JoVE Journal > Developmental Biology
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Resultados
Discussion
Declarações
Acknowledgements
Materials
Referências
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Biologia do Desenvolvimento

C. elegans Excretory kanal hücre içi Lumen morfogenez ve In Vivo polarize membran Biyogenez tek bir hücrede için bir Model olarak: etiketleme GFP-füzyon, RNAi etkileşimi ekran ve görüntüleme

Published: October 03, 2017
doi:
10.3791/56101
, , , , ,
1Mucosal Immunology and Biology Research Center, Developmental Biology and Genetics Core, Massachusetts General Hospital for Children,Harvard Medical School, 2College of Life Sciences,Jilin University, 3Faculty of Health Sciences,University of Macau

Summary

C. elegans boşaltım kanalı görsel vivo içinde analiz polarize de novo membran dipnotlar için benzersiz bir tek hücreli modelidir. Bu iletişim kuralı standart genetik/RNAi ve yaklaşımlar, uyarlanabilir kimlik ve tek hücreli tubulogenesis ve apikal membran ve Lümen Biyogenez yönetmenlik molekülleri karakterizasyonu için Imaging birleşimidir açıklar.

Abstract

Dört C. elegans boşaltım Kanallar kurmak ve Lümen bir membran ve submembraneous ile stabilize etmek hemen hemen eşit kadar genişletilmiş hücre içi endotubes ile tek bir hücreden hayvan uzunluğu ile genişletilmiş dar tüpler vardır sitoiskeleti apikal karakter. Boşaltım hücre uzunluğu yaklaşık 2.000 kez bu model de novo polarize membran dipnotlar, hücre içi Lümen morfogenez vivo içinde değerlendirilmesi için benzersiz yaparak bu kanalları oluşturmak için genişler ve tek hücreli tubulogenesis. Burada sunulan iletişim kuralı standart etiketleme, kazanç ve kayıp-in-fonksiyonlu genetik ya da RNA müdahale (RNAi) birleştirmek gösterilmiştir-ve görsel olarak incelemek ve işlevsel olarak bu işlemlerin moleküler düzeyde çözümlemek için bu modeli kullanmak için mikroskobik yaklaşımlar. Etiketleme bir yaklaşım örneği protokol Transjenik hayvanlar ile floresan füzyon protein üretimi canlı tubulogenesis çözümlenmesi için özetliyor. Genetik bir yaklaşım örneği, bu işlev kazanç Kistik kanal fenotip değiştirmek için tasarlanmış bir görsel RNAi tabanlı etkileşim ekran kilit noktaları vurgular. Belirli yöntemleri açıklanan nasıl yapılır: etiket ve floresan proteinler; ifade ederek Kanallar görselleştirmek hedeflenen RNAi kütüphane oluşturmak ve kanal morfogenez moleküler analiz için eleme RNAi strateji; Kanal fenotipleri değişiklikler görsel olarak değerlendirmek; Onları Floresans mikroskobu dissekan tarafından Puan edinildi; hücre altı kanal bileşenleri daha yüksek çözünürlükte confocal mikroskobu tarafından karakterize; ve görsel parametrelerini ölçmek. Belirlenmesi ve genler hücre içi Lümen filogenetik korunmuş süreçlerinde yer alan ve tek hücreli karakterize C. elegans boşaltım kanalı yararlanarak ilgilenen araştırmacı için yararlı bir yaklaşımdır morfogenez tüp.

Introduction

Tüm iç organları tüpler, taşıma ve gazlar, sıvılar ve besin alışverişini ve metabolik atık atılımı gibi birçok farklı fonksiyonları için çok önemli oluşur. Onların polarize karakterle ayrı apikal ve lumenal membran, bu belirli işlevler için uyarlanmış ve dipnotlar endo – ve plazma membran sistemlerinin hatalarını insan hastalık1,2sık bir nedenidir. Tüpler damarlara ve iç organlara çoğunluğu çok hücreli ve bir Lümen intercellularly oluşturur; Ancak, Lümen intracellularly oluşturan, tek hücreli tüpler, örneğin, insan kapiller yatak%230-50’si kadar temsil edebilir. Onların microdomains göre tüp’ın belirli işlevi (örneğin, boşaltım kanalı kanalcık Caenorhabditis bağırsak microvilli karşı farklı olabilir polarize membranları ile multi – tek hücreli tüpler kompozisyon, benzer olmakla birlikte elegans; bkz. kağıt üzerinde C. elegans bağırsak tubulogenesis eşlik eden)3. Polarize membran dipnotlar ve tubulogenesis ilkelerine metazoans arasında korunmuş ve benzer bir moleküler makineler onları1,2,4yönlendirir.

