Verwendung von Kapseln zur Negativfärbung von Virusproben im Biocontainment
Summary
Dieses Protokoll liefert eine Anleitung für Negativfärbevirusproben, die leicht in BSL-2-, -3- oder -4-Laboratorien verwendet werden können. Es beinhaltet die Verwendung einer innovativen Verarbeitungskapsel, die das Transmissionselektronenmikroskopie-Gitter schützt und dem Anwender eine leichtere Handhabung in den turbulenteren Umgebungen im Biokontainment ermöglicht.
Abstract
Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) dient zur Beobachtung der Ultrastruktur von Viren und anderen mikrobiellen Pathogenen mit Nanometerauflösung. Die meisten biologischen Materialien enthalten keine dichten Elemente, die in der Lage sind, Elektronen zu streuen, um ein Bild zu erzeugen; Daher ist ein negativer Fleck, der dichte Schwermetallsalze um die Probe platziert, erforderlich. Um Viren in Suspension unter dem TEM zu visualisieren, müssen sie auf kleine Gitter aufgetragen werden, die mit einer transparenten Oberfläche beschichtet sind, die nur Nanometer dick ist. Aufgrund ihrer geringen Größe und ihrer Zerbrechlichkeit sind diese Gitter schwer zu handhaben und leicht durch Luftströme zu bewegen. Die dünne Oberfläche wird leicht beschädigt, so dass die Probe schwierig oder unmöglich abbilden kann. Infektionsviren müssen in einem Biosicherheitsschrank (BSC) behandelt werden, und einige erfordern eine Biocontainment-Laborumgebung. Die Färbung von Viren in Biosicherheitsstufen (BSL) -3 und -4 ist besonders anspruchsvoll, da diese Umgebungen turbulenter sind und Techniker erforderlich sindO trage persönliche Schutzausrüstung (PSA), die Geschicklichkeit verringert.
In dieser Studie haben wir ein neues Gerät zur Unterstützung von negativen Färbeviren im Biokontainment evaluiert. Das Gerät ist eine Kapsel, die als spezialisierte Pipettenspitze arbeitet. Sobald die Gitter in die Kapsel geladen sind, saugt der Benutzer Reagenzien einfach in die Kapsel, um das Virus und die Flecken an das verkapselte Gitter zu liefern, wodurch die Handhabung von Gittern eliminiert wird. Obwohl diese Technik speziell für die Verwendung in BSL-3 oder -4 Biocontainment entwickelt wurde, kann sie die Probenvorbereitung in jeder Laborumgebung erleichtern, indem sie eine leichte Negativfärbung des Virus ermöglicht. Dieselbe Methode kann auch angewendet werden, um negativ gefärbte TEM-Proben von Nanopartikeln, Makromolekülen und ähnlichen Proben herzustellen.
Introduction
Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) ist ein effektives Werkzeug für die Betrachtung der Morphologie und der Ultrastruktur von biologischen Proben, die zu klein sind, um mit einem herkömmlichen Lichtmikroskop 1 , 2 , 3 , 4 zu sehen . TEMs schießen Elektronen durch eine sehr dünne Probe, die ein Bild mit höherer Auflösung erzeugt, da Elektronen eine viel kürzere Wellenlänge als Licht haben. Regionen der Probe, die Elektronen biegen oder blockieren, erscheinen dunkel, während Regionen, die elektronen licht sind, weiß erscheinen.
