Диссекции человека сетчатки и ПЭС Хориоидея протеомного анализа
Summary
Человека Сетчатка состоит из функционально и молекулярно различных регионов, включая фовеа, макулы и периферийных сетчатки. Здесь мы описываем метод, с помощью биопсии удара и ручного удаления слоев ткани от человеческого глаза вскрыть и собирать эти собственный сетчатки регионов для вниз по течению протеомного анализа.
Abstract
Сетчатки человеческого состоит из чувств neuroretina и базовой сетчатки пигментированной эпителия (ПЭС), который твердо complexed сосудистой сосудистое слой. Различные регионы сетчатки отличаются анатомически и молекулярно, содействуя уникальных функций и демонстрации дифференциального восприимчивости к болезням. Протеомного анализа каждого из этих регионов и слоев может обеспечить жизненно понимание молекулярных процесса многих заболеваний, в том числе возрастной макулярной дегенерации (AMD), сахарный диабет и глаукома. Однако разделение сетчатки регионов и слоев важно, прежде чем количественные протеомного анализа может быть достигнуто. Здесь мы описываем метод вскрытия и коллекции фовеа, макулы и периферийных регионов сетчатки и лежащие в основе комплекс ПЭС хориоидея, с участием региональных удар биопсии и ручного удаления слоев ткани от человеческого глаза. Одномерный SDS-PAGE, а также ниже по течению протеомного анализа, например жидкостной хроматографии тандем масс-спектрометрии (LC-MS/MS), может использоваться для идентификации белков в каждом расчлененных слое сетчатки, выявление молекулярных биомаркеров для сетчатки заболевания.
Introduction
Сетчатка, НПП и сосудистое являются сложные ткани, которые демонстрируют важные региональные различия в выражение протеина, физиологические функции и патологических восприимчивости1,2. Например таких заболеваний, как возрастной макулярной дегенерации (AMD), пигментный ретинит и Центральной серозной ретинопатии продемонстрировать характерный локализации в фовеа, макулы или сетчатки периферии1,3, 4,6. Здесь мы представляем метод демонстрирует как собственный сетчатки, регионы самостоятельно предложат. Общая цель данного метода должна служить надежным ориентиром для коллекции образцов ткани из фовеа, макулы и периферийных регионов человеческого сетчатки и ПЭС Хориоидея протеомного анализа. Обоснование для разработки и использования этой методики является то, что помощью протеомного анализа этих конкретных регионов сетчатки, важно, что молекулярные исследования могут быть взяты в физиологических и патофизиологические функции этих регионов.
Этот подход обещает раскрыть proteomic основой для относительного регионального болезни восприимчивости и для облегчения идентификации новых конкретных терапевтических целей. Действительно протеомических исследований стекловидного тела и его взаимодействия с сетчатки предоставили понимание ключевых молекулярного состава и функции здоровые и больные ткани5,,78 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13. Однако, отсутствуют четкие сравнительные протеомных анализов различных регионов сетчатки. Этот метод поможет поддержать эти столь необходимые исследования, обеспечивая преимущества по сравнению с другими методами, продемонстрировав подход к сбору надежных и воспроизводимых ткани. Более того подход является очень доступным, воспользовавшись удар стандартного размера и легко доступны ткань биопсии инструменты. Наша техника подчеркивает соответствующие сбора и хранения тканей для протеомных обработки, что делает важные соображения для стабильности белка и деградации. Таким образом этот метод является наиболее подходящим для следователей, учитывая течению молекулярный анализ proteomic факторов.
Protocol
Representative Results
Discussion
После ткани коллекции, пробами и лечение являются важнейшим соображения14. Сохранение в жидком азоте отдается предпочтение перед химической фиксации, как последний может привести к повреждению структуры белков, которая может наклонять вниз по течению анализа. Кроме того с…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ВБМ-при поддержке грантов NIH [K08EY020530, R01EY024665, R01EY025225, R01EY024698 и R21AG050437], Дорис Дьюк благотворительного фонда Грант #: 2013103 и исследования для предотвращения слепоты (ОБН), Нью-Йорк, Нью -Йорк. MT и GV поддерживаются NIH Грант T32GM007337.
