Applicazione di MultiColor FlpOut tecnica per studiare ad alta risoluzione singola cella morfologie e interazioni delle cellule della Glia in Drosophila
Summary
Le cellule visualizzare diverse morfologie e stabilire una serie di interazioni con i loro vicini. Questo protocollo descrive come per rivelare la morfologia delle singole cellule e per indagare l’interazione cellula-cellula utilizzando il sistema di espressione Gal4/UAS ben consolidato.
Abstract
Celle sono visualizzate diverse morfologie e complessi rapporti anatomici. Come le cellule interagiscono con i loro vicini? Le interazioni differiscono tra tipi cellulari o anche all’interno di un determinato tipo? Quali tipi di regole spaziali seguono? Le risposte a tali domande fondamentali in vivo sono state ostacolate finora da una mancanza di strumenti per l’etichettatura di alta risoluzione singola cella. Qui, viene fornito un protocollo dettagliato per singole celle con una tecnica di MultiColor FlpOut (MCFO) di destinazione. Questo metodo si basa su tre in modo diverso con tag reporter (HA, bandiera e V5) sotto il controllo UAS che sono taciuti da un terminatore trascrizionale fiancheggiato da due siti di FRT (FRT-fermata-FRT). Un impulso di scossa di calore induce l’espressione di un calore indotta da shock Flp ricombinasi, che rimuove in modo casuale le cassette di FRT-fermata-FRT in singole celle: espressione si verifica solo nelle cellule che esprimono anche un driver GAL4. Questo porta a una matrice di celle diversamente colorate di un tipo dato delle cellule che permette la visualizzazione delle morfologie di cella singola ad alta risoluzione. Ad esempio, la tecnica MCFO combinabile con driver GAL4 glial specifici per visualizzare le morfologie dei diversi sottotipi gliali nel cervello adulto Drosophila .
Introduction
Glia, la popolazione delle cellule non neuronali del sistema nervoso (NS), sono stati a lungo creduto di fornire un quadro statico per i neuroni e pertanto non sono stati studiati in dettaglio. Tuttavia, negli esseri umani, glia costituiscono la stragrande maggioranza delle cellule del NS (~ 90%) e rientrano in diverse categorie, tra cui gli astrociti, oligodendrociti, microglia e cellule di Schwann. In Drosophila, glia costituiscono circa il 10% delle cellule nel NS. Intrigante, loro morfologie e funzioni sono notevolmente simili a quelli trovati in vertebrati1,2. Loro morfologie includono barriera emato – encefalica (BBB) formando epiteli, gliali e Astrocita-come le cellule.
Il sistema nervoso centrale di Drosophila (CNS) si compone delle seguenti strutture principali: regioni della corteccia che contengono i corpi cellulari neuronali; neuropils che porto connessioni sinaptiche; tratti di piccole e grandi dell’assone che collegano i diversi neuropiles; nervi periferici che collegano gli organi sensoriali e muscoli con il CNS (Figura 1). Glia sono trovati collegati con tutte queste strutture anatomiche: glia di corteccia (CG) nelle regioni corticali, Astrocita-come glia (ALG) e gliali glia (EG) nelle regioni compresa, gliali glia sono anche associate a tratti assone centrale e periferico nervi (EGN) e infine, due foglio-come glia, glia perineurial (PG) e subperineurial (SPG), che insieme formano uno strato contiguo che copre l’intera NS (Figura 2).
Studi precedenti hanno dimostrato che cellule gliali svolgono un ruolo importante nello sviluppo del NS; monitorare un numero di cellulare di un neurone reagendo ai peptidi del tipo di insulina di circolazione sistemica, forniscono supporto trofico ai neuroni, tra cui la navetta di lattato di astrociti ed eliminare i neuroni morenti di fagocitosi3,4 , 5 , 6. nel NS maturo, glia mantenere la BBB, occupano neurotrasmettitori e mantenere l’omeostasi ionica, agire come le principali cellule immunitarie nel NS, poiché i macrofagi non possono violare la BBB e modulare l’attività sinaptica, nonché il comportamento animale6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11.