Mangel an Elektronen dichten Materie macht Viren schwer zu sehen unter einem TEM, weil sie nicht streuen können Elektronen. Negative Färbung ist die häufigste Methode, die verwendet wird, um Kontrast zu erzeugen und Viren mit einem TEM zu betrachten. Das erste Negativfärbeverfahren wurde von Brenner und Horne im Jahre 1959 vorgeschlagen, basierend auf einem Experiment, bei dem Hall (1955) und Huxley (1957) Beobachter warenVed das Auftreten von biologischen Strukturen im umgekehrten Kontrast beim Eintauchen in eine elektronendichte Substanz 5 . Der Prozess der negativen Färbung ist in der letzten Hälfte des Jahrhunderts nahezu unverändert gewesen. Negative Färbung beinhaltet das kurzzeitige Aufbringen einer Schwermetallsalzlösung auf eine Probe auf einem TEM-Gitter in einem Versuch, das Virus mit dichten Materialien zu umgeben, ohne das Virus 6 zu infiltrieren. Dies schafft eine dunkle Grenze und zeigt die Partikelform 5 . Diese Studie verwendet zwei Reagenzien für Negativfärbung, Uranylacetat (UA) und Kaliumphosphowolframsäure (PTA). Beide dieser Flecken werden gewöhnlich verwendet, um kleine biologische Proben, wie Viren, Proteinkomplexe und Nanopartikel 7 , 8 , 9 , negativ zu färben.
Die herkömmliche Negativ-Färbetechnik ist die manuelle Tröpfchen-Negativ-FärbungstechnologieNique 7 Diese Methode erfordert eine präzise Handhabung von kleinen, zerbrechlichen TEM-Gittern mit einer Pinzette, um kleine Mengen an Virusproben, Flecken und Spülungen aufzutragen. Das typische Herstellungsprotokoll beinhaltet das Aufbringen eines Tröpfchens der Probensuspension auf die Oberfläche eines mit einem Film beschichteten TEM-Gitters ( 1A ). Nach dem Anbringen der Probe an die Filmoberfläche wird das Gitter gespült, um nicht-adhärente Viren zu entfernen und mit UA oder PTA für einige Sekunden bis zu einer Minute gefärbt zu werden, abhängig von der Art der Probe. Überschüssige Flüssigkeit wird vom Gitter weggerissen, indem man ein Stück Filterpapier an den Rand des Gitters berührt.
Die manuelle Tröpfchenmethode erfordert, dass jedes Raster individuell hergestellt wird. Wenn nicht sorgfältig behandelt, werden beschichtete TEM-Gitter leicht durchbohrt, gebogen oder verunreinigt. Die Verarbeitung mehrerer Proben kann zu Schwierigkeiten bei der Verfolgung der Gitter führen und eine gleichmäßige Färbung für jede Probe gewährleisten. Diese manuelle Färbung ist viel mehr dWenn es in den Biosicherheitsstufen (BSL) -3 und -4 Biocontainmentlaboratorien aufgrund der für diese Umgebungen erforderlichen persönlichen Schutzausrüstung (PSA) fällig ist. PPE ist umständlich und die Biocontainment-Umgebung ist viel turbulenter im Vergleich zu einem regelmäßigen Labor. Das Personal, das in BSL-3 Biokontainmentlaboratorien arbeitet, muss 2 Paar Handschuhe tragen und in einem Biosicherheitsschrank (BSC) arbeiten. Diese doppelte Handschuhschicht reduziert die taktile Empfindlichkeit und beschränkt die Feinmotorik. Der Luftstrom des BSC, der den Benutzer schützt und hilft, die Kontamination der Proben zu verhindern, kann dazu führen, dass die Proben und Flecken zu schnell trocknen und so die Fleckenqualität beeinträchtigen. Der starke turbulente Luftstrom im BSC kann auch schnell ein Gitter wegblasen, das nicht gut gesichert ist. In BSL-4 Biocontainment-Labors gibt es zusätzliche Sicherheitsanforderungen. Das Personal muss einen positiven Druckanzug tragen, der die physische Bewegung und die Fähigkeit, deutlich zu sehen und zu manipieren, weiter einschränktGitter wässern. Der Techniker, der in BSL-4 arbeitet, trägt auch mindestens 2 Paar Handschuhe, wobei das äußere Paar ein dicker Handschuh ist, der die Geschicklichkeit und die taktile Empfindung stark reduziert. Schließlich ist die Pinzette, die verwendet wird, um TEM-Gitter zu handhaben, scharf, wodurch ein Risiko für den Techniker aufgrund ihrer Fähigkeit, Pünktchen Handschuhe. Bei Kapseln, die Gitter enthalten, sind keine Pinzetten notwendig, so dass eine sichere, zangenfreie Alternative zur Manipulation von Gittern in Biokontainmenten geschaffen wird. Schließlich bieten die Kapseln auch einen wirksamen Weg, um Gitter während der Verarbeitung, Osmiumdampf-Dekontamination und während der Lagerung zu speichern; Wodurch die Gitter organisiert und vor Schäden geschützt sind.
