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Imunologia e Infecção

Induzione di paralisi e di lesioni del sistema visivo in topi da specifiche cellule T per neuromielite ottica Autoantigen acquaporina-4

Published: August 21, 2017
doi:
10.3791/56185
, , , , , , ,
1Department of Neurology,University of California, 2Program in Immunology,University of California, 3Department of Neurology and Neurological Sciences,Stanford University, 4Department of Pathology,Stanford University

Summary

Qui, presentiamo un protocollo per indurre l’infiammazione di paralisi e opticospinal di trasferimento di acquaporina-4 (AQP4)-specifiche cellule T da AQP4 topi– / – in topi WT. Inoltre, dimostriamo come utilizzare tomografia a coerenza ottica seriale per monitorare la disfunzione del sistema visivo.

Abstract

Mentre è riconosciuto che l’Acquaporina-4 (AQP4)-specifiche cellule T e anticorpi partecipano nella patogenesi della neuromielite ottica (NMO), una malattia demielinizzante autoimmune umano sistema nervoso centrale (CNS), la creazione di un modello di AQP4-mirati con entrambi le manifestazioni cliniche ed istologiche dell’autoimmunità CNS ha dimostrato impegnativo. Immunizzazione dei topi di wild-type (WT) con peptidi AQP4 ha suscitato la proliferazione delle cellule T, anche se quelle cellule T non potrebbero trasferire la malattia ai topi destinatario ingenuo. Recentemente, due novelli epitopi a cellula T di AQP4, peptide (p) 135-153 e p201-220, sono state identificate quando studiando le risposte immunitarie di AQP4 in topi AQP4-carenti (AQP4– / –), suggerendo la reattività delle cellule T a questi epitopi è normalmente controllato da timica selezione negativa. AQP4– / – Th17 polarizzata cellule T innescate a p135-153 o p201-220 paralisi indotta nei topi WT destinatari, che è stata associata con principalmente leptomeningeal infiammazione del midollo spinale e nervi ottici. L’infiammazione circostante i nervi ottici ed il coinvolgimento degli strati retinici interni (IRL) sono stati manifestati dai cambiamenti nella tomografia a coerenza ottica seriale (OCT). Qui, vi illustriamo gli approcci utilizzati per creare questo nuovo modello in vivo di autoimmunità targeting AQP4 CNS (ATCA), che ora può essere impiegato per lo studio dei meccanismi che consentono lo sviluppo di patogeni specifici AQP4 T cellule e come essi possono cooperare con B cellule nella patogenesi NMO.

Introduction

Neuromielite ottica (NMO) è una malattia demielinizzante infiammatoria autoimmune di sistema nervoso centrale (SNC) che provoca episodi ricorrenti di paralisi e perdita visiva che porta a disabilità neurologica permanente1. NMO è attualmente considerato principalmente una malattia autoimmune umorale2 come è associato con gli anticorpi (Igs) destinazione acquaporina-4 (AQP4), un canale di acqua espresso abbondantemente su astrociti3,4. Tuttavia, l’infiammazione CNS è un prerequisito per l’ingresso di CNS di AQP4 Ig5,6. Così, non è stato possibile stabilire un modello di NMO dal trasferimento di anti-AQP4 Igs da solo. I risultati che (1) patogeni specifici AQP4 Igs in pazienti NMO sono IgG11,2, un Ig di cellula T-dipendente sottoclasse7 (2) cellule di T sono identificate in NMO lesioni8,9 (3) NMO è associato con determinati geni MHC II (ad esempio HLA-DR17 (DRB1 * 0301))10e (4) proinflammatory AQP4-reattiva DR-limitato Th17 cellule vengono espansi in NMO pazienti11,12 tutti indicano che le cellule T AQP4-specifiche hanno un ruolo chiave nella patogenesi NMO. Pertanto, è importante sviluppare modelli animali per determinare come le cellule T AQP4-specifici possono contribuire alla patogenesi NMO.

Diversi anni fa, più epitopi a cellula T di AQP4 sono stati identificati in wild type (WT) topi13,14 e ratti15. Mentre è stato osservato che le cellule T AQP4-reattiva potrebbero indurre l’infiammazione opticospinal ingenuo destinatario ratti15,16, significativi segni clinici della malattia dello SNC non sono stati osservati. Allo stesso modo, diretto l’immunizzazione di topi WT con peptidi contenenti AQP4 T cell epitopi14,17, o trasferimento di proinflammatory T cellule targeting quelli determinanti17, non ha causato segni clinici o istologico prova di autoimmunità CNS.

Recentemente, esso è stato osservato che l’immunizzazione dei topi C57BL/6 AQP4-carenti (AQP4– / –) con AQP4 peptide (p) 135-153 o p201-220, due determinanti preveduti per associare MHC II (-A,b) con alta affinità18, ha suscitato forte CD4 + Di risposte delle cellule T17. Al contrario, questi due peptidi ha suscitato solo modeste risposte proliferative nei topi WT. Ulteriormente, il repertorio di cellula T del ricevitore (TCR) utilizzato per il riconoscimento di questi fattori determinanti dalle cellule di T da topi– / – AQP4 era unico. Collettivamente, questi risultati indicano che il riconoscimento delle cellule di T dell’AQP4 è regolato da selezione negativa timica. AQP4 p135-153-p201-220-specifici o cellule Th17 da topi di donatore– / – AQP4 indotta paralisi in quasi il 100% dei topi WT destinatari ingenui; Ciò è stata associata con opticospinal si infiltra in delle cellule T, cellule B e monociti. Opticospinal seriale tomografia di coerenza (ottobre) ha dimostrato la partecipazione dinamica sistema visivo. Topi con l’autoimmunità mediata da cellule T targeting AQP4 CNS (ATCA) recupero da paralisi e lesioni del sistema visivo. A differenza di EAE indotto da myelin oligodendrocyte glycoprotein (MOG) p35-55-specifico cellule di T, che ha portato alla malattia clinica persistente, ATCA indotta dalle cellule di T da solo non è stato associato con perdita axonal o riduzione in cellule retiniche del ganglio (RGCs). I nostri risultati hanno dimostrato chiaramente che esistono molteplici determinanti di cellula T AQP4 patogeni. Questo nuovo modello di ATCA è utile per studiare i meccanismi che controllano lo sviluppo delle cellule di T AQP4-specifici patogeni, imparando come quelle cellule inducono l’infiammazione CNS e come essi può cooperare con AQP4 specifiche B cellule e anticorpi per promuovere la patogenesi NMO .

