Induktion von Lähmung und visuelles System Verletzungen bei Mäusen durch T-Zellen spezifisch für Neuromyelitis Optica Autoantigen Aquaporin-4

alle tierischen Eingriffe wurden in Übereinstimmung mit den experimentellen Leitlinien von der University of California, San Francisco institutionelle Animal Care und Use Committee genehmigt. Weibliche Mäusen C57BL/6 (h-2 b), 8 Wochen alt, wurden gekauft und C57BL/6 AQP4 – / – Mäuse wurden von A. Verkman. 1. Immunisierung von Mäusen mit AQP4 Peptide bereiten Sie komplette Freund ' s Adjuvans (CFA) Arbeit Lager. Fein mahlen eine ausgetrocknete Vorbereitung von M. Tuberculosis (H37Ra) mit einem Mörser und Pistill. Add Boden H37Ra, unvollständige Freund ' s adjuvante, eine Endkonzentration von 4 mg/mL. CFA kann bis zu 6 Monate bei 4 ° C gelagert werden. Auflösen lyophilisiert Antigen (Ag) AQP4 Peptid in Phosphat gepufferte Kochsalzlösung (PBS), eine Endkonzentration von 1 mg/mL. Halten bei 4 ° C oder auf Ice Bereiten Sie die Baugruppe 2 Luer-Lock Spritzen, verbunden mit einem Absperrhahn mit CFA/Peptid Emulsion. Attach Glas Luer-Lock Spritze ohne Kolben, um eine 3-Wege-Nylon-Absperrhahn mit 2 männlichen Luer-Lock-Verbindungen. Schließen Sie den Absperrhahn durch den Wechsel der Hebel gegen die Spritze. Positionieren Sie das offene Ende der Spritze auf, so dass die Spritze, als ein Reagenzglas zu handeln. Platzieren Sie diese in einem Rohr Rack für zusätzliche Stabilität. Vortex CFA arbeiten Lager und die Ag-Lösung. Fügen Sie ein 1:1 Volumen von Peptid / CFA an der offenen Spritze. 200 µL der CFA/Ag (4 x 50 µL) ist per Mausklick erforderlich. Hinweis: In der Regel etwa 1 mL der Vorbereitung der Absperrhahn verliert die zur Immunisierung reduzieren wird. Daher ist es wichtig, dies in die Berechnung des Gesamtvolumens erforderlich zu integrieren. Beispiel: für die Immunisierung von Mäusen, 5: (200 µL/Tier X 5 Tiere) + 1 mL extra Volumen = 2 mL insgesamt CFA/Ag erforderlich. Legen Sie den Glas-Kolben in die Spritze und während es in Position zu halten, drehen Sie die Spritze, so dass der Absperrhahn nach oben ausgerichtet ist. Wechseln Sie den Absperrhahn Hebel zur ungenutzten weiblichen Verbindung. Vorsichtig Druck auf das Glas Kolben um überschüssige Luft aus der Spritze entfernen. Die Flüssigkeit füllt die zweite männliche Luer-Lock-Verbindung von der Absperrhahn. Legen eine zweite Glasspritze (Kolben vollständig eingesteckt) auf der zweiten männlichen Luer-Lock-Verbindung von den Absperrhahn. Dies sollte ein geschlossenes System von 2 Glas Spritzen mit einem Absperrhahn mit als wenig überschüssige Luft wie möglich verbunden. , Eine Emulsion zu schaffen durch drücken die Kolben übergeben der Flüssigkeit abwechselnd zwischen die 2 Spritzen für ca. 2 min. Chill die Spritzen auf Eis für ca. 10 min. Wiederholen Sie die kühlen und mischen, bis eine klare der Viskosität der Zubereitung Änderung mischen , was zu einem sehr steifen, weiße Emulsion. Die Spritzen mit der Emulsion bei 4 ° C im Kühlschrank oder auf Eis zu halten Transfer aller der Emulsion zu einer Glasspritze