In diesem Bericht stellen wir eine neue Methode zur Negativfärbung von TEM-Gittern in Biokontainmentlaboratorien vor, die mPrep / g-Kapseln, eine kapselbasierte Vorrichtung zur Netzhandhabung und Färbung 10 , 11 , 12, einsetzt . Die KapselModifiziert zwei TEM-Gitter, minimiert die direkte Handhabung und reduziert das Potenzial für Netzschäden. Die Kapsel haftet direkt an einer Einzel- oder Mehrkanalpipette in der gleichen Weise wie eine Pipettenspitze, so dass die Anwendung von verschiedenen Flüssigkeiten auf Gitter, die darin enthalten sind. Dies ermöglicht die gleichzeitige Vorbereitung mehrerer Proben mit doppelten Gittern ( Abbildung 1B ). Zu negativen Flecken mit Kapseln wird die Virusprobe in die Kapsel angesaugt und für 10 min gehalten, um die Viren auf die Gitteroberflächen adsorbieren zu lassen. Die Gitter mit adsorbiertem Virus werden anschließend mit deionisiertem (dI) Wasser gewaschen und mit UA oder PTA für einige Sekunden bis 1 min gefärbt. Dieses Verfahren verwendet dieselben Protokollschritte und Reagenzien wie die manuelle Tröpfchenmethode; Der Unterschied ist, dass alle Arbeiten innerhalb der Kapsel ohne physische Handhabung der Gitter auftreten. ( Fig. 1C , 1D ).
Der Zweck dieser Studie war es, Kapseln als zu bewertenEine neue Methode zur Negativfärbung von Virusproben in Biokontainmentumgebungen. Diese Studie untersuchte auch die Qualität von TEM-Bildern, die aus zwei verschiedenen Virusinaktivierungsverfahren hergestellt wurden: 1) schnelle Inaktivierung mit 1% Osmiumtetroxiddampf und 2) einer 24 h Inaktivierung mit 2% Glutaraldehyd. Beide wurden unter Verwendung der Kapseln durchgeführt. Schließlich haben wir zwei häufig verwendete Negativflecken, UA und PTA, zur Verwendung in der Kapsel ausgewertet. 13
Protocol
Representative Results
Discussion
Negative Färbung ist eine wertvolle TEM-Technik zur Bewertung und Größenbestimmung von Viren, Proteinkomplexen und Nanopartikeln. Die Tröpfchenpräparation dieser Proben durch manuelles Bewegen von Gittern von Reagenz zu negativen Flecken ist seit mehr als einem halben Jahrhundert das klassische Protokoll. Es ist ein einfacher Prozess, aber erfordert Know-how durch Training für den erfolgreichen Abschluss gewonnen. Ausgezeichnete Negativfärbung gilt nach wie vor als hochmoderne Kompetenz und ist in vielen TEM-Labo…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken Dr. John Carra und Rowena Schokman für die Bereitstellung gereinigter Ebola Nano-VLPs, Dr. Rajini Mudhasani für die Bereitstellung von Chikungunya Virus und Dr. Charles (Jason) Schuhmacher für die Bereitstellung von Murine Leukämie VLPs, die Ebolavirus Glykoproteine exprimieren. Wir möchten uns auch bei MAJ Carl Soffler für die Erleichterung des Summer Praktikumsprogramms (SIP) und des Science and Engineering Apprenticeship Program (SEAP) und Dr. Catherine Wilhelmsen für die Laborsicherheitstraining bedanken.