Nel rapporto presente, descriviamo i protocolli utilizzati per indurre e valutare ATCA indotta da cellula di T. Cominciamo con le tecniche usate per immunizzazione, la coltura delle cellule T e la polarizzazione Th17 di generare le cellule T AQP4-specifici patogene, analisi di citometria a flusso per confermare il trasferimento adottivo di quelle cellule di T e di polarizzazione. Descriviamo quindi i metodi utilizzati per valutare la malattia clinica ed istologica e l’uso di OCT seriale per monitorare le lesioni del sistema visivo nei topi di destinatario.

Protocol

animale tutte le procedure sono state effettuate nel rispetto delle indicazioni sperimentali approvati dalla University of California, San Francisco istituzionale Animal Care e uso Comitato. I topi femminili C57BL/6 (H-2 b), 8 settimane di età, sono stati acquistati e topi di C57BL/6 AQP4 – / – sono stati forniti da r. Verkman. 1. immunizzazione di topi con AQP4 peptidi preparare Freund completo ' stock di lavoro adiuvante (CFA) s. Macinare finemente una preparazione essiccata di M. tuberculosis (H37Ra) utilizzando un mortaio e un pestello. Aggiungi terra H37Ra a Freund incompleto ' adiuvante s a una concentrazione finale di 4 mg/mL. CFA possa essere conservato a 4 ° C per fino a 6 mesi. Sciogliere liofilizzato del peptide AQP4 antigene (Ag) in tampone fosfato salino (PBS) ad una concentrazione finale di 1 mg/mL. Conservare a 4 ° C o su ghiaccio Preparare il montaggio di 2 siringhe luer-lock, si unì con un rubinetto, che contiene l’emulsione CFA/peptide. Allega una siringa luer lock di vetro senza lo stantuffo per un rubinetto a 3 vie in nylon con 2 connessioni luer-lock maschio. Chiudere il rubinetto d’arresto commutando la leva verso la siringa. Posizionare l’estremità aperta della siringa fino, permettendo la siringa di agire come una provetta. Questo posto in una cremagliera del tubo per una maggiore stabilità. Vortex il CFA lavoro stock e la soluzione di Ag. Aggiungere un volume di 1:1 del peptide / CFA alla siringa aperta. 200 µ l di CFA/Ag (4 x 50 µ l) è richiesto per topo. Nota: In genere, circa 1 mL di preparazione è perse il rubinetto, che ridurrà l’importo disponibile per l’immunizzazione. Pertanto, è importante integrare questo nel calcolo del volume totale richiesto. Esempio: per l’immunizzazione di 5 topi: (200 animali µ l/animale x 5) + 1 mL volume extra = 2 mL richiesto totale CFA/Ag. Inserire il pistone di vetro nella siringa e, tenendola in posizione, capovolgere la siringa in modo che il rubinetto è orientato verso l’alto. Passare la leva del rubinetto alla connessione femmina inutilizzata. Applicare attentamente pressione il pistone di vetro al fine di rimuovere l’eccesso di aria dalla siringa. Il liquido riempie la seconda connessione luer-lock maschio il rubinetto d’. Allegare una seconda siringa di vetro (stantuffo completamente inserita) alla seconda connessione luer-lock maschio del rubinetto. Questo dovrebbe essere un sistema chiuso di 2 siringhe di vetro collegato con un rubinetto che contiene meno aria in eccesso possibile. Per creare un’emulsione, mescolare spingendo i tuffatori per passare il liquido alternativamente tra le 2 siringhe per circa 2 min Chill ripetere le siringhe sul ghiaccio per circa 10 min. l’agghiacciante e mescolando fino a quando c’è un netto cambiamento della viscosità della preparazione , risultante in un’emulsione molto rigida, bianca. Refrigerare le siringhe contenenti l’emulsione a 4 ° C o mantenere il ghiaccio Trasferire tutti l’emulsione al una vetro siringa luer lock, rimuovere la siringa di vetro vuota e sostituirlo con una siringa luer lock da 1 mL per iniezione. Riempire la siringa nuova con emulsione, rimuoverlo dal rubinetto e fissare un ago (25 x 5/8). " acqua-prova " l’emulsione per coerenza. Espellere un calo dell’emulsione in un piccolo piatto di acqua. L’emulsione non deve disperdere, che indica che è adatto per l’iniezione. Se l’emulsione si disperde, non è pronto per essere iniettato; trasferimento liquido nuovamente dentro il vetro siringhe e continuare a mescolare e poi raffreddare nuovamente fino a quando l’emulsione è rigida. Verificare l’emulsione nuovamente fino a quando è stato raggiunto la consistenza corretta. Iniettare topi – / – donatore AQP4 per via sottocutanea (s.c.) con emulsione contenente il peptide AQP4. Ogni mouse riceve iniezioni di 4 x 50 µ l s.c. (200 µ l totale (peptide di 100 µ g)). I 4 siti includono entrambi i lati dell’addome più basso, che vuotano nei linfonodi inguinali (LN), ed entrambi i lati della parete di cassa mediale per ogni ascella, che vuotano nel LN. ascellare Il trasferimento adottivo richiederà topi immunizzati donatore 1-2 per destinatario topo. 2. Polarizzazione di cella di coltura delle cellule T e Proinflammatory T 10-12 giorni dopo l’immunizzazione, raccogliere LN dai topi. In un vassoio di ghiaccio, preparare mm 60 capsule di Petri con un colino di cella (maglia dimensioni 70 µm) e contenenti refrigerati RPMI media con 10% inattivati siero bovino fetale (FBS) e 100 U/mL penicillina-100 µ g/mL di streptomicina (penna-strep) (RFP). Euthanize topi da esposizione a CO 2, seguita da dislocazione cervicale. Immergere i topi in etanolo al 70% e poi pin ogni zampa di un tavolo di dissezione. Tagliare un’incisione della pelle della linea mediana dall’inguine al collo e giù per ogni gamba. Tirare la pelle dal peritoneo e pin teso alla scheda. Sezionare LN inguinali e ascellari e inserire la capsula di Petri contenente RFPS, sul ghiaccio. 