Luer-Lock, die leere Glasspritze entfernen und ersetzen Sie es mit einer 1 mL-Luer-Lock-Spritze für die Injektion. Füllen Sie die neue Spritze mit Emulsion, entfernen Sie es aus dem Hahn und befestigen Sie eine Nadel (25 X 5/8). " Wasser-Test " die Emulsion auf Konsistenz. Einen Tropfen der Emulsion in eine kleine Schüssel mit Wasser zu vertreiben. Die Emulsion sollte nicht zerstreuen, darauf hinweist, dass es geeignet für die Injektion ist. Wenn die Emulsion verteilt, ist es nicht bereit zur Injektion; die Flüssigkeit zurück in das Glas Spritzen und weiter mischen und dann wieder entspannen, bis die Emulsion steif ist. Die Emulsion wieder zu testen, bis die richtige Konsistenz erreicht worden ist. Spender AQP4 – / – Mäusen subkutan zu injizieren (s.c.) mit Emulsion mit AQP4-Peptid. Jede Maus erhält 4 x 50 µL s.c. Injektionen (200 µL Gesamt (100 µg Peptid)). Die 4 Seiten sind Seiten des Unterleibs, die in die inguinalen Lymphknoten (LN) abtropfen lassen, und beide Seiten der Brustwand medial jeder Achsel, die in axillären LN zu entwässern Die Adoptiveltern Übertragung erfordert 1-2 immunisierten Spender Mäuse pro Empfänger Maus. 2. T-Zell-Kultur und Proinflammatory T-Zell-Polarisation 10-12 Tage nach der Impfung, kassiere die Mäuse in LN. In eine Eiswürfelschale bereiten 60 mm Petrischalen mit einer Zelle Sieb (Gitter Größe 70 µm) ausgestattet, gekühlte RPMI Medium mit 10 % Hitze-inaktivierten fetalen bovine Serum (FBS) und 100 U/mL Penicillin-100 µg/mL Streptomycin (Stift-Strep) (RFPS) enthalten. Einschläfern Mäuse durch die Einwirkung von CO 2, gefolgt von zervikale Dislokation. Mäuse in 70 % igem Ethanol Tauchen und dann pin jedes Straßenräuber gegenüber einer Dissektion. Schneiden einen Mittellinie Hautschnitt von der Leiste bis zum Hals und unten jedes Bein. Ziehen Sie die Haut von dem Bauchfell und Heften Sie es straff auf dem Brett. Leisten- und axillären LN zu sezieren und in der Petrischale mit RFPS auf Eis legen. 19 für Adoptiveltern Transfer Experimente kombinieren LN von allen Tieren innerhalb der gleichen Gruppe Immunisierung. Für Flow durchflusszytometrischen Analyse der Vβ Nutzung, LN trennen einzelner Tiere. Die Zelle Sieb mit der LN auf eine 50 mL Zentrifugenröhrchen mit Angebotsanfragen zu platzieren. Verwenden Sie das flache Ende des Spritzenkolbens eine sterile 5 mL drücken, die LN-Zellen durch das Sieb, waschen mit 20-30 mL RFPs, Wiederherstellung der Zellen zu erleichtern. LN-Zellen auf Eis während der Verarbeitung bis Zeit für Kultur zu erhalten. Waschen zweimal, bei 393 X g für 5 min zentrifugieren. Nach der zweiten Wäsche Aufschwemmen der LN-Zellen in T-Zell-Medien (TCM). TCM enthält RPMI mit 10 % Hitze-inaktivierten FBS, 292 µg/mL L-Glutamin, 110 µg/mL Natrium Pyruvat und 55 µM 2-Mercaptoethanol und Stift-Strep. In der Regel ein Volumen von 5 mL TCM pro Spender Maus verwendet. Zählen die LN-Zellen. Erwartete Rendite ist ca. 3-6 x 10 7 LN Zellen pro immunisierten Maus Spender. Beiseite von 3-4 x 10 6 für eine Verbreitung-Assay (siehe Abschnitt 3). Richten Sie polarisieren Kulturen für