Nós descrevemos o uso do laser microdissection de captura para obter amostras de populações de células distintas de regiões diferentes do cérebro para análise genética e microRNA. Esta técnica permite o estudo dos efeitos diferenciais de traumatismo crânio-encefálico em regiões específicas do cérebro de ratos.
A capacidade de isolar regiões cerebrais específicas de interesse pode ser impedida em técnicas de dissociação de tecido que não preserva sua distribuição espacial. Tais técnicas também potencialmente distorcer a análise da expressão de gene porque o processo em si pode alterar os padrões de expressão em células individuais. Aqui nós descrevemos um método de microdissection (LCM) de captura de laser para coletar seletivamente regiões específicas do cérebro afetadas por traumatismo crânio-encefálico (TCE) usando um Nissl modificado (violeta de cresilo) mancha o protocolo e a orientação de um atlas de cérebro de rato. LCM fornece acesso a regiões do cérebro em suas posições nativas e a capacidade de usar pontos anatômicos para a identificação de cada região específica. Para este fim, LCM tenha sido usado anteriormente para examinar a expressão de genes específicos de região cerebral no TBI. Este protocolo permite o exame das alterações induzidas pelo TCE em expressão de gene e microRNA em áreas distintas do cérebro dentro do mesmo animal. Os princípios do presente protocolo podem ser alterados e aplicados para uma ampla gama de estudos examinando a expressão genômica em outras doenças e/ou modelos animais.
O cérebro é extremamente complexa e heterogênea, com centenas de milhares de tipos de célula1. De fato, estudos em humanos demonstraram que em regiões como o córtex frontal, estruturais e diferenças funcionais na matéria branca e cinza são refletidas em distintas e divergentes transcriptional perfis2. Heterogeneidade do cérebro tem sido um grande obstáculo para interpretar os dados da expressão do gene e no campo da lesão cerebral. Essa ambiguidade em estudos pré-clínicos posteriormente levou a centenas de ensaios clínicos falhadas de tratamentos para lesões de cérebro3.
Nós usamos o laser captura microdissection (LCM) métodos para estudar a traumatismo crânio-encefálico (TCE)-induzido gene desregulagem no rato cérebro4, enfocando o hipocampo, uma região do cérebro que é essencial para a aprendizagem e memória5. A capacidade de captura de laser e analisar a expressão do gene em morrer e sobreviver de neurônios nos dá uma maior compreensão do papel do crescimento na expressão gênica, na determinação do resultado (sobrevivência neuronal) após TBI6. Técnicas de LCM também provaram útil para explorar os efeitos de TCE em neurônios hippocampal comparando-se8, de7 ou ratos ratos jovens e envelhecimento.
Em estudos recentes, examinamos a outras regiões do cérebro de ratos afetados negativamente pelo TBI, com foco em áreas em ratos e em pacientes humanos do TBI que estão associados com a função executiva (ou seja, o córtex frontal9) e comorbidades TBI; Estas comorbidades incluem depressão (ou seja, núcleo accumbens10) e distúrbios do ritmo circadiano (de núcleo supraquiasmático11). Em estudos anteriores, Huusko e Pitkanen12 e Drexel et al 13 usado LCM para examinar a expressão do gene no tálamo e hipotálamo. Nosso estudo baseia-se estas observações anteriores e inclui quatro outras regiões do cérebro. Para estudar as alterações moleculares específicas da região induzidas após TBI, era necessário ganhar experiência na identificação e obtenção de tipos de células nestas regiões usando um sistema de LCM. Os lasers de corte de UV e infravermelhos (IR) permitem microdissection preciso de regiões cerebrais desejado. Aqui, descrevemos como usamos este sistema LCM, guiado pelas coordenadas estereotáxicos no rato cérebro atlas14, para identificar e laser captura quatro rato regiões do cérebro que são diferencialmente afetadas pelo método de lesão cerebral experimental de fluido-percussão 4.