19 per gli esperimenti di trasferimento adottivo, combinare LN da tutti gli animali appartenenti allo stesso gruppo di immunizzazione. Per analisi cytometric di flusso di utilizzo Vβ, separare LN da singoli animali. Posizionare l’utensile di cella contenente il LN in una provetta da centrifuga da 50 mL contenente RFP. Utilizzare l’estremità piatta di un pistone della siringa sterile 5 mL per premere le cellule LN attraverso il colino, lavaggio con 20-30 mL di RFP per facilitare il recupero delle cellule. Mantenere le cellule LN sul ghiaccio durante tutta l’elaborazione fino al momento per la cultura. Lavare due volte, centrifugazione a 393 x g per 5 min. Dopo il secondo lavaggio, risospendere le cellule LN T cell media (TCM). TCM contiene RPMI con 10% calore-inattivati FBS, 292 µ g/mL L-Glutammina, piruvato di sodio µ g/mL, 110 e 55 µM 2-mercaptoetanolo e penna-streptococco. In genere, viene utilizzato un volume di 5 mL TCM per topo donatore. Contare le celle di LN. Rendimento atteso è di circa 3-6 x 10 7 LN cellule per donatore del mouse immunizzato. Mettere da parte 3-4 x 10 6 per un’analisi di proliferazione (Vedi sezione 3 riportata di seguito). Impostare polarizzazione culture per trasferimento adottivo (sezione 6). Ricombinante ng/mL 10 mouse IL-6 in MTC e preparare una cultura di polarizzazione Th17 di 5 x 10 6 LN cellule per mL con 10 µ g/mL Ag, 20 ng/mL del mouse ricombinante interleuchina (IL) -23. Ricombinante ng/mL 10 mouse IL-12 in MTC e in alternativa, per la polarizzazione Th1, preparare una cultura di 5 x 10 6 LN cellule per mL con 10 µ g/mL Ag. Aggiungere 2 mL (1 x 10 7 cellule) per pozzetto della miscela cultura polarizzante in una piastra 12-pozzetti. Le cellule di LN dai topi di 2-4 donatore riempirà una piastra 12-pozzetti. Mantenere le culture in un incubatore a 37 ° C con 5% CO 2 per 72 h. Controllare visivamente le cellule LN nella cultura per l’attivazione a 48 h e h. 72 attivato cellule formeranno cluster esteso e le cellule di T aumenterà di dimensioni, diventando più pleomorphic. L’aumento del metabolismo causerà un abbassamento del pH nei media, cambiando da pesca arancione. Se il pH è sufficientemente basso da ingialliscono i media, aggiungere 1 mL di fresco TCM per impedire la tossicità per le cellule in restanti 24 h Procedere alla sezione 6 per trasferimento adottivo. Un’efficienza di polarizzazione può essere verificata dall’intracellulare cytokine colorazione (ICS), come descrIBED nella sezione 5. Istituito culture utilizzando LN dai topi individuali per analisi citofluorimetrica dell’espressione di superficie Vβ (sezione 4). Preparare 5 x 10 6 cellule LN per mL con 10 µ g/mL Ag in TCM. Aggiungere 2 mL (1 x 10 7 cellule) della cultura per pozzetto in una piastra 12-pozzetti. Colture dovrebbero essere mantenute in un incubatore a 37 ° C con 5% CO 2 per 10 giorni. Procedere alla sezione 4. 3. Analisi di proliferazione Nota: questo continua dalla sezione 2.4. Preparare 3-4 mL di LN cellule in un tubo, a 2 x 10 6 cellule per mL in TCM. Mescolare delicatamente le cellule capovolgendo la provetta diverse volte e poi il trasferimento a un trogolo sterile. Piastra di coltura del tessuto inferiore uso un pipettatore multicanale per piastra 100 µ l di cellule per pozzetto in un tondo di 96 pozzetti. In genere, piastra 15 pozzi per il triplice copia test di 4 concentrazioni di Ag e nessun riferimento Ag. Diluire l’Ag in TCM a varie concentrazioni, in genere 80, 20, 5, 1 e 0 µ g/mL (per le scorte di x 2). Aggiungere 100 µ l di ciascuna concentrazione in triplice copia per una concentrazione finale di 40/10, 2.5. 0,5 e 0 µ g/mL. Incubare per circa 72 ore a 37 ° C. Nota: passaggi 3.5 a 3.7 comportano materiali radioattivi. L’utilizzo corretto, monitoraggio e smaltimento di materiali radioattivi deve essere effettuati, secondo normative istituzionali e governative. Preparare una soluzione stock di 3 H-timidina (40 µ ci/mL) di aggiunta 1 mCi 3 H-timidina a 25 mL RPMI e questo conservare a 4 ° C. Dispensare 0,5 mL di soluzione di lavoro in un trogolo sterile. Aggiungere 25 µ l di 3 H-timidina (1 µ ci) al bene utilizzando una pipetta multicanale. Incubare per ulteriori 18 ore a 37 ° C. Raccogliere le cellule su una stuoia di vetro filtro mediante un harvester cella 96 pozzetti e sciacquare con etanolo al 70%. Dopo l’essiccazione, sigillare la rete del filtro in un sacchetto di plastica del campione con 5 mL di liquido di scintillazione. Radioattività di misura in ogni pozzetto usando un contatore a scintillazione. 4. Flusso Cytometry analisi per l’espressione delle cellule superficie TCR Vβ Nota: questo continua dalla sezione 2.6. Anticorpi per mouse TCR Vβ 2, 3, 4, 5.1 e 5.2, 6, 7, 8.1 e 8.2, 8.3, 9, 10b, 11, 12, 13, 14 e 17 bis sono disponibili in commercio per il test dell’espressione TCR Vβ. Per il rilevamento di TCR Vβ, sloggiare le cellule di T dalla piastra di coltura pipettando parecchie volte e trasferire le cellule in una provetta. Lavare con tampone di FACS (FB) contenente 2% FBS, 0,1% sodio azide e 2 mM EDTA in PBS. Cellule di trasferimento ad una piastra di fondo V 96 pozzetti ad una densità di 1 x 10 5 a 3 x 10 6 cellule per pozzetto. Se l’intero pannello Vβ è in fase di test, le cellule devono essere distribuite in pozzi multipli (un pozzetto per Vβ in fase di test). Escludere le cellule morte da analisi cytometric di flusso mediante colorazione con un colorante di attuabilità LIVE/DEAD, che reagisce con le ammine gratis esposti dalle cellule necrotiche. Seguire il produttore ' s istruzioni per centrifugazione e risospensione in tintura di attuabilità. Incubare in ghiaccio per 10-20 min in tutto le procedure di colorazione cellulare, proteggono le cellule dalla luce e tenere il ghiaccio Dopo l’incubazione, lavare la piastra una volta in FB. Per rilevare TCR Vβ, sospendere le cellule in 100 µ l di FB che contiene una diluizione di 1: 100 di anticorpi per CD4 (clonare RM4-5) e TCR Vβ. Incubare per 15-60 min su Ice. Lavare la piastra una volta in FB e fissare le cellule con l’aggiunta di 200 µ l di paraformaldeide al 4%, diluito in PBS. Incubare per 20 minuti sul ghiaccio. Lavare la piastra in FB e analizzare tramite flusso cytometry. 