى تقنية وضعتها أولاً فارشنيي et al. ¹-حصاد الخلايا إلى حمض التريكلوروسيتيك (TCA) وحفظ العينات في 0 درجة مئوية في جميع أنحاء تنقية الحمض النووي الريبي، هو السندات إستر بين الحمض الريبي النووي النقال والأحماض الأمينية المصانة^2،،من³⁴. ترنس أمينواسيلاتيد يمكن تمييز من نظرائهم نوناسيلاتيد هلام التفريد وشمال النشاف، يرجع إلى تنقل انخفض أمينواسيلاتيد الحمض الريبي النووي النقال في الهلام، الناجمة عن الأحماض الأمينية تساهمي ملزمة⁵. بالإضافة إلى ذلك، فإننا نقدم بروتوكول لتطبيع كميات الحمض الريبي النووي النقال بالإضافة إلى المصطلحات الخاصة في الخلايا overexpressing^سيلك الحمض الريبي النووي النقال نادراً ما تستخدم ⁴.

ترنس بعض من الجزيئات الأكثر وفرة في الخلية البكتيرية وجزء حيوي للغاية للترجمة الآلية. ترناس ربط الأحماض الأمينية ونقلها إلى ترجمة ريبوسوم. ربط الأحماض الأمينية ترنس (أمينواسيليشن أو شحن) يسر aminoacyl الحمض الريبي النووي النقال سينثيتاسيس. الوفرة النسبية لمختلف ترنس مشحونة مهم لضمان الدقة تخليق البروتين، لأنه اتهم التمثيل الناقص لقرابة الحمض الريبي النووي النقال كودون معين رسول من الحمض النووي الريبي (مرناً) يزيد من احتمال أن سيكون القرب من قرابة الحمض الريبي النووي النقال خطأ تسليم بالأحماض الأمينية في سلسلة ببتيد المتزايد في الريبوسوم⁶. وتتجلى الأهمية للحمض الريبي النووي النقال مشحونة باستجابة واسعة النطاق من الخلية كولاي إلى هبوط حاد في مستويات مشحون الحمض الريبي النووي النقال؛ استجابة صارمة. خلال الاستجابة الصارمة هو خفض التوليف ترنس والكشف الريباسي مرناس معظم صالح نسخ مرناس المحددة المرتبطة ببقاء الحمض الأميني الحيوي والإجهاد، وهو خفض معدل نمو الخلايا هائلة⁷ . وعلاوة على ذلك، أظهرت مؤخرا العمل لنا ولغيرنا أن كولاي يحط بنشاط غالبية الحمض الريبي النووي النقال ردا على تشدد على أن الحد من ترجمة^4،8، مما يوحي بأن تعديل المستويات الحمض الريبي النووي النقال الهامة للتعامل مع هذه الضغوط. وهكذا، سوف تكون قياسات موثوقة من وفرة الحمض الريبي النووي النقال وفرض مستويات أداة هامة لفهم استجابات الضغط البكتيرية تماما.

القولونية يستخدم عادة للتعبير عن البروتين المؤتلف، ونظرا للاختلافات في استخدام كودون بين الأنواع، هو التعبير الأمثل غالباً ما واجهت مشكلة⁹. وهذا يمكن التحايل عليها بالتعبير عن ترناس الإضافية اللازمة لترجمة مرناً المؤتلف¹⁰. قياسات للحمض الريبي النووي النقال فرض مستويات في هذه السلالات يمكن توجيه جهود استكشاف الأخطاء وإصلاحها والمساعدة في تحسين التعبير البروتين.

هذا الأسلوب يمكن أيضا الكشف عن “ميشارجينج”؛ أمينواسيلاتيد جزيء الحمض الريبي النووي النقال مع من الأحماض الأمينية غير قرابة. قد يسبب أمينواسيليشن بالأحماض الأمينية مختلفة من الحمض الريبي النووي النقال لترحيل مع سرعات مختلفة قليلاً عن طريق الجل بولياكريلاميدي^1،11. وفي بعض الحالات، يمكن أيضا استخدام الأسلوب التمييز بين أنماط مختلفة التعديل على خلاف ذلك مماثلة ترنس³.