Materials
| Formvar/carbon coated TEM grids | SPI | 3420C-MB | 200 mesh Cu Pk/100 |
| mPrep/g capsules | EMS | 85010-01 | box |
| mPrep/g couplers | EMS | 85010-11 | standard 16/Pk |
| glutaraldehdyde | EMS | 16320 | 50% solution, EM grade |
| Osmium Tetroxide | EMS | 19190 | 4% aqueous solution |
| Uranyl Acetate | EMS | 22400 | powder |
| Potassium phosphotungstic acid | EMS | 19500 | powder |
| filter paper | Whatman | 1450-090 | size 50 |
| Tranmission Electron Microscope | JEOL | JEM-1011 | TEM |
Referências
- Gentile, M., Gelderblom, H. R. Electron microscopy in rapid viral diagnosis: an update. New Microbiol. 37 (4), 403-422 (2014).
- Kruger, D. H., Schneck, P., Gelderblom, H. R. Helmut Ruska and the visualisation of viruses. Lancet. 355 (9216), 1713-1717 (2000).
- Curry, A., Appleton, H., Dowsett, B. Application of transmission electron microscopy to the clinical study of viral and bacterial infections: present and future. Micron. 37 (2), 91-106 (2006).
- Goldsmith, C. S., Miller, S. E. Modern uses of electron microscopy for detection of viruses. Clin Microbiol Rev. 22 (4), 552-563 (2009).
- Kiselev, N. A., Sherman, M. B., Tsuprun, V. L. Negative staining of proteins. Electron Microsc Rev. 3 (1), 43-72 (1990).
- Brenner, S., Horne, R. W. A negative staining method for high resolution electron microscopy of viruses. Biochim Biophys Acta. 34, 103-110 (1959).
- Harris, J. R. Negative staining of thinly spread biological samples. Methods Mol Biol. 369, 107-142 (2007).
- Bradley, D. E. Ultrastructure of bacteriophage and bacteriocins. Bacteriol Rev. 31 (4), 230-314 (1967).
- Suzuki, H., et al. Effects of two negative staining methods on the Chinese atypical rotavirus. Arch Virol. 94 (3-4), 305-308 (1987).
- Benmeradi, N., Payre, B., Goodman, S. L. Easier and Safter Biological Staining: High Contrast Uranyless Staining of TEM Grids using mPrep/g Capsules. Microsc Microanal. 21, 721 (2015).
- Goodman, S. L., Wendt, K. D., Kostrna, M. S., Radi, C. Capsule-Based Processing and Handling of Electron Microscopy Specimens and Grids. Microscopy Today. 23 (5), 30-37 (2015).
- Goodman, S. L., Kostrna, M. S. Reducing Reagent Consumption and Improving Efficiency of Specimen Fixation and Embedding, Grid Staining and Archiving using mPrep Capsule Processing. Microsc Microanal. 17, 174-175 (2011).
- Monninger, M. K., et al. Preparation of viral samples within biocontainment for ultrastructural analysis: Utilization of an innovative processing capsule for negative staining. J Virol Methods. 238, 70-76 (2016).
- Rossi, C. A., et al. Evaluation of ViroCyt(R) Virus Counter for rapid filovirus quantitation. Viruses. 7 (3), 857-872 (2015).
- Carra, J. H., et al. A thermostable, chromatographically purified Ebola nano-VLP vaccine. J Transl Med. 13, 228 (2015).
- Rein, A. Murine leukemia viruses: objects and organisms. Adv Virol. , 403419 (2011).
- Barland, M., Rojkind, Negative staining with osmium tetroxide vapour. Nature. 212 (5057), 84-85 (1966).