5. Analisi citofluorimetrica per la produzione di citochine intracellulari per intracellulari di cytokine colorazione (ICS), trattare culture a cellula T con una diluizione di 1:1,000 di reagente di proteina trasporto inibitore (ad esempio, GolgiPlug) in MTC, 4 h prima del ICS per prevenire secrezione di citochine. A quel tempo, attivare le cellule T con 50 ng/mL phorbol 12-myristate 13-acetato (PMA) e ionomicina 500 ng/mL al fine di indurre la produzione di proteina. Dopo 4 h di coltura a 37 ° C, sloggiare le cellule dalla piastra di coltura pipettando su e giù e trasferire in una provetta da centrifuga (15 o 50 mL). Wash con FB. Risospendere le cellule in FB e trasferimento in un piatto fondo V 96 pozzetti ad una densità di 5 x 10 5 a 3 x 10 6 cellule per pozzetto. Cellule di macchia con tintura di vitalità come descritto in precedenza (vedere paragrafo 4.2). Dopo l’incubazione, lavare la piastra una volta in FB. Aggiungere gli anticorpi per il rilevamento degli indicatori di superficie come segue: per la rilevazione degli indicatori di superficie, sospendere le cellule in 100 µ l di FB che contiene una diluizione di 1: 100 dell’anticorpo per CD4 (clonare RM4-5). Includere facoltativamente, anticorpi per B220 (clonare 30-F11) e CD11b (clonare M1/70) a una diluizione di 1: 100 per migliorare gating delle cellule di B e monociti/macrofagi, rispettivamente. In generale, PE-Cy7 anti-CD4, FITC anti-B220 e PerCP-Cy 5.5 anti-CD11b funzionano bene. Scelta dei coniugati di anticorpo/fluorocromo edipende dalla configurazione del citometro a flusso da utilizzare per l’analisi, e concentrazioni ottimali di anticorpi devono essere determinate empiricamente. Incubare per 15-60 min su ghiaccio. Lavare la piastra con FB e risospendere le cellule in 200 µ l di soluzione di fissazione/Permeabilization per 20 min sul ghiaccio. Consente di fissare le cellule e permeabilize le membrane. Al fine di mantenere la permeabilizzazione delle membrane cellulari durante la colorazione intracellulare, utilizzare Perm/Wash buffer (PW) (diluito 01:10 da stock X 10) invece di FB. Lavare i pozzetti in 200 µ l di PW. Per ICS, preparare una diluizione 1: 100 degli anticorpi per l’interferone (IFN)-γ e IL-17A utilizzando 1 x PW. Un’opzione è APC anti-IFN-γ (clone XMG1.2) e PE anti-IL-17A (clone eBio17B7) che funziona bene. Risospendere le cellule in 100 µ l di anticorpo intracellulare cocktail e poi incubare per almeno 15 min. È anche possibile continuare la macchiatura durante la notte a 4 ° C. Lavare i pozzetti in 200 µ l di PW e risospensione in FB per citometria a flusso. In parallelo, preparare un campione senza macchia (celle in FB senza anticorpi) per ottimizzare il rivelatore tensioni e single-macchiato campioni per ogni fluorocromo individuo (cioè, cellule o compensazione perline colorate con un solo anticorpo/fluorocromo) per determinare i valori di compensazione spillover. Utilizzando un citometro a flusso, di acquisire ≥ 10.000 cellule (eventi), gating su vitali (LIVE/DEAD-negativo) CD4 + cellule. Per garantire gating accurata delle cellule T, escludere il B220 + e CD11b + le cellule (cellule di B e monociti/macrofagi, rispettivamente). All’interno il CD4 + T cellulare sottopopolazione, determinare la percentuale di cellule che esprimono IFN-γ (Th1 lignaggio) o IL-17A (Th17 lignaggio). 6. Cellule di trasferimento di patogeni specifici AQP4 T adottive Nota: questo passaggio segue dalla sezione 2.5: cellula T cultura e proinflammatory polarizzazione delle cellule T. Cellule di recupero polarizzato da 12-pozzetti di piastre di pipettaggio su e giù per sloggiare e trasferirli in una provetta da 50 mL. Mamantenere il ghiaccio fino a iniezioni. Contare le celle, lavare due volte in PBS freddo e preparare una sospensione di 1 x 10 8 cellule/mL in PBS. In genere, iniettare le cellule entro un’ora. Delicatamente mescolare le cellule agitando e trasferire in una siringa da 1 mL al momento dell’iniezione. Amministrare 200 µ l di cellule (2 x 10 7) per via endovenosa (i.v.) per ogni mouse, attraverso la coda della vena. Iniettare ogni destinatario mouse i.p. con 200 ng di tossina di b. pertussis diluito in 200 µ l di PBS quel giorno e 2 giorni più tardi. Monitorare i topi al giorno per i segni della malattia clinica. 