Adoptiv-Transfer (Abschnitt 6). Bereiten eine Th17 polarisierende Kultur von 5 x 10 6 LN Zellen pro mL mit 10 µg/mL Ag, 20 ng/mL rekombinanter Maus Interleukin (IL)-23 und 10 ng/mL rekombinanter Maus IL-6 in der TCM. Alternativ Th1 Polarisation, Vorbereitung einer Kultur von 5 x 10 6 LN Zellen pro mL mit 10 µg/mL Ag und 10 ng/mL rekombinanter Maus IL-12 in der TCM. Fügen Sie 2 mL (1 x 10 7 Zellen) pro Bohrloch der polarisierende Kultur Mischung in ein 12-Well-Platte. Die LN-Zellen von 2-4 Spender Mäusen werden ein 12-Well-Platte füllen. Pflegen Kulturen in einem befeuchteten Inkubator bei 37 ° C mit 5 % CO 2 für 72 h Eine Sichtkontrolle der LN Zellen in der Kultur für die Aktivierung bei 48 h und 72 h. aktivierten Zellen bilden umfangreiche Cluster und die T-Zellen in der Größe, immer mehr pleomorphen erhöhen. Die Steigerung des Stoffwechsels bewirkt eine Absenkung des pH-Wertes in den Medien, Wechsel von Pfirsich, Orange. Ist der pH-Wert niedrig genug, um die Medien zu vergilben, fügen Sie 1 mL frische TCM gegen Toxizität auf die Zellen in den verbleibenden 24 Std. Fahren Sie mit Abschnitt 6 für Adoptiveltern übertragen. Polarisation Effizienz kann durch intrazelluläre Zytokin Färbung (ICS), als Descr überprüft werdeniBed in Abschnitt 5. Richten Sie Kulturen mit LN aus einzelnen Mäusen für durchflusszytometrischen Analyse der Vβ Oberflächenexpression (Abschnitt 4). 5 x 10 6 LN Zellen pro mL mit 10 µg/mL Ag in der TCM vorzubereiten. Add 2 mL (1 x 10 7 Zellen) der Kultur pro Bohrloch in einer 12-Well-Platte. Kulturen ist für 10 Tage in einem befeuchteten Inkubator bei 37 ° C mit 5 % CO 2 aufzubewahren. Fahren Sie mit Abschnitt 4. 3. Verbreitung Assay Hinweis: Dies wird fortgesetzt, aus Abschnitt 2.4. Bereiten 3-4 mL LN Zellen in einer Röhre, 2 x 10 6 Zellen pro mL in der TCM. Vorsichtig mischen die Zellen durch das Rohr mehrmals umdrehen, und übertragen Sie dann auf einem sterilen Trog. Verwendung eines Mehrkanal-Pipette, Platte 100 µL Zellen pro Bohrloch in einer 96-Well-Runde Bodenplatte Gewebekultur. In der Regel Platte 15 Brunnen zu Testzwecken dreifacher 4 Ag-Konzentrationen und keine Referenz Ag. Verdünnen die Ag in TCM bei verschiedenen Konzentrationen, in der Regel 80, 20, 5, 1 und 0 µg/mL (für 2 X Bestände). Fügen Sie 100 µL jeder Konzentration in dreifacher Ausführung für eine Endkonzentration von 40, 10, 2.5. 0,5 und 0 µg/mL. Brüten etwa 72 Stunden bei 37 ° c Hinweis: Schritte 3.5 bis 3.7 umfassen radioaktive Stoffe. Ordnungsgemäße Verwendung, Überwachung und Entsorgung von radioaktiven Stoffen durchgeführt werden, gemäß den institutionellen und staatlichen Vorschriften. Bereiten eine arbeiten-Stammlösung von 3 H-Thymidin (40 µCi/mL) mit 25 mL RPMI 1 mCi 3 H-Thymidin hinzu, und speichern Sie diese auf 4 ° C. Pipettieren 0,5 mL der Arbeitslösung in einen sterilen Trog. Fügen Sie 25 µL 3 H-Thymidin (1 µCi) pro auch mit einem Mehrkanal-pipettieren. Inkubieren Sie für weitere 18 h bei 37 ° c Zellen auf ein Glas Filtermatte mit einer 96-Well-Zelle-Erntemaschine zu ernten und mit 70 % Ethanol spülen. Nach dem Trocknen, versiegeln Sie die Filtermatte in einen Kunststoff Probe Beutel mit 5 mL funkeln Flüssigkeit. Maßnahme Radioaktivität in jeder gut mit einem Szintillationszähler. 