Materials
| 4-mm skin punch biopsy tool | Miltex | REF 33-34 | |
| 8-mm skin punch biopsy tool | Miltex | REF 33-37 | |
| 0.12 Colibri Forceps | Stephens Instruments | S5-1145 | |
| Wescott Scissors | Sklar Surgical Instruments | 64-3146 | |
| Microfuge tubes | Eppendorf | #022364111 | 1.5 mL |
| Liquid Nitrogen | Praxair, Inc. | 7727-37-9 [R] |
Referências
- Chirco, K. R., Sohn, E. H., Stone, E. M., Tucker, B. A., Mullins, R. F. Structural and molecular changes in the aging choroid: implications for age-related macular degeneration. Eye (Lond). , (2016).
- Zhang, P., et al. Defining the proteome of human iris, ciliary body, retinal pigment epithelium, and choroid. Proteomics. 16 (7), 1146-1153 (2016).
- Funke, S., et al. Glaucoma related Proteomic Alterations in Human Retina Samples. Sci Rep. 6, 29759 (2016).
- Decanini, A., et al. Human retinal pigment epithelium proteome changes in early diabetes. Diabetologia. 51 (6), 1051-1061 (2008).
- Skeie, J. M., Mahajan, V. B. Dissection of human vitreous body elements for proteomic analysis. J Vis Exp. (47), (2011).
- Skeie, J. M., Mahajan, V. B. Proteomic landscape of the human choroid-retinal pigment epithelial complex. JAMA Ophthalmol. 132 (11), 1271-1281 (2014).
- Skeie, J. M., Tsang, S. H., Mahajan, V. B. Evisceration of mouse vitreous and retina for proteomic analyses. J Vis Exp. (50), (2011).
- Skeie, J. M., et al. Proteomic analysis of vitreous biopsy techniques. Retina. 32 (10), 2141-2149 (2012).
- Skeie, J. M., Mahajan, V. B. Proteomic interactions in the mouse vitreous-retina complex. PLoS One. 8 (11), e82140 (2013).
- Mahajan, V. B., Skeie, J. M. Translational vitreous proteomics. Proteomics Clin Appl. 8 (3-4), 204-208 (2014).
- Skeie, J. M., Roybal, C. N., Mahajan, V. B. Proteomic insight into the molecular function of the vitreous. PLoS One. 10 (5), e0127567 (2015).
- Velez, G., et al. Precision Medicine: Personalized Proteomics for the Diagnosis and Treatment of Idiopathic Inflammatory Disease. JAMA Ophthalmol. 134 (4), 444-448 (2016).
- Velez, G., et al. Proteomic analysis of elevated intraocular pressure with retinal detachment. Am J Ophthalmol Case Rep. 5, 107-110 (2017).
- Skeie, J. M., et al. A biorepository for ophthalmic surgical specimens. Proteomics Clin Appl. 8 (3-4), 209-217 (2014).
- Ferrer, I., et al. Brain protein preservation largely depends on the postmortem storage temperature: implications for study of proteins in human neurologic diseases and management of brain banks: a BrainNet Europe Study. J Neuropathol Exp Neurol. 66 (1), 35-46 (2007).
- Ahmed, M. M., Gardiner, K. J. Preserving protein profiles in tissue samples: differing outcomes with and without heat stabilization. J Neurosci Methods. 196 (1), 99-106 (2011).
- Kanshin, E., Tyers, M., Thibault, P. Sample Collection Method Bias Effects in Quantitative Phosphoproteomics. J Proteome Res. 14 (7), 2998-3004 (2015).
- Crecelius, A., et al. Assessing quantitative post-mortem changes in the gray matter of the human frontal cortex proteome by 2-D DIGE. Proteomics. 8 (6), 1276-1291 (2008).
- Oka, T., Tagawa, K., Ito, H., Okazawa, H. Dynamic changes of the phosphoproteome in postmortem mouse brains. PLoS One. 6 (6), e21405 (2011).
- Nagy, C., et al. Effects of postmortem interval on biomolecule integrity in the brain. J Neuropathol Exp Neurol. 74 (5), 459-469 (2015).
- Mukherjee, S., et al. Proteomic analysis of frozen tissue samples using laser capture microdissection. Methods Mol Biol. 1002, 71-83 (2013).