7. Valutazione clinica dell’ATCA Examine topi destinatari ogni giorno per segni clinici dell’autoimmunità CNS. In generale, topi mostrerà segni di autoimmunità CNS 5-8 giorni dopo il trasferimento adottivo di cellule T specifiche AQP4. I topi verranno mostrerà i sintomi clinici di disfunzione neurologica. È utile eseguire le valutazioni ingenuo del mouse per definire la capacità normale di un mouse. Tono Evaluate topi per la perdita della coda. Impugnare i mouse delicatamente alla base della coda e sollevare in posizione eretta. Una coda che caduta continuamente viene descritto come perdita della coda tono (Punteggio 1). Perdita di tono della coda è spesso il primo segno della malattia clinica. Test per raddrizzamento riflesso posizionando il mouse sul dorso su una superficie piana. Raddrizzamento lento è un segno di mancanza di coordinazione del tronco (Punteggio 2). Un mouse ingenui resisterà completamente qualsiasi tentativo di posizionarlo sul dorso, così qualsiasi lentezza nella capacità di destra è segnato come una disfunzione. È tipico per testare il mouse 3 – 4 volte per questo riflesso. Evaluate postura e la deambulazione. Topi iniziano a mostrare un cambiamento nella postura conseguente abbassamento o trascinamento dei fianchi durante la deambulazione (Punteggio di 2,5). Ulteriori risultati di malattia in monoplegia, paralisi completa di un hind arto (Punteggio di 3.0) e paraplegia, paralisi completa di entrambi hind flettenti (Punteggio di 3.5). Quadraparesis moderato, debolezza di tutte le quattro estremità, si traduce in molto lento movimento in avanti (Punteggio 4). Quadraparesis grave non permette quasi nessun movimento in avanti (il Punteggio di 4,5). Infine, con la malattia severa possono diventare moribondi o morire (Punteggio 5). Propinare ai topi che perdono la capacità di acquisire cibo solido o fluido 1 mL di glucosio 5% in soluzione salina i.p. in alternativa, utilizzare il completamento con fluido gel tazze, alta calorico softies gel e pancetta per contrastare la disidratazione e la privazione di cibo. Eutanasia topi moribondi. 8. Preparazione dei tessuti e l’istologia anestetizzare topi con 100 mg/kg ketamina e 10 mg/kg xylazina, e poi pin ogni zampa di un tavolo di dissezione. Aperto il torace, esponendo il cuore. Incise il fegato per consentire il deflusso del sangue. Allegare un ago a farfalla per il tubo di una pompa a velocità variabile miniflow utilizzando un serbatoio separato per PBS e 10% formalina. Inserire l’ago nel ventricolo sinistro del cuore e irrorare con 5 mL di PBS, seguita da 25 mL di formalina al 10%. Rimuovere la testa e poi gli occhi. Processi occhi e retine come descritto in precedenza 20. Tagliare attraverso le orbite, inserire le forbici al naso e tagliare il cranio anteriore posteriore su ciascun lato. Rimuovere il cranio, esporre i nervi ottici, tagliare il chiasma ottico e posto in una cassetta tra 2 imbottiture. Immergere in formalina al 10% (24 h) e quindi 50% di etanolo (24 h) e poi trasferimento in etanolo al 70%. Rimuovere cervello e della colonna vertebrale e posto in formalina al 10%. Sezione in serie cervelli nell’aereo della corona; cavi di sezione spinale in sagittale (circa la metà) e seriale coronale aerei (circa 20 sezioni trasversali per topo). Campioni di processo CNS ordinariamente per inclusione in paraffina. Macchia 8 µm spessore sezioni con ematossilina ed eosina (nervi ottici) o Luxol fast blu-ematossilina ed eosina (cervello e midollo spinale). Valutare i nervi ottici per la presenza di infiammazione all’interno del nervo e la circostante meningi (neurite ottica) o prevalentemente nei meninges circostanti (perineuritis ottico). Contare meningee e parenchimatiche focolai infiammatori (> 10 cluster cellule mononucleari) nei campioni del cervello e del midollo spinale per ogni mouse. 9. In Vivo Retinica Imaging di Optical Coherence Tomography (OCT) Nota: imaging retinico di Spectral domain OCT di topi viene eseguita utilizzando attrezzature commerciali (ad es., Spectralis con tracker occhio TruTrack) per raggiungere coerente oculare orientamento e ridurre artefatti da movimento. Cinque minuti prima di formazione immagine, dilatare le pupille con tropicamide 1% (una goccia per occhio) e posizionare il mouse per essere imaged nella camera di induzione di anestesia, fornendo un flusso costante di 2 litri / min (1,5% isoflurano). Girare il calore mat e preparare la gabbia di recupero post-anestesia. Posizionare il mouse sul cilindro imaging e reindirizzare il flusso di anestesia di conseguenza. Proteggere gli occhi con 0,3% di idrossipropilmetilcellulosa per mantenere l’occhio umido e per garantire la continuità di rifrazione. Posizionare un personalizzato lente a contatto sull’occhio da esaminare. Guidate dall’immagine del fondo infra-rosso, diretto il laser all’occhio, assicurando il fascio è centrato sulla testa del nervo ottico. Verticale e orizzontale scansioni OCT dovrebbero confermare che la retina depone perpendicolare al laser. Eseguire 25 B-Scan in modalità ad alta risoluzione e Rasterizza da 30 A-Scan in media. Dopo formazione immagine entrambi gli occhi, rimuovere le lenti a contatto e applicare il gel oftalmico. Lascia il mouse nella gabbia calda recupero. 10. Elaborazione ed analisi di ottobre utilizzare il software per la segmentazione automatica di imaging di modulare. Segmenti manualmente corrette corrispondente alla parte interna limitazione della membrana (ILM) e strato plessiforme interno (IPL), che rappresenta i limiti del retinico interno strati (IRL) 21. Verificare che lo strato di fibre nervose retiniche (RNFL) e lo strato delle cellule del ganglio (GCL) risiedono entro i limiti della IRL e non si sovrappongono. Spessori IRL calcolare utilizzando la griglia di 2 studio di retinopatia diabetica (ETDRS) di inizio trattamento con diametri di 1, 2 e 3 mm centrato sul disco ottico e l’esportazione in un file di foglio di calcolo. Il software calcola lo spessore di ogni strato retinico da una media di ciascun settore di griglia. Pertanto, è escluso il segmento centrale, corrispondente alla testa del nervo ottico,. Analizzare le differenze statistiche fra gruppi in ogni momento. Analizzare entrambi gli occhi per ogni mouse, utilizzo generalizzato stima equazioni con una matrice di correlazione cambiabile e regolazioni per intra-soggetto Inter-occhio correlazioni 21.

