その場でMHC テトラマー染色と場所、豊富と組織における抗原特異的 cd8 陽性 T 細胞の表現型を決定するための定量解析
Summary
ここでは、免疫組織化学的局在、表現型、組織における抗原特異的 T 細胞の量を決定するとその場でMHC テトラマー染色を組み合わせた手法について述べる。このプロトコルは、他のセルの種類および組織の構造を基準にして抗原特異的 CD8 T 細胞の表現型特性を決定する使用です。
Abstract
T 細胞の検出やウイルス感染細胞を排除すること、自己免疫疾患を防止する抗体と検出し、がん細胞を排除する B 細胞や形質細胞の生産の支援など、多くの免疫学的プロセスに重要です。フローサイトメトリーで分析した抗原特異的 T 細胞の MHC テトラマー染色の開発研究し、T 細胞の免疫生物学を理解する当社の能力をもたらしました。フローサイトメトリーは、抗原特異的 T 細胞を他の細胞や組織、および現在の分解技術の構造の空間定位を判断できない量と抗原特異的 T 細胞の表現型を決定する非常に便利ですが、T を抽出するセル必要とフローサイトメトリー限られている非リンパ系組織の有効性。その場でMHC テトラマー染色 (IST) は、組織の興味の抗原のために特定が T 細胞を可視化する手法です。免疫組織染色 (IHC) と組み合わせて、IST は、豊かさ、場所、および組織における抗原特異的 CD8 と CD4 T 細胞の表現型を決定できます。ここでは、染色し、特定の組織のコンパートメント内にある特定の表現型を持つ抗原特異的 CD8 T 細胞を列挙するプロトコルについて述べる.これらの手順は、李ら、権利によって我々 の最近の出版物で使用した同じ「卵胞は CD8 によって抑制されます部分的にサル免疫不全ウイルス産生細胞細胞の+ In Vivo。」説明する方法は、彼らは、表現型のローカライズに使用することができ、本質的に、抗原特異的 CD8 T 細胞 MHC テトラマーは任意の組織で利用可能なを定量化に広範に適用されます。
Introduction
T 細胞の検出やウイルス感染細胞を排除すること、自己免疫疾患を防止する抗体と検出し、がん細胞を排除する B 細胞や形質細胞の生産の支援など、多くの免疫学的プロセスに重要です。ペプチド/MHC のクラス I のテトラマー CD8 T 細胞の抗原特異的染色1と MHC クラス II 四量体染色の CD4 T 細胞2のフローサイトメトリーによる最近の開発研究し、理解する当社の能力に革命をもたらしました、T 細胞の免疫生物学。量と抗原特異的 T 細胞の表現型を決定する非常に便利ですが、他の細胞や組織、現在構造に抗原特異的 T 細胞の空間定位の検出でフローサイトメトリーは、します。T 細胞を抽出する分解テクニック必要フローサイトメトリー限られている非リンパ系組織3で有効性。
私たちと他の人は私とクラス II 四量体や多量体試薬ペプチド負荷 MHC のクラスを使用して組織4,5,6,7,抗原特異的 CD8 および CD4 T 細胞を染色する方法を開発しました。8,9,10,11,12,13。 これら IST メソッドの場所、豊富、と組織における抗原特異的 CD8 と CD4 T 細胞の表現型の定量を可能にすると、他の細胞や組織の構造を基準にしてこれらの細胞を検出する手段を提供します。当社グループは、広く MHC を使用います-私四量体でひと免疫不全ウイルス (HIV) – とサル免疫不全ウイルス (SIV) – 染色 HIV と SIV の免疫病態の理解を得るためにリンパ、生殖器、直腸の組織における特定の CD8 T 細胞成功した予防接種戦略14,15,16,17の関連要因を識別します。さらに、組織と生体内でエフェクタ-ターゲット レベルを決定する我々 はもイストを組み合わせたものの in situハイブリダイゼーション (っぽい) をローカライズし、ウイルス特異的 cd8 陽性 T 細胞、ウイルス感染細胞を定量化する技術を開発しました。18,19。
ここでは、用いたペプチド負荷プロトコルについて述べる-私テトラマー IHC を使用して対比染色組織に新鮮な組織切片の抗原特異的 CD8 T 細胞を染色して特定の組織コンパートメントにおける特定の表現型と細胞を定量化します。これらの手順は、李ら、慢性 SIV 感染サル20時、場所、豊富とリンパ組織における SIV 特異的 T 細胞の表現型を決定私たちによる私たちの最近の出版物で使用されたと同じです。
この手順では、新鮮な組織を断面し、ペプチド負荷 MHC で夜通し孵化-私テトラマー共役フルオレセイン チオシアン酸分子 (FITC)。彼らは、パラホルムアルデヒドで固定されます。組織を固定した後は、ウサギ抗 FITC 抗体を使用し、さらにバインドされたテトラマーからの信号を増幅、蛍光タグの抗うさぎ IgG 抗体とインキュベート MHC テトラマーからの信号は増幅されます。IHC は、抗原特異的 T 細胞と周囲の細胞を特徴付ける IST と組み合わせて使用です。細胞外空間、細胞表面上のエピトープを認識する抗体は、テトラマーとプライマリの孵化に含まれます。細胞エピトープを認識する抗体染色前に細胞壁の透過性が必要です。染色組織切片を共焦点顕微鏡を用いたイメージングが行い共焦点ソフトウェアを使用しています。ラベル付きセルは、共焦点顕微鏡によるソフトウェアや ImageJ を用いた定量化しました。どの MHC の本質的に抗原特異的 CD8 T の任意のセルの任意の組織を染色する記述のプロトコルを使用できます-私テトラマーがあります。