4. Flow Cytometry Analysis für Zelle Oberfläche TCR Vβ Ausdruck Hinweis: Dies wird fortgesetzt, von Abschnitt 2.6. Antikörper gegen Maus TCR Vβ 2, 3, 4, 5.1 und 5.2, 6, 7, 8.1 und 8.2, 8.3, 9, 10, 11, 12, 13, 14 und 17a sind kommerziell zum Testen des TCR Vβ-Ausdrucks zur Verfügung. Für die Erkennung von TCR Vβ, T-Zellen aus der Kultur-Platte durch Pipettieren mehrmals zu verdrängen und Zellen auf einem Rohr übertragen. Mit FACS Puffer (FB), enthält 2 % FBS, 0,1 % Natriumazid und 2 mM EDTA in PBS waschen. Transfer-Zellen zu einem V-Boden-96-Well-Platte bei einer Dichte von 1 x 10 5 bis 3 x 10 6 Zellen pro Bohrloch. Wenn das gesamte Vβ-Panel getestet wird, sollten die Zellen in mehrere Vertiefungen (einen Brunnen pro Vβ getestet) verteilt werden. Tote Zellen von der durchflusszytometrischen Analyse durch Färbung mit einem LIVE/DEAD Lebensfähigkeit Farbstoff, das mit freien Amine durch nekrotische Zellen ausgesetzt reagiert ausschließen. Folgen Sie den Hersteller ' s Gebrauchsanweisung Zentrifugation und Wiederfreisetzung in Lebensfähigkeit Farbstoff. Inkubieren Sie für 10-20 min. in die Zelle Färbung Verfahren auf Eis, Zellen vor Licht schützen und halten Sie auf Ice Nach der Inkubation, waschen Sie die Platte einmal in FB. Um TCR Vβ erkennen, aussetzen der Zellen in 100 µL der FB mit einer 1: 100 Verdünnung der Antikörper für CD4 (Klon RM4-5) und TCR Vβ. Inkubieren Sie für 15-60 min auf Ice Waschen Sie die Platte einmal in FB und befestigen Sie die Zellen durch Zugabe von 200 µL 4 % Paraformaldehyd in PBS verdünnt. Inkubieren Sie für 20 min auf Eis. Waschen Sie die Platte in der FB und analysieren von Durchflusszytometrie. 5. Durchflusszytometrischen Analyse für intrazellulären Produktion von Zytokinen fließen für intrazelluläre Zytokin Färbung (ICS), T-Zell-Kulturen mit einer 1:1,000-Verdünnung von Protein Transport Inhibitor Reagenz (z. B. GolgiPlug) behandeln in der TCM 4 h vor der ICS zu verhindern Zytokin-Sekretion. Zu diesem Zeitpunkt aktivieren, T-Zellen mit 50 ng/mL Phorbol Myristate-12 13-Acetat (PMA) und 500 ng/mL Ionomycin um Protein-Produktion induzieren. Nach 4 h der Kultur bei 37 ° C, verdrängen Zellen aus der Kultur-Platte durch Pipettieren rauf und runter, und übertragen Sie auf eine Zentrifugenröhrchen (15 oder 50 mL). Waschen mit FB. Zellen in FB und Transfer zu einem V-Boden-96-Well-Platte bei einer Dichte von 5 x 10 5 bis 3 x 10 6 Zellen pro Bohrloch Aufschwemmen. Fleck Zellen mit Lebensfähigkeit Farbstoff wie beschrieben (Abschnitt 4.2). Nach der Inkubation, waschen Sie die Platte einmal in FB. Antikörpern zum Nachweis von Oberflächenmarker wie folgt hinzufügen: für die Erkennung von Oberflächenmarker, aussetzen der Zellen in 100 µL der FB mit einer 1: 100 Verdünnung der Antikörper für CD4 (Klon RM4-5). Optional gehören Antikörper für B220 (Klon 30-F11) und CD11b (Klon M1/70) bei einer 1: 100 Verdünnung Anspritzung von