C. elegans boşaltım sistemi beş hücreleri oluşur: boşaltım hücre (EC), kanal hücre (DC), gözenek (PC) ve iki bezi hücreyi. Ablasyon EC, DC veya PC vücut boşluğu ve hayvanlar die erken bir larva sahne5sıvı birikimine neden olur. Bu üç tek hücreli tüpler intriguingly, onların Lümen üç farklı yöntemleri kullanarak oluşturmalısınız: hücre (EC) oymaya; Hücre kaydırma birleştiğinde autocellular junction oluşumu (PC); ve hücre kaydırma tarafından (DC); autofusion ile birleştiğinde Tüm filogenetik korunmuş6,7olan farklı mekanizmaları Lümen morfogenez. Posterior faringeal ampul yanal sol kısmında bulunan EC, iki yanal uzantıları dışarı hangi dört Kanallar anteriorly genişletmek için dışarı şube ve özafagusu (tarafında her iki sağ ve sol) solucan’ın burun ve kuyruk ucuna gönderir , sırasıyla (şekil 1)5,6,8. EC 2 x 1000 µm için yapım o büyük hücre içinde hayvan yaklaşık 1 µm kadar uzanır. Bir hücre altı düzeyde boşaltım kanalı bir Bazal membran doğru pseudocoelom yönettiği ve lumenal membran (endotube) tarafından tünel oluşturulmuş basit bir tüp var. Kanal lumenal membran kanal lumenal membran sadece hücreler arası kavşağında bağlanır; Kanallar aksi takdirde onların uzunlukları (şekil 1) junctionless. Boşaltım kanalı lumenal membran ve onun submembraneous sitoiskeleti apikal membran bileşimi ve submembraneous sitoiskeleti bağırsak gibi çok hücreli tüpler benzer moleküler onların kompozisyon tarafından tanımlanan apikal,, ve diğer (örneğin, düz) epiteli. Sitoplazmik organelleri, endomembranes kanal uzunluğu boyunca dağıtılır endosomal veziküler ve diğer (örneğin, Golgi) dahil olmak üzere. Ayrıca, birden çok canalicular veziküller – lumenal membran için bağlı ve/veya bağlı ya da izole – kanal sitoplazma7,8,9‘ dan,10 dişli . Bu dinamik plazma-membran/canalicular bağlantı daha fazla kanal’ın membran sistem genişletir ve her iki Lümen morfogenez ve ozmoregülasyon10için katkıda bulunur. Boşaltım kanalı böylece neredeyse tamamen endo – ve plazma membran, mükemmel bir model polarize membran dipnotlar çözümleme ve düzenleme, endo-plazma zarı arayüzü sağlayan oluşur. Apikal membran dramatik genişleme kanal morfogenez – bu tek hücreli sistemde Lümen uzantısıyla – çakışık sırasında da stabilize ve hücre içi lumenal membran Merkezi gerek tarafından kaynaklanan mimari sorunlarını analiz etmek için sağlar. . Bu iletişim kuralı kanal tüp ve Lümen’ın yapısal morfogenez ve bu işlemi için gereken hücre içi zar dinamiği analizi yerine AK ‘s konumda oluşturmak hücre hareketlerini doğrudan sinyalleri odaklanır boşaltım sistemi ve diğer hücresel öğelere (6‘ gözden), karmaşık bağlantıları oluşturun.