Representative Results

In questo protocollo, abbiamo usato le cellule di T del donatore da topi di C57BL/6 AQP4- / . L’immunizzazione sottocutanea di questi topi con AQP4 p135-153 o p201-220, che contengono epitopi a cellula T patogeni, ha suscitato forte proliferative delle cellule T risposte nei linfonodi drenanti (Figura 1), mentre questi due peptidi indotto molto più debole delle cellule T proliferazione nei topi WT. In confronto, l’immunizzazione con AQP4 p91-110, contenente un non-patogeni AQP4 T cellulare determinante13, o MOG p35-55, un peptide di mielina che attiva le cellule di T che causano l’encefalomielite autoimmune sperimentale (EAE)22,23 ,24, indotto grandezza simile di proliferazione delle cellule T in AQP4- / – e topi WT. Analisi dell’utilizzo di TCR macchiando di citometria a flusso per di Vβ individuali o famiglie Vβ, ha dimostrato che cellule p135-153-p201-220-specifici e T da topi- / – AQP4 utilizzato unico repertorio TCR. Iper-proliferazione selettiva dell’AQP4 p135-153 e p201-220 in topi- / – AQP4, nonché l’unico utilizzo di TCR (Figura 2), indicato che la cellula T patogeni risposte a questi fattori determinanti è normalmente regolato da negativo timica selezione, sottolineando l’importanza per usando le cellule di T del donatore- / – di AQP4 nel presente protocollo. Prima del trasferimento adottivo per l’induzione dell’ATCA, cellule di linfonodo da AQP4 peptide-innescato topi sono state coltivate in vitro in condizioni di Th17 o di polarizzazione Th1 per tre giorni. La misura della polarizzazione del donatore CD4+ T cellule è stata confermata dalla macchiatura (ICS) intracellulari di cytokine e misurata da citometria a flusso (Figura 3). Ingenuo destinatari topi sono stati iniettati per via endovenosa con cellule di T di 2 x 107 donatore AQP4 peptide specifico. Dopo circa sei giorni, quasi 100% dei topi destinatari sviluppato i segni clinici della malattia autoimmune dello SNC, compreso la paralisi zoppicare di coda e dell’arto posteriore (Figura 4). Polarizzato Th17 AQP4 specifiche T cellule indotte più grave malattia clinica che le cellule Th1 polarizzato T AQP4-specifici. Un topo rappresentativo che ricevuto Th17 AQP4-peptide-specifico e ha sviluppato la paralisi completa dell’arto (paraplegia) è mostrato nel Video 1. In contrasto con i topi che hanno sviluppato EAE dopo somministrazione di cellule Th17 MOG-specific, topi destinatari recupero da malattia clinica indotta dalle cellule Th17 AQP4 specifici. Per quanto riguarda EAE indotto da cellule Th17 p35-55-specifiche MOG, malattia clinica indotta da AQP4 p135-153-specifico o cellule Th17 p201-220-specific è stata associata con infiltrazione delle cellule mononucleari nel parenchima CNS e meningi (Figura 5). Le lesioni erano più abbondanti nelle meningi che nel parenchima dell’autoimmunità CNS indotta dalle cellule Th17 AQP4 specifici. MOG-specific Th17 cellule sia infiammazione indotta del nervo ottico, che è stato caratterizzato dalla presenza di cellule mononucleari e coinvolgimento del nervo ottico è stato dimostrato dalla valutazione istologica e da seriali OCT. AQP4-specifici. Considerando le cellule Th17 AQP4 specifico causato perineuritis ottico, cellule Th17 MOG-specific ha indotto la neurite ottica severa (Figura 5). Utilizzando seriale OCT, l’infiammazione del nervo ottico era evidente dal gonfiore e aumento dello spessore di strato retinico interno (IRL) per malattia clinica indotta da AQP4-specifiche o cellule Th17 MOG-specific (Figura 6). Per l’autoimmunità indotta da AQP4 Th17 CNS, spessore IRL ritornato ai valori basali come topi recuperato da malattia clinica. Al contrario, la persistenza di EAE indotto da MOG-specific Th17 corrispondeva con IRL assottigliamento e, come abbiamo dimostrato in precedenza17, è stata associata con perdita delle cellule ganglionari retiniche. Figura 1 : AQP4 p135-153 e p201-220 suscitare la proliferazione delle cellule di T robusta in AQP4- / – topi, ma non i topi WT. Topi sono stati immunizzati s.c. con i peptidi indicati in CFA. Undici giorni più tardi, linfonodi sono stati rimossi e poi coltivate con entrambi nessun antigene, o con il peptide utilizzato per l’immunizzazione. La proliferazione è stata misurata dall’incorporazione di 3H-timidina (media ± SEM, rappresentante di 5 esperimenti). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Figura 2 : Le cellule di T AQP4-specifici da topi- / – AQP4 utilizzano repertori TCR unici. AQP4- / – e topi WT sono stati immunizzati con i peptidi indicati. Undici giorni più tardi, i linfonodi sono stati rimossi e coltivati con peptide utilizzato per l’immunizzazione. Le cellule sono state raccolte. L’utilizzo di TCR Vβ è stata analizzata mediante citometria a flusso (media ± SEM, n = 5). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Figura 3 : Proinflammatory polarizzazione delle cellule erogarici AQP4 specifiche T. Undici giorni dopo immunizzazione con AQP4 p135-153 o p201-220, cellule di linfonodo sono state raccolte e coltivate con il peptide utilizzato per l’immunizzazione in condizioni di non-polarizzazione Th1 o di polarizzazione Th17 condizioni. Polarizzazione Th17 o Th1 è stato esaminato da ICS e flusso cytometry per IL-17 o IFN-γ, rispettivamente. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Figura 4 : Cellule Th17-polarizzata AQP4 specifiche T inducono paralisi nei destinatari topi WT. WT destinatari topi hanno ricevuto 2 x 107 donatore polarizzato Th17 AQP4 p135-153 o cellule T p201-220-specifiche da topi- / – AQP4. Cellule di T di MOG-specific polarizzato Th17 servito come controllo positivo. Risultati sono rappresentativi di 8 esperimenti (n = 5/gruppo). * p < 0.05, * * p < 0,01, * * * p < 0.001. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Figura 5 : Cellule Th17 AQP4 specifico inducono l’infiammazione opticospinal nei topi WT. Destinatari topi hanno ricevuto 2 x 107 cellule Th17 in donatore Th17 AQP4 p135-153 – o p201-220-innescato da AQP4 topi- / – o le cellule Th17 MOG p35-55-specifiche e sono stati sacrificati 10 giorni più tardi. Tessuti del midollo spinale e del nervo ottico sono stati preparati e macchiati con H & E/LFB per valutare la prova di infiammazione e demielinizzazione, rispettivamente. Risultati sono rappresentativi di 5 topi/gruppo. Barra della scala = 50 µm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Figura 6 : Infiammazione del nervo ottico indotta dalle cellule Th17 AQP4 specifici possa essere monitorato da ottobre retinica longitudinale WT destinatari topi hanno ricevuto 2 x 107 donatore polarizzato Th17 AQP4 p201-220-specifico o le cellule di T di MOG p35-55-specifico il giorno 0. Essi sono stati esaminati entro ottobre il giorno 0 (prima della somministrazione delle cellule T) e quindi nei giorni 4, 7, 8, 9 10, 11 14 e 21. Spessore IRL è stato misurato (media ± SEM). Le statistiche indicano un confronto con controllo ingenuo. Risultati sono rappresentativi di 3 esperimenti (5 topi/gruppo). * p < 0.05, * * p < 0,01, * * * p < 0.001. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Discussion