B-Zellen und Monozyten/Makrophagen, bzw. zu verbessern. In der Regel funktionieren PE-Cy7 Anti-CD4, FITC Anti-B220 und PerCP-Cy5.5 Anti-CD11b gut. Wahl der Antikörper/Fluorochrom Konjugate sollte geführt werden, durch Konfiguration des Durchflusszytometer für Analyse verwendet werden, und optimale Konzentrationen von Antikörpern sollte empirisch ermittelt werden. Inkubieren Sie für 15-60 min auf Eis. Waschen Sie die Platte mit FB und Aufschwemmen der Zellen in 200 µL Fixierung/Permeabilisierung Lösung für 20 min auf Eis. Dies die Zellen zu beheben und die Membranen permeabilize. Um die Permeabilisierung der Zellmembranen während die intrazelluläre Färbung zu erhalten verwenden anstelle von FB Perm/Waschpuffer (PW) (verdünnte 01:10 von 10 X Lager). Waschen Sie die Brunnen in 200 µL PW. Für ICS, bereiten Sie eine 1: 100 Verdünnung der Antikörper für Interferon (IFN)-γ und IL-17A mit 1 X PW. Eine Option ist APC Anti-IFN-γ (Klon XMG1.2) und PE Anti-IL-17A (Klon eBio17B7) die gut funktioniert. Zellen in 100 µL des intrazellulären Antikörpers cocktail Aufschwemmen und dann mindestens 15 min inkubieren. Es ist auch möglich, weiterhin die Färbung über Nacht bei 4 ° c Waschen die Brunnen in 200 µL PW und Wiederfreisetzung in FB für Durchflusszytometrie. Parallel, bereiten eine ungefärbte Probe (Zellen in FB ohne Antikörper) Detektor Spannungen und Single-gefärbten Proben für jede einzelne Fluorochrom (d. h. Zellen oder Entschädigung Perlen gefärbt mit nur einem Antikörper/Fluorochrom) zu optimieren bestimmen Spillover Ausgleichswerte. Mit einem Durchflusszytometer, erwerben ≥ 10.000 Zellen (Veranstaltungen), gating auf tragfähige (LIVE/DEAD-negativ) CD4 + Zellen. Um genaue Anspritzung von T-Zellen zu gewährleisten, schließen die B220 + und CD11b + Zellen (B-Zellen und Monozyten/Makrophagen, beziehungsweise). Innerhalb der CD4 + T Zelle Subpopulation, bestimmen, den Anteil der Zellen mit dem Ausdruck IFN-γ (Th1-Linie) oder IL-17A (Th17 Abstammung). 6. Adoptiveltern übertragen Pathogene AQP4-spezifischen T-Zellen Hinweis: Diese Schritt ergibt sich aus Abschnitt 2.5: T-Zell-Kultur und proinflammatorischen T-Zell-Polarisation. Recover polarisierten Zellen von 12-Well-Platten durch Pipettieren rauf und runter um zu verdrängen, und ihre Übertragung auf eine 50 mL-Tube. MaIntain auf dem Eis bis Injektionen. Der Zellen zu zählen, zweimal in kaltem PBS waschen und vorbereiten eine Suspension von 1 x 10 8 Zellen/mL in PBS. In der Regel injizieren Zellen innerhalb einer Stunde. Sanft die Zellen durch Umschwenken mischen und auf eine 1 mL Spritze zum Zeitpunkt der Injektion übertragen. Verwalten von 200 µL der Zellen (2 x 10 7) intravenös (i.v.) für jede Maus durch den Schweif Vene. Spritzen jeder Empfänger Maus i.p mit 200 ng von B. Pertussis-Toxin in 200 µL PBS verdünnt, an diesem Tag und 2 Tage später. Überwachen Sie Mäuse täglich auf Anzeichen einer klinischen Erkrankung. 