Utilización de cápsulas para la tinción negativa de muestras víricas en biocontención
Summary
Este protocolo proporciona instrucciones para muestras de virus de tinción negativas que pueden usarse fácilmente en laboratorios BSL-2, -3 o -4. Incluye el uso de una cápsula de procesamiento innovadora que protege la rejilla de microscopía electrónica de transmisión y proporciona al usuario un manejo más fácil en los ambientes más turbulentos dentro de la biocontención.
Abstract
La microscopía electrónica de transmisión (TEM) se utiliza para observar la ultraestructura de virus y otros patógenos microbianos con resolución nanométrica. La mayoría de los materiales biológicos no contienen elementos densos capaces de dispersar electrones para crear una imagen; Por lo tanto, se requiere una tinción negativa, que coloca sales densas de metales pesados alrededor de la muestra. Con el fin de visualizar los virus en suspensión bajo el TEM que deben aplicarse a las pequeñas rejillas cubiertas con una superficie transparente sólo nanómetros de espesor. Debido a su pequeño tamaño y fragilidad, estas rejillas son difíciles de manejar y se mueven fácilmente por las corrientes de aire. La superficie delgada se daña fácilmente, dejando la muestra difícil o imposible de imagen. Los virus infecciosos deben ser manejados en un gabinete de bioseguridad (BSC) y algunos requieren un ambiente de laboratorio de biocontención. Tinción de virus en los niveles de bioseguridad (BSL) -3 y -4 es especialmente difícil debido a que estos entornos son más turbulentos y los técnicos se requieren tO use equipo de protección personal (PPE), lo que disminuye la destreza.
En este estudio, se evaluó un nuevo dispositivo para ayudar a la tinción negativa de virus en biocontención. El dispositivo es una cápsula que funciona como una punta de pipeta especializada. Una vez que las rejillas se cargan en la cápsula, el usuario simplemente aspira los reactivos en la cápsula para entregar el virus y las manchas a la rejilla encapsulada, eliminando así el manejo del usuario de las rejillas. Aunque esta técnica fue diseñada específicamente para su uso en el biocontenimiento BSL-3 o -4, puede facilitar la preparación de la muestra en cualquier ambiente de laboratorio permitiendo una fácil tinción negativa del virus. Este mismo método también se puede aplicar para preparar especímenes TEM negativos teñidos de nanopartículas, macromoléculas y especímenes similares.
Introduction
La microscopía electrónica de transmisión (TEM) es una herramienta eficaz para visualizar la morfología y la ultraestructura de especímenes biológicos que son demasiado pequeños para ser vistos con un microscopio de luz tradicional 1 , 2 , 3 , 4 . TEMs disparar electrones a través de una muestra muy delgada que produce una imagen de mayor resolución como electrones tienen una longitud de onda mucho más corto que la luz. Las regiones de la muestra que doblan o bloquean electrones aparecen oscuras, mientras que las regiones que son electrón lucent aparecen en blanco.
La falta de materia densa de electrones hace que los virus sean difíciles de ver bajo un TEM porque no pueden dispersar electrones. La tinción negativa es el método más común utilizado para crear contraste y ver los virus con un TEM. El primer procedimiento de tinción negativa fue propuesto por Brenner y Horne en 1959, basado en un experimento donde Hall (1955) y Huxley (1957) observaronLa aparición de estructuras biológicas en contraste inverso cuando se sumerge en una sustancia densa en electrones 5 . El proceso de tinción negativa ha permanecido prácticamente sin cambios durante el último medio siglo. La tinción negativa consiste en aplicar brevemente una solución de sal de metales pesados a una muestra en una rejilla TEM en un intento de rodear al virus con material denso sin infiltrarse en el virus 6 . Esto crea un borde oscuro y revela la forma de la partícula 5 . Este estudio utiliza dos reactivos para tinción negativa, acetato de uranilo (UA) y ácido fosfotúngstico de potasio (PTA). Ambas manchas se utilizan comúnmente para manchar negativamente pequeñas muestras biológicas, tales como virus, complejos de proteínas, y nanopartículas [ 7 , 8 , 9] .
La técnica de tinción negativa convencional es la tecnología de tinción negativa manual de gotitasNique 7 . Este método requiere el manejo preciso de pequeñas y frágiles rejillas TEM con pinzas para aplicar pequeñas cantidades de muestras de virus, manchas y enjuagues. El protocolo de preparación típico implica la aplicación de una gotita de suspensión de muestra sobre la superficie de una rejilla TEM revestida con película ( Figura 1A ). Después de la unión de la muestra a la superficie de la película, la rejilla se enjuaga para eliminar los virus no adherentes y se tiñe con UA o PTA durante unos segundos a un minuto, dependiendo del tipo de muestra. El exceso de líquido es malo lejos de la rejilla tocando un pedazo de papel de filtro al borde de la rejilla.