AQP4 è stato identificato come l’obiettivo primario in NMO IgG nel 20053. Quindi, è stato riconosciuto che sarebbe importante stabilire un modello animale di targeting AQP4 dell’autoimmunità CNS. Tale modello potrebbe essere utile per indagare come cellule di B e T specifici AQP4 partecipano nello sviluppo dell’autoimmunità CNS e testare therapeutics candidato per NMO. Anche se l’identificazione di specifiche AQP4 T cell epitopi nei topi wild-type in primo luogo è stato segnalato nel 201013, cellule T risponde a quegli epitopi non ha causato la malattia clinica o istologica14,17. L’incapacità di generare un modello di autoimmunità CNS basata su reattività immune a AQP4 è rimasto un enigma fino al 2015, quando Jones, et al. 25 scoperto che cellule T del donatore AQP4 p135-153-innescato da AQP4 topi– / – sono stati in grado di causare segni clinici e istologici di autoimmunità CNS nei topi WT. Di interesse, AQP4 p135-153 è preveduta per associare MHC II (-A,b) con alta affinità17. Solo un altra AQP4 sequenza dell’amminoacido, 201-220, è preveduta per associare-Ab con alta affinità simili. Infatti, abbiamo osservato che AQP4 p135-153 e p201-220 sia indurre proliferazione robusta in AQP4– / –, ma non WT, topi. Qui, abbiamo mostrato come si può isolare ed espandere encephalitogenic Th17 AQP4 p135-153 – e p201-220-T cellule reattive da topi– / – AQP4. Quando trasferito nel destinatari topi WT, le cellule erogarici Th17 AQP4-reattiva indotta paralisi, che era accompagnata da infiltrati di cellule mononucleari nel midollo spinale e del nervo ottico. Sistema visivo afferente la ferita è ben nota in pazienti con AQP4-sieropositivi NMOSD26. Qui, abbiamo osservato che l’infiammazione del nervo ottico indotta dalle cellule AQP4-reattiva e Th17 MOG-reattiva era distinto. Considerando che le cellule Th17 AQP4-specifiche indotte perineuritis ottico, cellule Th17 MOG-specific ha indotto la neurite ottica severa. Inoltre abbiamo descritto le tecniche utilizzate per monitorare l’infiammazione del nervo ottico indotta dalle cellule di T di MOG-specific e AQP4 specifici da seriale OCT. Altri ricercatori dovrebbero ora essere in grado di applicare i protocolli descritti qui per spostare in avanti i propri studi focalizzati su meccanismi patogenetici dell’ATCA.

Si possono facilmente evitare tre potenziali insidie nel nostro protocollo. Primo trasferimento adottivo di ATCA richiede uso AQP4-specifiche delle cellule di T da topi di donatore– / – AQP4. In particolare, le cellule erogarici WT AQP4 p135-153-specifico T non hanno causato ATCA nei topi WT destinatari. In secondo luogo, è importante eseguire un “test-acqua” con una goccia di emulsione peptide/CFA prima immunizzazione di AQP4 topi– / – (protocollo passo 1,5). L’emulsione non deve disperdere in acqua quando è adatto per l’iniezione s.c.. Se l’emulsione si disperde, uno dovrebbe mescolare l’emulsione ancora una volta, chill nuovamente e ripetere la prova dell’acqua. Infine, cellule T antigene-specifiche di donatore attivato CNS inducono l’autoimmunità CNS più efficientemente le cellule di T di riposo. Uno dovrebbe ispezionare visivamente quelle culture sotto il microscopio chiaro prima della raccolta le cellule di T del donatore per trasferimento adottivo. Cellule in rapida divisione possono formare ammassi, che sono facilmente identificabili. Inoltre, quando culture contengono molte cellule di T attivate, i media possono transizione dal rosa all’arancio o anche al giallo, a causa della riduzione del pH. Uno inoltre possibile valutare l’attivazione delle cellule di linfonodo di AQP4-innescato T erogarici per proliferazione dall’incorporazione di 3H-timidina, come descritto nel protocollo passaggio 3.