Protocol
Representative Results
Discussion
IHC と組み合わせて IST は、検出、特性評価、および他の細胞や組織構造のコンテキストでネイティブ環境での抗原特異的 CD8 T 細胞の定量化のために不可欠なツールを提供します。ここでは、イストの IHC、定量的画像解析に続いての場所、豊富とアカゲザルからリンパ節における抗原特異的 CD8 T 細胞の表現型を決定するために結合用の詳細な手順を説明します。ヒトに応用マウス、またはど?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この作業によって支えられた公衆衛生サービスを健康の国民の協会 (T32 DA007097、R01AI096966、andUM1AI26617) から付与します。
Materials
| MHC-I monomer | NIH tetramer core facility | Materials for MHC-tetramer preparation | |
| ExtrAvidin-FITC | Sigma-Aldrich | E2716 | Materials for MHC-tetramer preparation |
| Normal goat serum | Jackson Immunoresearch | 005-000-121 | |
| Low melt agarose | Promega | V3121 | |
| Heparin | Sigma-Aldrich | SLBL6391V | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T-6878 | |
| Urea | J.T.Baker | 4204-05 | |
| Glycerol/gelatin | Sigma-Aldrich | SLBH2672V | |
| n-propyl gallate | Sigma-Aldrich | P3130 | |
| rat-a-h-CD8 (1:500) | Acris | 0714 | Antibody unstable, use single use frozen aliquot |
| m-a-h-CD20 (1:500) | NOVOCASTRA | 6026819 | |
| m-a-h-Ki67 (1:500) | Vector | 6022201 | |
| goat-a-m-A488 (1:2000) | Jackson Immunoresearch | 124083 | |
| goat-a-rb-Cy3 (1:5000) | Jackson Immunoresearch | 106232 | |
| goat-a-rat-Cy5 (1:5000) | Jackson Immunoresearch | 118088 | |
| goat-a-h-IgM-Dylight649 (1:5000) | Jackson Immunoresearch | 86579 | |
| Compresstome: VF-300 Microtome | Precisionary Instruments, LLC | 1079 | |
| Quick Set Instant Adhesive | Loctite | 46551 | |
| 24-well flat bottomed tissue culture plates | Falcon | 353226 | |
| Microscope slide | Globe scienfitic Inc. | #1321 | |
| Razor blade | Ted Pella, Inc | 121-6 | |
| Feather Disposable Scalpel | FEATHER SAFETY RAZOR CO. LTD. | No. 21 | |
| Round paintbrush #2 | PRINCETON ART & BRUSH CO. | 4350R | Can trim as needed with razor |
| Confocal Microscope | Olympus | FV1000 | |
| FV10-ASW_Viewer4.0 | Olympus |
Referências
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