我々 は遺伝子とマイクロ Rna 解析のための異なる脳の領域からの異なる細胞集団のサンプルを取得するマイクロダイゼクション キャプチャの使用について説明します。このテクニックにより、ラットの脳の特定の領域における外傷性脳損傷の影響の研究です。
興味の特定の脳の領域を分離する機能は、空間的な配分を保持しない組織脱退の技術で妨げられますことができます。プロセス自体は、個々 の細胞における発現パターンを変更できますのでこのようなテクニックも潜在的遺伝子発現解析を傾斜します。ここで染色プロトコルとラットの脳アトラスの指導変更ニッスル (クレシル バイオレット) を用いた外傷性脳損傷 (TBI) によって影響を受ける特定の脳部位を選択的に収集するレーザー キャプチャ レーザーマイクロダイ セクション (LCM) 手法について述べる。LCM では、ネイティブの位置と解剖学的ランドマークを使用して、それぞれの領域を識別するために能力の脳領域へのアクセスを提供します。このため、LCM は、TBI の脳領域特異的遺伝子発現を調べる以前使用されています。このプロトコルでは、同じ動物内の異なる脳領域における遺伝子とマイクロ Rna 発現の TBI 変化の検討ができます。この議定書の原則を改正し、他の病気および/または動物モデルにおけるゲノム発現を調べる研究の広い範囲に適用できます。
哺乳類の脳は非常に複雑な異種細胞のタイプ1の何千もの何百もの。確かに、人間研究を示しているが、前頭葉などの地域で構造の白と灰色で機能の違いがはっきりと発散の転写プロファイル2で反映されます。脳の多様性は、遺伝子発現データを解釈するための主要な障害をされているおよび脳損傷のフィールド。前臨床試験においてこのあいまいさは脳損傷3の治療の失敗の臨床試験の何百もをその後もたらした。
我々 は外傷性脳損傷 (TBI) を勉強するレーザー キャプチャ レーザーマイクロダイ セクション (LCM) 方法を使用-ラット脳で4海馬、記憶・学習の5に不可欠な脳の領域に焦点を当てて遺伝子調節不全を誘発します。キャプチャをレーザーし、両方死ぬと神経細胞生存遺伝子発現を解析する能力は私たちに TBI6後結果 (ニューロン生存) を決定する遺伝子発現の確率の役割のより深い理解を与えます。LCM テクニックも若くて老化マウス7またはラット8を比較するとき、海馬ニューロンの TBI の効果を調査するのに役立ちます証明しています。
ラットと人間の TBI 患者エグゼクティブ関数 (すなわち前頭皮質9) と TBI 併存疾患; に関連付けられている地域を中心に、TBI によって悪影響を受けるラット脳の他の地域を調べた最近の研究でこれらの合併症は、うつ病 (すなわち核側坐10) と概日リズム障害 (視交叉上核11) に含まれます。前の調査、Huusko と Pitkanen12 Drexelら13は、視床と視床下部の遺伝子発現を調べるため、LCM を使用しました。我々 の研究に基づいて、これらの事前の観測とその他の 4 つの脳領域が含まれています。TBI 後誘導地域固有の分子レベルの変化を勉強するには、識別と LCM システムを使用してこれらの領域のセルの取得の専門知識を得るために必要だった。紫外線カット、赤外線 (IR) レーザーは、必要な脳の領域の正確な顕微解剖を許可します。ここでは、識別し、実験流体パーカッション脳損傷による特異的影響を受けるキャプチャ 4 ラット脳領域をレーザーに14ラットの脳アトラスの定位座標に導かれるこの LCM システムの使い方について述べる4。
哺乳類の脳の分子研究は、LCM 必須の技術となっています。この記事は、LCM システムで IR と UV カット レーザーの組み合わせを使用して哺乳類の脳のあらゆる領域のゲノム変化をキャプチャすることができますを示しています。これらの地域を含むクレシル バイオレットまたはヘマトキシリンとエオシン等の従来の LCM と互換性のある汚れを特定。速度のレーザー ・ キャプチャ ・ プロセスおよびペン膜スライドの厚み 30 μ m セクションに LCM を実行する機能できますが、また、下流のすべてのタイプの適切な品質の LCM 試料からの RNA を隔離するだけでなく細胞サンプルの十分な量を得るゲノム解析;これらの分析は、マイクロ アレイ16、PCR アレイ17、定量的リアルタイム PCR18 をなど。