Para estudos moleculares dos cérebros dos mamíferos, LCM tornou-se uma técnica essencial. Este artigo demonstra que usando a combinação de lasers de corte o IR e UV no sistema LCM pode capturar alterações genômicas em qualquer região do cérebro dos mamíferos. Estas regiões incluem aqueles identificáveis com manchas de LCM-compatível convencionais, tais como cresilo violeta ou hematoxilina e eosina. A velocidade do processo de captura de laser e capacidade de realizar LCM na espessa 30 µm seções nas corrediças de membrana de caneta permite não só obter quantidades suficientes de amostras de células, mas também para isolar o RNA de amostras de LCM de uma qualidade adequada para todos os tipos de jusante análise genômica; Estas análises incluem microarrays16e PCR matrizes17PCR em tempo real quantitativa18.
Nossos dados fornecem uma lógica para estudos que utilizam tecidos de LCM. Encontramos esse miR-15b é upregulated no hipocampo e córtex (Figura 4) mas o ativador no núcleo accumbens e pode ser biologicamente relevantes para a compreensão dos efeitos diferenciais da TBI no cérebro. Um estudo anterior sugeriu que aumentos na cortical vulnerabilidade neuronal a lesões resultam de superexpressão de vários miRNAs que regulam negativamente genes pro-sobrevivência, tais como Bcl-2,19. Programas de análise de varredura alvo Bcl-2 também é regulada por miR-15b; assim, nossos dados sugerem uma explicação mecanicista por que regiões específicas do cérebro (ou seja,, FCx) podem ser seletivamente vulneráveis a TBI. É importante lembrar que a maioria dos genes são regulados por vários miRNAs e correlacionar as alterações em qualquer um miRNA para um gene específico do alvo é difícil. Além disso, estes dados indicam que certas mudanças na expressão de gene e microRNA podem ser utilizadas como biomarcadores de lesão cerebral de regiões específicas. Na verdade, estamos usando atualmente estes dados em estudos de novo como neuroprotetor compostos de drogas com propriedades antidepressivas diferencialmente podem afetar a expressão de gene e microRNA em regiões do cérebro ligadas a distúrbios neuropsiquiátricos. Uma limitação do nosso estudo é que, durante as várias etapas dos processos de preparação de slides para o LCM, integridade do RNA pode tornar-se comprometida. Este protocolo descreve as etapas necessárias para atenuar o risco de degradação do RNA. Outra limitação é o tamanho de amostra relativamente pequeno usado para cálculo estatístico. No futuro, estudos, aumentando o tamanho da amostra devem diminuir os efeitos de variações de expressão de gene e miRNA entre animais individuais.
O benefício do LCM é realizado em estudos de genômicos translacionais usando modelos animais de doença humana e tecidos doentes20,21,22,23. Sem a capacidade de capturar as populações de células específicas, os perfis transcriptional de regiões diferentes do cérebro seria uma mistura de incognoscível e indecifráveis de muitos tipos de células. Usar métodos de LCM em estudos de lesão cerebral levou a esforços atuais para delinear biomarcadores específicos do cérebro região e entender como eles se correlacionam com biomarcadores de TBI de circulação.
The authors have nothing to disclose.
Nós gostaríamos de reconhecer Elizabeth Sumner para editar este manuscrito a ajuda dela. Financiamento para este projeto foi fornecido em parte pelo The Moody Project para investigação de lesão cerebral traumática translação e RO1NS052532 para HLH.
Arcturus Laser Capture Microdissection System | Applied Biosystems (Life Technologies) | ||
Agilent 2100 Bioanalyzer | Agilent Technologies | G2939AA | |
Agilent 6000 Pico Kit | Agilent Technologies | 5067-1513 | |
Arcturus PEN Membrane Glass Slides | Applied Biosystems (Life Technologies) | LCM0522 | |
Capsure LCM caps | Applied Biosystems (Life Technologies) | LCM0211/LCM0214 | |
Cresyl Violet Acetate | Sigma-Aldrich | C5042-10G | |
Xylene (Histological grade) | Fisher Scientific | X3P-1GAL | |
Ethanol 200 proof (Histological grade) | UTMB Pharmacy | ||
RNAqueous Micro- Kit | Life Technologies (Ambion) | AM1931 | |
Taqman Gene Expression Primer/Probes | Applied Biosystems (Life Technologies) | 4331182 | |
Taqman microRNA Expression Primer/Probes | Applied Biosystems (Life Technologies) | A25576 | |
Lightcycler 96 System | Roche |