La nostra scoperta che i due epitopi a cellula T AQP4 patogeni sono (1) previsto per associare MHC II con alta affinità e (2) suscitare risposte proliferative potente in AQP4– / –, ma non WT, topi suggeriscono che le cellule T targeting quelle determinanti sono normalmente controllata dalla selezione negativa timica17. Il repertorio TCR utilizzato per il riconoscimento di AQP4 p135-153 e p201-220 in AQP4– / – topi è unici (Figura 2), che è anche coerente con delezione clonale mediata da cellule epiteliali midollare del timo. Altri meccanismi tollerogeniche normalmente possono trattenere le risposte immunitarie a AQP4. A seguito del nostro rapporto iniziale17, un altro gruppo ha inoltre dimostrato che AQP4 p201-220 contiene un encephalitogenic cellula T determinante27. Quando i topi α/β (TCRα– / –) T cellula-carenti erano ricostituiti con AQP4– / – CD4+ T cellule, è stato possibile suscitare una risposta delle cellule T encephalitogenic AQP4 specifici, ma non una risposta umorale AQP4-specifica, che implica che in Topi WT AQP4-specifiche delle cellule di B risposte, simili a risposte delle cellule T specifiche per AQP4, sono soggetti a selezione negativa. Infatti, perdita di assoni del midollo spinale e RGCs, che non è stata osservata nei topi WT con ATCA indotta dalle cellule di T di AQP4 specifici da solo, può richiedere la partecipazione degli anticorpi patogeni specifici AQP4. È chiaro che modelli murini di autoimmunità targeting AQP4 CNS continuerà ad evolversi come apprendiamo di più per quanto riguarda i meccanismi di tollerogeniche normalmente controllo immunità AQP4 specifiche cellule T e delle cellule di B.

Altri modelli dell’autoimmunità targeting AQP4 CNS vengono sviluppati6,16,28,29,30. Ciascuno di essi può offrire vantaggi per lo studio di particolari aspetti che sono rilevanti per la patogenesi NMO. Le cellule di T di AQP4-specifiche sono state identificate in WT ratti6,16,29. Quelle cellule T specifiche AQP4 causato cambiamenti istologici dell’autoimmunità CNS ma, simili alle osservazioni nei topi, cellule T AQP4-specifici del ratto WT non causano significativi segni di malattia clinica. Pertanto, i meccanismi di tolleranza limitazione delle cellule T e delle cellule di B AQP4 specifiche risposte immunitarie in topi WT sono anche operativi in ratti. Indipendentemente da ciò, uno non dovrebbe sottovalutare il potere utilizzando modelli murini per studiare i meccanismi coinvolti nella patogenesi della malattia. La ricchezza di knock-out, transgenici e topi reporter può essere vantaggiosa. Va anche riconosciuto che parecchie scoperte fondamentali nell’autoimmunità sono stati realizzati utilizzando modelli murini di EAE. Ad esempio, dimostrazione che cellula T cloni specifici per un auto-antigene possa mediare la malattia autoimmune31,32, identificazione del ruolo della costimolazione delle cellule T in autoimmunità33 e la scoperta della via di sviluppo per Th17 differenziazione34 furono descritti per la prima volta utilizzando modelli murini di EAE. Utilizzando il modello murino di ATCA che abbiamo sviluppato, uno ora ha i mezzi per studiare lo sviluppo e la regolamentazione dei patogene risposte immunitarie specifiche AQP4 in vivo, che dovrebbe fornire le comprensioni importanti legate alla patogenesi NMO.

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Supporto è stato fornito a S.S.Z. dal National Institute of Health (RO1 AI073737 e RO1 NS092835-01), National Multiple Sclerosis Society (RG 4768, 5179 RG e RG 5180), Fondazione Maisin e Guthy Jackson Charitable Foundation.

Materials

M. tuberculosis H37Ra BD Difco 231141 Dessicated, killed M. tuberculosis
Incomplete Freund's Adjuvant BD Difco 263910
AQP4 peptide p135-153 Genemed Custom Synthesis Peptide sequence: LVTPPSVVGGLGVTMVHGN
AQP4 peptide p201-220 Genemed Custom Synthesis Peptide sequence: HLFAINYTGASMNPARSFGP
MOG peptide p35-55 Genemed / Auspep Custom Synthesis Peptide sequence: MEVGWYRSPFSRVVHLYRNGK
3-way Stopcock Kimble 420163-4503
HyClone Fetal Bovine Serum (Characterized) GE Healthcare Life Sciences SH30071
Recombinant Mouse IL-23 R&D Systems (BioTechne) 1887-ML
Recombinant Mouse IL-6 R&D Systems (BioTechne) 406-ML
Recombinant Mouse IL-12 R&D Systems (BioTechne) 419-ML
Thymidine [Methyl-3H] PerkinElmer NET027
Glass Fiber Filtermats PerkinElmer 1450-421
Anti-mouse antibodies eBioscience (Affymetrix) [various]
Anti-mouse TCR Vβ Screening Panel BD Biosciences 557004
LIVE/DEAD Fixable Dead Cell Stain ThermoFisher Scientific [various]
Paraformaldehyde (16%) Electron Microscopy Sciences 15710
Fixation/Permeabilization Solution Kit with GolgiPlug BD Biosciences 555028
Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) Sigma-Aldrich P8139
Iomomycin (calcium salt) Sigma-Aldrich I0634
Pertussis Toxin from B. pertussis List Biological Laboratories 181
10% Formalin VWR 89370-094
Variable-Flow Peristaltic Pump Fisher Scientific 13-876-2
Foam Biopsy Pads, Rectangular Fisher Scientific 22-038-221
Isothesia (isoflurane, USP) Henry Schein Animal Health 050033 NDC : 11695-0500-2
Tropicamide Ophthalmic Solution, USP (1%) Akorn NDC: 17478-102-12
Spectralis Diagnostic Imaging Platform Heidelberg Engineering
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Referências

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Sagan, S. A., Cruz-Herranz, A., Spencer, C. M., Ho, P. P., Steinman, L., Green, A. J., Sobel, R. A., Zamvil, S. S. Induction of Paralysis and Visual System Injury in Mice by T Cells Specific for Neuromyelitis Optica Autoantigen Aquaporin-4. J. Vis. Exp. (126), e56185, doi:10.3791/56185 (2017).
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