我々 のデータは、LCM 組織を利用した研究の根拠を提供します。我々 を見つけるそのミール 15 b は海馬と皮質 (図 4) で亢進側坐核でダウンレギュ レートと生物学的脳で TBI の差動効果の理解に関連します。以前の研究は、傷害に皮質神経の脆弱性の増加が否定的 Bcl 219などの生存遺伝子を調整するいくつかの Mirna の発現に起因を提案しました。ターゲット スキャン解析では、Bcl 2 ミール-15 b; によって規制されています従って、私達のデータ提案理由は機械論的説明、脳の特定の領域(すなわち、FCx) TBI に選択的に受けることがあります。ほとんどの遺伝子が複数の miRNAs によって規制されているし、特定のターゲット遺伝子に任意の 1 つの miRNA の変更を関連付けることは困難を覚えていることが重要です。また、これらのデータは、遺伝子とマイクロ Rna 発現の特定の変化が地域固有の脳損傷のマーカーとして使用されることを示します。確かに、我々 が現在使用してこれらのデータ研究にどのように新しい神経保護作用の抗うつ薬のプロパティを持つ薬剤化合物は特異的精神神経疾患にリンクされている脳領域における遺伝子とマイクロ Rna 発現を影響します。我々 の研究の 1 つの制限は、LCM のスライドの準備プロセスの複数のステップの間に RNA の整合性が損なわになる可能性があります。このプロトコルでは、RNA の劣化のリスクを軽減するために必要な手順について説明します。別の制限は、統計の計算に使用される比較的小さなサンプル サイズです。将来的に研究、サンプル サイズの増加は、個々 の動物の間で遺伝子および miRNA 発現の変異の影響を軽減する必要があります。
LCM の便益は、人間の病気や病変組織20,21,22,23のモデル動物を用いた並進のゲノム研究で実現されます。特定の細胞集団をキャプチャする機能、異なる脳の領域の転写プロファイルなければ多くの細胞タイプの不可知と解読のミックスです。脳損傷研究の LCM メソッドを使用すると、脳領域特定バイオ マーカーの線引きし、TBI の血漿中バイオ マーカーとの関連性を理解する、現在の取り組みにつながっています。
The authors have nothing to disclose.
我々 は彼女の助けのこの原稿を編集エリザベス サムナーを認識したいと思います。このプロジェクトのための資金によって提供された一部ムーディーズ プロジェクト並進外傷性脳傷害研究と RO1NS052532 の。
Arcturus Laser Capture Microdissection System | Applied Biosystems (Life Technologies) | ||
Agilent 2100 Bioanalyzer | Agilent Technologies | G2939AA | |
Agilent 6000 Pico Kit | Agilent Technologies | 5067-1513 | |
Arcturus PEN Membrane Glass Slides | Applied Biosystems (Life Technologies) | LCM0522 | |
Capsure LCM caps | Applied Biosystems (Life Technologies) | LCM0211/LCM0214 | |
Cresyl Violet Acetate | Sigma-Aldrich | C5042-10G | |
Xylene (Histological grade) | Fisher Scientific | X3P-1GAL | |
Ethanol 200 proof (Histological grade) | UTMB Pharmacy | ||
RNAqueous Micro- Kit | Life Technologies (Ambion) | AM1931 | |
Taqman Gene Expression Primer/Probes | Applied Biosystems (Life Technologies) | 4331182 | |
Taqman microRNA Expression Primer/Probes | Applied Biosystems (Life Technologies) | A25576 | |
Lightcycler 96 System | Roche |