7. Klinische Bewertung von ATCA Examine Empfänger Mäuse täglich auf klinische Anzeichen von CNS Autoimmunität. Im Allgemeinen werden Mäuse CNS Autoimmunität 5-8 Tage nach Adoptiveltern Übertragung von AQP4-spezifischen T-Zellen aufweisen. Die Mäuse zeigen klinische Symptome einer neurologischen Dysfunktion. Es ist hilfreich, die Auswertungen auf eine naiv-Maus, die normale Fähigkeit einer Maus zu definieren. Evaluate Mäuse für den Verlust der Rute Ton. Halten Sie die Mäuse sanft an der Unterseite der Rute und heben Sie aufrecht. Ein Heck, dass Droops wird kontinuierlich als Verlust der Rute Ton (Ergebnis 1). Verlust der Rute Ton ist oft das erste Zeichen der klinischen Erkrankung. Test für aufrichtenden Reflex indem Maus auf dem Rücken auf einer flachen Oberfläche. Langsam aufrichten, ist ein Zeichen von Herzkreislaufkrankheiten Koordinationsstörungen (Score von 2). Eine naiv-Maus wird komplett widerstehen jeder Versuch, legen Sie sie auf den Rücken, damit Langsamkeit in der Fähigkeit zu Recht als Dysfunktion erzielt wird. Es ist typisch für die Maus 3 – 4 Mal für diesen Reflex testen. Evaluate Körperhaltung und Mobilisation. Mäuse beginnen, um eine Änderung in der Haltung führt zu einer Senkung oder ziehen der Hüften während der Mobilisation (Score von 2,5). Weitere Krankheit führt zu Monoplegia, vollständige Lähmung einer Hirschkuh Gliedmaßen (Score von 3.0) und Paraplegie, vollständige Lähmung der beiden hinteren Gliedmaßen (Score von 3,5). Moderate Quadraparesis, alle vier Extremitäten, Schwäche führt zu sehr langsame Vorwärtsbewegung (Score von 4). Schwere Quadraparesis lässt fast keine Vorwärtsbewegung (Score von 4,5). Schließlich können sie mit schweren Erkrankungen zu moribund oder sterben (5 Punkte). Verwalten, Mäuse, die die Fähigkeit verlieren, flüssige oder feste Nahrung 1 mL 5 % Glukose in Kochsalzlösung i.p Alternativ erwerben Verwendung Supplementierung mit Flüssigkeit gel Tassen, hohen kalorischen Gel und Speck Softies, Austrocknung und Nahrungsmangel entgegenzuwirken. Moribund Mäuse einschläfern. 8. Gewebe-Vorbereitung und Histologie Mäuse mit 100 mg/kg Ketamin und 10 mg/kg Xylazin zu betäuben und dann pin jedes Straßenräuber gegenüber einer Dissektion. Open auf der Brust, das Herz aussetzen. Einschneiden der Leber Blut Abfluss ermöglichen. Legen Sie eine Butterfly-Nadel auf das Rohr einer Miniflow drehzahlgeregelte Pumpe mit einem separaten Behälter für PBS und 10 % Formalin. Stechen Sie die Nadel in den linken Ventrikel des Herzens und mit 5 mL PBS, gefolgt von 25 mL 10 % Formalin perfundieren. Den Kopf und dann die Augen entfernen. Prozess-Augen und Netzhaut wie zuvor 20 beschrieben. Quer durch die Augenhöhlen, legen Sie die Schere an der Nase und schneiden den Schädel anterior Posterior auf jeder Seite. Den Schädel zu entfernen, setzen Sie die Sehnerven, schneiden Optik Chiasmus und in einer Kassette zwischen 2 Schaumstoff-Pads. Tauchen in 10 % Formalin (24 h), und dann 50 % Ethanol (24 h) und übertragen Sie dann mit 70 % Ethanol. Gehirn und Wirbelsäule zu entfernen und in 10 % Formalin. Seriell Abschnitt Gehirne in der koronalen Ebene; Sektion Wirbelsäule Schnüre in sagittaler (etwa die Hälfte) und serielle koronalen Flugzeuge (ca. 20 Querschnitte