آخر أنشأ الإجراء البيوكيميائية للتحقيق في فرض مستويات الحمض الريبي النووي النقال هو فوق يودات الأكسدة. الأسلوب يعتمد على ملاحظة مفادها أن أمينواسيلاتيد الحمض الريبي النووي النقال محمي من فوق يودات الأكسدة وليس من دون توجيه تهمة إليه الحمض الريبي النووي النقال. بعد فوق يودات علاج الأكسدة تغذيتها الحمض الريبي النووي النقال يستخدم لتقدير مستويات الشحن من الجيش الملكي النيبالي المقطوع. ومع ذلك، قد تبين تغذيتها ترنس عدة تتأثر بالعلاج وبالتالي توفير بعض عدم الدقة¹². الطريقة المعروضة هنا تدابير الشحن مباشرة من تنقية الجيش الملكي النيبالي، وتستبعد بالتالي أي تحيز من التفاعلات الكيميائية أو الانزيمية. واحد الحد من هذا الأسلوب الكشف عن تلك الأنواع الحمض الريبي النووي النقال واحد فقط في كل مرة، حتى على الرغم من أن لطخة الشمالية نفسها يمكن تجريده وريبروبيد ترناس متعددة، أنها مضيعة للوقت وشاقة إلى حد ما جمع البيانات بشأن العديد من ترناس.

طريقة يمكن الاعتماد عليها لتطبيع عينات لبعضها البعض أمر حيوي في الدراسات حيث أن الهدف مقارنة المستويات النسبية لجزيء عبر عينات مختلفة. نقدم لك هنا إجراء تطبيع للجيش الملكي النيبالي حيث يتم إضافة قاسمة صغيرة كولاي الخلايا overexpressing الحمض الريبي النووي النقال نادرة^سيلك كالمصطلحات خاصة في لجميع العينات التجريبية قبل تنقية الحمض النووي الريبي. يعد هذا الأسلوب مفيداً عندما يكون الإعداد التجريبية مثل لا الحمض النووي الريبي الذاتية التي يمكن أن تكون موثوق بها أن يقدم ليس فقط عند دراسة ترنس لكن للتحديد الكمي النسبي لأي أنواع من الحمض النووي الريبي في نفس تركيز الخلوية في جميع العينات. على سبيل المثال، غالباً ما يستخدم مستوى “التدبير المنزلي” مثل الحمض النووي الريبي الريباسي الرنا كمرجع ذاتية لمقارنة الكميات النسبية للجيش الملكي النيبالي آخر بين مختلف عينات¹³. ولكن هذا الاستخدام القليل إذا كان تركيز الجيش الملكي النيبالي الإشارة الخلوية يتراوح بين العينات، كما يمكن أن يكون الحال بالنسبة للحمض النووي الريبي الريباسي إذا أخذ العينات يحدث أثناء إجهاد استجابة^15،،من¹⁶¹⁷ أو الدخول إلى مرحلة ثابتة¹⁷. إضافة المصطلحات الخاصة في الخلايا للعينات التجريبية قبل تنقية الحمض النووي الريبي يوفر طريقة متينة ودقيقة لتطبيع المستقلة لإعداد العينات. وهناك طريقة أخرى للتوحيد القياسي هو إضافة واحد أو أكثر المصطلحات الخاصة في الكشف على العينات التجريبية بعد تنقية الحمض النووي الريبي. ومع ذلك، هذا الأسلوب لا تراعي أي اختلافات في الحمض النووي الريبي الانتعاش بين العينات.

استخدام خلايا كولاي أوفيريكسبريس هذا عيب الإشارة الجيش الملكي النيبالي كمسمار في الخلايا (انظر الشكل 1) في تجربة على كولاي التي يترتب عليها بالإضافة إلى ذلك كمية صغيرة من خارجية كولاي مجموع الجيش الملكي النيبالي عينات. علينا أن نصحح لهذه الإضافة عن طريق تحليل عينة تحتوي على إلا سبايك في الخلايا بالتوازي مع العينات التجريبية (انظر الشمالية لطخة في الشكل 2، لين المسمى “سيلك”). البروتوكول عرضت وضع من أجل K-12 كولاي ، لكن من المرجح أن تكون قابلة للتطبيق لمعظم الأنواع البكتيرية.