Bir daha fazla polarize membran ve hücre içi Lümen Biyogenez analizi için C. elegans tek hücreli kanal sistemi ayırmak, gelişimsel zaman içinde farklı bileşenleri, membran üretimi için onun yetenek avantajdır ve kavşak. EC ventral kapanış saatinde tarihi ve ventro-yanal sırasında zaman yanal kanal uzantısı ve dallanma ortaya orta embriyo5,6,8sırasında yutak yerleşir. Bu geç embriyogenez, L1-larva sahne (şekil 1) devam ediyor bir işlem sırasında ön-arka kanal uzantısı tarafından takip ediyor. Yeni taranmış bir larva, arka kanal ucunu solucan yaklaşık yarısı ulaşır, kuyruk L1 aşamasının sonunda hangi süre sonra kanal tam genişletme ile birlikte solucan8uzatıyor. İlk larva aşamasında etkin kanal büyüme bu hayvanın büyüme böylece aşan bir hızda biter, ancak, daha fazla büyüme paralelinde bütün hayvan büyüme ek larva aşamaları (L2-4) sırasında oluşur. Bu ayar farklı adımları polarize de novo membran dipnotlar polarize hücre bölünmesi veya geçiş bağımsız analiz etmek için fırsat sağlar. Ayrıca, bu bu işlem ayrılması (hangi Lümen başlatma önce embriyo içinde meydana) kavşaklar derlemesinden izin verir; onların tam membran polarizasyon içinde hala bir açık soru polarite alanındaki gereksinimdir. Son olarak, benzersiz olarak apikal Bazal membran genişleme, eski boşaltım Kanallar10‘ önceki ikinci işlem üzerinden ayırır. C. elegans boşaltım kanalı modeli bu nedenle bu avantajları polarize membran Biyogenez analizi için bir dizi hisse ama çok hücreli bir ortamda (bkz: yürütür bağırsak modeli özellikle bilgilendirici bir tamamlayıcıdır eşlik eden kağıt üzerinde bağırsak tubulogenesis3).

Vahşi-türü kanallar bu küçük solucan ultrathin tübüllerin olmakla birlikte, onların Lümen VI olabilirNomarski optik bu şeffaf hayvan tarafından doğrudan sualized. Aslında, mutant Kistik kanal türleri Morfoloji düşük büyütme ileri genetik ekranlarda büyük etkisi genlerin tubulogenesis11‘ de yer alan tanımlamak için kullanılmıştır mikroskobu dissekan kullanarak etiketsiz hayvanlarda karakterize edilebilir. Geliştirilmiş görsel Kanallar morfolojisi ve onların polarize membranlar, hücre iskeleti bileşenleri, farklı hücre içi organellerin ve diğer hücre altı yapıları, bir ayrım olarak ancak, etiketleme gerektirir ve daha yüksek güç floresan diseksiyon ve confocal mikroskobu. Etiketleme ve mikroskopi için zorluklar çok sayıda Kanallar fine yapısı pozlar rağmen belirli molekülleri her bölmesi için benzersiz üzerinden ayrılır membranlar ve hücre altı bileşenleri ve hayvanların güvenli bir şekilde mikroskopi için Eğer monte edilebilir (bkz: protokolü ve tartışma) eserler tanıtımı önlemek için bazı önlemler alındı. Etiketleme-ebilmek kılınmak sabit örnekler immünhistokimya veya transgenik solucanlar floresan füzyon protein kendi kontrolü altında ifade oluşturarak veya boşaltım kanalı özel Organizatör vivo içinde görüntüleme için. Bu iletişim kuralı ikinci etiketleme tekniği açıklar (eşlik eden kağıt3boyama antikor için bağırsak tubulogenesis bakınız).