per Mausklick). Prozess CNS Proben routinemäßig für Paraffin einbetten. Fleck 8 µm dicke Abschnitte mit Hämatoxylin und Eosin (Sehnerven) oder Luxol schnelles blau-Hämatoxylin und Eosin (Gehirn und Rückenmark). Bewerten Sehnerven auf das Vorhandensein von Entzündungen innerhalb der Nerven und der umgebenden Hirnhäute (Optikusneuritis) oder überwiegend in der umgebenden Hirnhäute (optische Perineuritis). Zählen meningealen und parenchymatösen entzündliche Herde (> 10 gruppierten mononukleären Zellen) in das Gehirn und Rückenmark Proben für jede Maus. 9. In Vivo Retinale Bildgebung durch Optische Kohärenztomografie (OCT) Hinweis: Spectral-Domain OCT Netzhaut Bildgebung von Mäusen erfolgt mit kommerziellen Geräten (z. B. Spectralis mit TruTrack Eye-Tracker), konsequente Okular zu erreichen Orientierung und reduziert Bewegungsartefakte. 5 min. vor Bildgebung, erweitern Schülerinnen und Schüler mit 1 % Tropicamid (ein Tropfen pro Auge) und legen Sie Maus, um in der Anästhesie-Induktion-Kammer, abgebildet mit einem stetigen Strom von 2 l / min (1,5 % Isofluran). Schalten Sie Wärme Matte und bereiten Sie den Post-Narkose Erholung Käfig. Platzieren Sie den Mauszeiger auf die Bildgebung Zylinder und leiten die Anästhesie Ablauf entsprechend. Schützen Sie die Augen mit 0,3 % Hydroxypropyl Methylcellulose, das Auge feucht zu halten und Brechung Kontinuität zu gewährleisten. Legen Sie eine benutzerdefinierte Kontaktlinse auf das Auge untersucht werden. Führungen durch das Infrarot-Fundus-Bild direkt den Laser auf das Auge, sicherzustellen, dass der Strahl auf den Sehnerv Kopf zentriert ist. Vertikale und horizontale OCT Scans sollten sicherstellen, dass die Netzhaut senkrecht zum Laser legt. Führen Sie 25 B-Scans im hochauflösenden Modus und Rastern von 30 gemittelt Bildfenster. Nach imaging beide Augen, Kontaktlinsen entfernen und ophthalmologische Gel auftragen. Maus im Käfig warm Erholung lassen. 10. Verarbeitung und Analyse von OCT verwenden das modulare imaging-Software für die automatisierte Segmentierung. Manuell richtigen Segmente entsprechend der Inneres Begrenzung der Membran (ILM) und inneren plexiformen Schicht (IPL), repräsentiert die Grenzen der inneren Netzhaut “layers” (IRL) 21. Überprüfen, die der retinalen Nervenfaserschicht (RNFL) und das Ganglion Zellschicht (GCL) befinden sich innerhalb der Grenzen der IRL und sich nicht überschneiden. Berechnen IRL stärken das frühe Behandlung diabetischer Retinopathie Studie (ETDRS) 2 Gitter mit einem Durchmesser von 1, 2 und 3 mm zentriert auf die Papille und Export in eine Kalkulationstabelle verwenden. Die Software berechnet die Dicke der einzelnen Schichten der Netzhaut durch Mittelung jedes Raster-Sektor. Daher ist das mittlere Segment, entsprechend des Sehnervenkopfes ausgeschlossen. Analysieren statistischen Unterschiede zwischen den Gruppen zu jedem Zeitpunkt. Analysieren beide Augen für jede Maus, die mit generalisierten Schätzung Gleichungen mit einer austauschbaren Korrelationsmatrix und Anpassungen für Intra unterliegt Inter Auge Korrelationen 21.