El método de gota manual requiere que cada rejilla se haga individualmente. Si no se manejan con cuidado, las rejillas TEM revestidas se perforan fácilmente, se doblan o se contaminan. El procesamiento de muestras múltiples puede conducir a dificultades en el seguimiento de las rejillas y asegurar una tinción consistente para cada muestra. Este procedimiento de tinción manual es mucho másSi se realizan en laboratorios de nivel de bioseguridad (BSL) -3 y -4 biocontenedores, debido al equipo de protección personal (EPP) requerido para estos ambientes. El PPE es engorroso y el ambiente de biocontención es mucho más turbulento en comparación con un laboratorio regular. El personal que trabaja en los laboratorios de biocontención BSL-3 debe llevar 2 pares de guantes y trabajar en un gabinete de bioseguridad (BSC). Esta doble capa de guantes reduce la sensibilidad táctil y restringe el movimiento del motor fino. El flujo de aire de la BSC que protege al usuario y ayuda a prevenir la contaminación de la muestra puede hacer que las muestras y las manchas se sequen demasiado rápido afectando así a la calidad de las manchas. El fuerte flujo de aire turbulento en el BSC también puede eliminar rápidamente una rejilla que no está bien asegurada. En los laboratorios de biocontención BSL-4, existen requisitos de seguridad adicionales. Se requiere que el personal use un traje de presión positiva, lo que restringe aún más el movimiento físico y la capacidad de ver y manipular claramenteLas rejillas. El técnico que trabaja en BSL-4 también lleva por lo menos 2 pares de guantes, siendo el par externo un guante grueso que reduce en gran medida la destreza y la sensación táctil. Finalmente, los fórceps utilizados para manejar las rejillas TEM son agudos, lo que supone un riesgo para el técnico debido a su capacidad para perforar los guantes. Con las cápsulas que contienen rejillas, no es necesario pinzas, lo que proporciona una alternativa segura, sin fórceps para manipular las rejillas en biocontención. Finalmente, las cápsulas también proporcionan una manera eficaz de almacenar rejillas durante el procesamiento, la descontaminación del vapor de osmio y durante el almacenamiento; Manteniendo así las rejillas organizadas y protegidas contra daños.
En este informe, se introduce un nuevo método para la tinción negativa TEM grids en los laboratorios de biocontención que utiliza mPrep / g cápsulas, un dispositivo a base de cápsulas para el manejo de la red y la tinción 10 , 11 , 12 . La cápsula acompañaModula dos rejillas TEM, minimiza el manejo directo y reduce el potencial de daño en la red. La cápsula se fija directamente a una pipeta de una o varias canales de la misma manera que una punta de pipeta, permitiendo la aplicación de varios líquidos a las rejillas contenidas dentro. Esto permite la preparación simultánea de muestras múltiples con cuadrículas duplicadas ( Figura 1B ). Para la tinción negativa con cápsulas, la muestra de virus se aspira en la cápsula y se mantiene durante 10 minutos para dejar que los virus se adsorben sobre las superficies de la rejilla. Las redes con virus adsorbido se lavan posteriormente con agua desionizada (dI) y se tiñen con UA o PTA durante unos segundos a 1 min. Este proceso utiliza los mismos pasos y reactivos del protocolo que el método manual de gotas; La diferencia es que todo el trabajo se produce dentro de la cápsula sin manipulación física de las rejillas. ( Figuras 1C , 1D ).
El propósito de este estudio fue evaluar las cápsulas comoUn nuevo método para la tinción negativa de muestras de virus en ambientes de biocontención. Este estudio también examinó la calidad de las imágenes TEM producidas a partir de dos procedimientos diferentes de inactivación viral: 1) inactivación rápida, con 1% de vapor de tetróxido de osmio, y 2) inactivación de 24 horas con 2% de glutaraldehído. Ambos se llevaron a cabo utilizando las cápsulas. Finalmente, evaluamos dos manchas negativas comúnmente usadas, UA y PTA, para uso en la cápsula. 13
Protocol
Representative Results
Discussion
La tinción negativa es una valiosa técnica TEM para evaluar y calibrar virus, complejos proteicos y nanopartículas. La preparación de gotitas de estos especímenes mediante el movimiento manual de las rejillas desde el reactivo a las manchas negativas ha sido el protocolo clásico durante más de medio siglo. Es un proceso simple, pero requiere conocimientos adquiridos a través de la capacitación para su finalización con éxito. La excelente tinción negativa todavía se considera un conjunto de habilidades de ú…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Quisiéramos agradecer al Dr. John Carra y Rowena Schokman por proporcionar Nano-VLP puros de Ebola, al Dr. Rajini Mudhasani por proveer el virus Chikungunya, y al Dr. Charles (Jason) Shoemaker por proveer Leucemia Murina VLPs que expresan glicoproteínas de Ebolavirus. También queremos agradecer a MAJ Carl Soffler por facilitar el Programa de Prácticas de Verano (SIP) y el Programa de Aprendizaje de Ciencia e Ingeniería (SEAP) y la Dra. Catherine Wilhelmsen para el entrenamiento de seguridad en el laboratorio.
Materials
| Formvar/carbon coated TEM grids | SPI | 3420C-MB | 200 mesh Cu Pk/100 |
| mPrep/g capsules | EMS | 85010-01 | box |
| mPrep/g couplers | EMS | 85010-11 | standard 16/Pk |
| glutaraldehdyde | EMS | 16320 | 50% solution, EM grade |
| Osmium Tetroxide | EMS | 19190 | 4% aqueous solution |
| Uranyl Acetate | EMS | 22400 | powder |
| Potassium phosphotungstic acid | EMS | 19500 | powder |
| filter paper | Whatman | 1450-090 | size 50 |
| Tranmission Electron Microscope | JEOL | JEM-1011 | TEM |
Referências
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