Vivo kaybı veya kazanç-in-fonksiyonlu çalışmalar tek hücre analiz görüntüleme vivo içinde birleştirmek için yetenek düzey geliştirme yapar C. elegans boşaltım kanalı için moleküler özellikle güçlü bir model ve tek hücreli tubulogenesis hücresel analizi. İleriye veya geriye doğru genetik ekranlar gerçekleştirilen kanal morfogenez fenotipleri (örneğin, kistleri) tanımlamak için bir vahşi-türü veya etiketli transgenik hayvan ile başlayan ve onların temel gen kusurları. Alternatif olarak, bu tür ekranları mutant fenotip (örneğin, Kistik bir kanal) başlatmak ve bastırıcılarının veya bu fenotip arttırıcılar işlevsel olarak etkileşim genleri mutasyona uğramış fenotip neden gen ile tanımlamak için tanımlar. Mutant fenotip neden olan genetik bozukluk bir kaybı (örneğin, gen silme üzerinden ) ya da bir kazanç neden olabilir (örneğin, üzerinden aktive bir mutasyon ya da aşırı Gen kopya getirilmesi yolu ile) incelenen işlev. İleriye doğru mutagenesis ya da sistematik RNAi ekranlar önyargılarını gen işlevi olmadan ve genler faiz işlevinde yer tarafsız tanımlanmasına izin. Böyle ilgi herhangi bir gen veya gen (örneğin, hedeflenen ekranlar) herhangi bir grup da hızla probed genom çapında RNAi kitaplıkları besleme durumu göz önüne alındığında, hemen hemen her gen kolayca C. elegans, RNAi tarafından nakavt bir ters genetik yaklaşım kendi etki için. Yaklaşımlar olası birleşimini göstermek için biz burada bir hedeflenen RNAi etkileşimi ekran, bir işlev kazanç Kistik boşaltım kanalı mutant ile başlayan tarif sitoplazmik kanal yeşil flüoresan protein (GFP) ile Etiketlenmiş. Mutant fenotip erm-1, son derece korunmuş C. elegans overexpression tarafından oluşturulan ortholog membran-aktin bağlayıcı ailesinin Ezrin-Radixin-Moesin (ERM), lumen morfogenez ve membran karıştığı birçok tür12kuruluşta. C. elegans ERM-1 boşaltım kanalı ve bağırsak, gibi iç organların lumenal membranlar yerelleştirir ve her iki13Lümen oluşumu için gereklidir. ERM-1 overexpression fazla aktin ve akı Lümen artan ve kısa bir Kistik kanal ve bükük lumenal membran kalınlaşmış aktin astar boya9ile üreten kanal lumenal zar, veziküller acemi. Protokol transgenik suşları ile boşaltım kanalı ifade oluşturmak füzyon protein (veya diğer proteinler); etiketli açıklar nasıl bir kanal fenotip değiştiriciler tanımlamak için böyle suşları ile başlayan hedeflenen RNAi ekranlar gerçekleştirmek için; ve görsel olarak bilgilendirici tubulogenesis fenotipleri ölçmek için basit yollar dahil olmak üzere Floresans diseksiyon ve confocal mikroskobu tarafından bu tür ekranları sonuçlarını analiz etme. Etiketleme teknikleri ve öldürücü tubulogenesis genler için ayarlanmış RNAi ayrıntılarını alternatif bağırsak tubulogenesis3eşlik eden kağıda bulunabilir. Tüm yöntemleri çeşitli kombinasyonlarda kanal tubulogenesis diğer sorulara incelenmesi için kullanılabilir.

Protocol

1. C. elegans Excretory Canal floresan füzyon protein 14 tarafından etiketleme Not: eşlik eden kağıt üzerinde bağırsak tubulogenesis bkz: 3 in situ antikor yordamlar boşaltım kanalı uyarlanabilir boyama tarafından etiketleme için. Tablo 1 C. elegans boşaltım kanalı endo – ve plazma membran, Tablo 2 ifade boşaltım kanalı için sürüş rehberleri örnekleri için g?…

Representative Results

Bu iletişim kuralı, görsel ve tatlı tek hücreli tubulogenesis ve tek bir hücrede hücre içi Lümen morfogenez çözümlemek için C. elegans boşaltım Kanallar kullanmayı açıklamaktadır. Onların uzantısı sırasında orta embriyogenez zaman yetişkinlik, dört boşaltım Kanallar onların demiri ve apikal/lumenal membranlar için benzersiz bir model sağlar onların canalicular ve endosomal endomembrane sistemi ile birlikte genişlemeye devam de novo vi…

Discussion

C. elegans genetik çok yönlülük, şeffaflık, basit vücut planı ve sabit hücre soyu morfogenez analizi için mükemmel bir model olun. Bu iletişim kuralı standart genetik manipülasyon ve görüntüleme birleştirmek açıklar 2 mikron yararlanmak için çalışmalar ince polarize membran ve hücre içi Lümen Biyogenez bir tek hücre tüp çalışmaya C. elegans boşaltım kanallar.

Etiketleme
C. elegans boşaltım kanalları canlı anal…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

M. Buechner (University of Kansas, Kansas, ABD), K. Nehrke (Rochester Üniversitesi Tıp Merkezi, Rochester, New York, ABD) ve Caenorhabditis genetik Merkezi, Ulusal Sağlık Enstitüleri tarafından Office araştırma altyapı finanse teşekkür ediyoruz Programlar (P40 OD010440). Bu eser NIH GM078653, MGH olduğunu 224570 ve SAA 223809 V.G. için hibe tarafından desteklenmiştir