Se i diversi sottotipi gliali svolgono funzioni specializzate rimane un importante problema irrisolto. Tuttavia, un’analisi sistematica del genoma della glia, soprattutto nell’adulto, è stata ostacolata dalla mancanza di appropriati strumenti genetici per la loro manipolazione. Qui, un metodo che permette la caratterizzazione efficiente e facile di forme di cella per studiare le interazioni cellula-cellula complessa è presentato. Questa tecnica è stata applicata per caratterizzare la morfologia dei diversi sottotipi gliali nel cervello adulto Drosophila , ma, a seconda del driver GAL4 specifico utilizzato, potrebbe essere adattato per studiare i neuroni12,13 , qualsiasi tipo di macrosezioni cellule e in linea di principio qualsiasi tessuto in tutte le fasi inerenti allo sviluppo.
Protocol
Representative Results
Discussion
Questo protocollo descrive un metodo semplice ed efficace per studiare la morfologia dei diversi tipi di cellule all’interno di un tessuto di interesse ad alta risoluzione. Con la tecnica del MCFO reporter multipli con differenti epitopo tag sono utilizzati in combinazione per multicolor stocastico etichettatura (Figura 2). Simili ad altri metodi come Brainbow/Flybow15,16,17, MCFO aumenta la diversi…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gli autori ringraziano Arnim Jenett, Aljoscha Nern e altri membri del laboratorio Rubin per consigli e condivisione di reagenti inediti e il Janelia Fly Light Project Team per la generazione di immagini confocal. Gli autori ringraziano anche i membri del laboratorio Gallia per commenti sul manoscritto.
Materials
| Water bath | Grant | GD100 | |
| PCR tubes | Sarstedt | 72.737.002 | |
| Forceps | Dumont | 11251-20 | |
| Dissecting dish 30 mm x 12 mmm | Electron Microscopy Sciences | 70543-30 | Glass dissection dish |
| Pyrex 3 Depression Glass Spot Plate | Corning | 7223-34 | Glass dissection plates |
| Sylgard Black | SYLGARD, Sigma-Aldrich | 805998 | home made with charcoal |
| ExpressFive S2 cell culture medium | Invitrogen | 10486-025 | |
| 20% PFA | Electron Microscopy Sciences | 15713 | |
| Triton X-100 | Roth | 3051.3 | |
| Normal goat serum | Jackson Laboratories | 005-000-121 | |
| Normal donkey serum | Jackson Laboratories | 017-000-121 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A9647 | |
| Rabbit HA-tag | Cell Signaling | C29F4 | Primary antibody, dilution 1:500 |
| Rat FLAG-tag | Novus Biologicals | NBP1-06712 | Primary antibody, dilution 1:100 |
| Mouse V5-tag:DyLight 549 | AdSerotec | 0411 | Conjugated antibody, dilution 1:200 |
| anti-rabbit AlexaFluor 488 | Invitrogen | A11034 | Secondary antibody, dilution 1:250 |
| anti-rat DyLight 647 | Jackson Laboratories | 712-605-153 | Secondary antibody, dilution 1:100 |
| Vecta Shield | Vector Laboratories | H-1000 | |
| SlowFate Gold | Invitrogen | S36937 | |
| Secure Seal Spacer | Grace Biolabs | Contact company for ordering | |
| Microscope cover glass 22 X 60 mm | Marienfeld | 101152 | |
| Microscope cover glass 22 x 22 mm | Roth | H874 | |
| Stereo Microscope, Leica MZ6 | Leica | ||
| Confocal laser scanning microscope LSM710 | Zeiss | ||
| Immersol | Zeiss | 518 F | Immersion oil for fluorescence-microscopy, halogen free |
| Immersol | Zeiss | W 2010 | Immersion fluid for water-immersion objectives, halogen free |
| R56F03-GAL4 (EG) | Bloomington Stock Center | 39157 | GAL4 driver |
| R86E01-GAL4 (ALG) | Bloomington Stock Center | 45914 | GAL4 driver |
| hspFlpPestOpt; UAS-FRT-stop-FRT-myr-smGFP-HA, UAS-FRT-stop-FRT-myr-smGFP-FLAG, UAS-FRT-stop-FRT-myr-smGFP-V5 | Bloomington Stock Center | 64085 | UAS reporter (https://bdscweb.webtest.iu.edu/stock/misc/mcfo.php) |
| Fiji (Image J) | Image analysis software | ||
| Multi Time Macro | Zeiss | Software for automated scanning |
Referências
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