Materials

Cloning
Plasmid pPD95.75 Addgene Cat. No. 37464
PCR Kit Qiagen Cat. No. 27106
Ligation kit New England Biolabs Cat. No. E2611L
DNA marker Thermo Scientific Cat. No. SM1331
Agarose DNA grade Fisher Scientific Cat. No. BP164-100
Competent cells New England Biolabs Cat. No. C2987H
Tris Fisher Scientific Cat. No. BP154-1
EDTA Sigma Cat. No. ED-1KG
Acetic acid Fisher Scientific Cat. No. A38S-500
Ethidium bromide Fisher Scientific Cat. No. BP1302-10
Equipments
PCR machine  MJ Research Cat. No. PTG-200 
Centrifuge Eppendorf  Cat. No. 5415C
Water Bath Precision Scientific  Cat. No. 666A3 
Gel running instrument Fisher Scientific Cat. No. 09-528-165
Gel running power supply Fisher Scientific Cat. No. 45-000-465
Molecular Imager Gel Doc XR System Bio-Rad Cat. No. 1708195EDU
Nanodrop Spectrophotometer Thermo Scientific Cat. No. ND1000
C. elegans related1 1see reference27 for standard C. elegans culture and maintenance procedures.
LB Medium and plates2 2see reference24 for protocols.
Tryptone  Acros Organics Cat. no. 611845000
Yeast Extract BD Biosciences Cat. no. 212750
NaCl Sigma Cat. no. S7653
Bacto Agar  BD Biosciences Cat. no. 214040
Ampicillin Sigma Cat. no. A0116
Tetracycline Fisher Scientific Cat. no. BP912
M9 Medium2 2see reference24 for protocols.
NaCl Sigma Cat. no. S7653
KH2PO4 Sigma Cat. no. P0662
Na2HPO4 Sigma Cat. no. S7907
MgSO4 Sigma Cat. no. M2773
NGM plates 2 2see reference24 for protocols.
NaCl Sigma Cat. no. S7653
Peptone  BD Biosciences Cat. no. 211677
Tryptone  Acros Organics Cat. no. 611845000
Bacto Agar  BD Biosciences Cat. no. 214040
MgSO4 Sigma Cat. no. M2773
CaCl2 Sigma Cat. no. C3881
Cholesterol  Sigma Cat. no. C8667
K2HPO4  Sigma Cat. no. P3786
KH2PO4 Sigma Cat. no. P0662
RNAi plates3 3see reference60 for protocols.
NaCl Sigma Cat. no. S7653
Peptone  BD Biosciences Cat. no. 211677
Tryptone  Acros Organics Cat. no. 611845000
Bacto Agar  BD Biosciences Cat. no. 214040
MgSO4 Sigma Cat. no. M2773
CaCl2 Sigma Cat. no. C3881
Cholesterol  Sigma Cat. no. C8667
K2HPO4  Sigma Cat. no. P3786
KH2PO4 Sigma Cat. no. P0662
IPTG  US Biological Cat. no. I8500
Carbenicillin Fisher Scientific Cat. no. BP2648
NaOH Fisher Scientific Cat. no. SS266-1
Sodium hypochlorite Fisher Scientific Cat. no. 50371500
Bacteria
OP50 bacteria CGC
HT115 bacteria CGC
Genome-wide RNAi libraries
Ahringer genome-wide RNAi feeding library (ref29,49) Source BioScience
C. elegans ORF-RNAi feeding library (ref50) Source BioScience
Imaging related
Lidocaine MP Biomedicals,LLG Cat. no. 193917
Materials
Vacuum Grease Silicone Beckman Cat. no. 335148
Microscope slides  Fisher Scientific Cat. no. 4448
Microscope coverslips (22×22-1） Fisher Scientific Cat. no. 12-542-B
Tissue culture plate, 6 well  Corning Inc. Cat. no. 08-772-33
Equipment
SMZ-U dissecting microscope (Nikon)
SZX12 dissecting microscope (Olympus), equipped with a high-power stereo fluorescence attachment (Kramer Scientific), CCD camera with Q capture software and X-Cite fluorescent lamp (Photonic Solutions).
TCS SL Laser-scanning confocal microscope (Leica Microsystem)
C2 laser-scanning confocal mounted on an ECLIPSE Ti-E inverted microscope (Nikon)
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Referências

  1. Lubarsky, B., Krasnow, M. A. Tube morphogenesis: making and shaping biological tubes. Cell. 112 (1), (2003).
  2. Sundaram, M. V., Cohen, J. D. Time to make the doughnuts: Building and shaping seamless tubes. Semin. Cell Dev. Biol. S1084-9521, 30130-30136 (2016).
  3. Zhang, N. The C. elegans intestine as a model for intercellular lumen morphogenesis and in vivo polarized membrane biogenesis at the single-cell level. JoVE. , (2017).
  4. Andrew, D. J., Ewald, A. J. Morphogenesis of epithelial tubes: Insights into tube formation, elongation, and elongation. Dev. Biol. 341 (1), 34-55 (2010).
  5. Nelson, F. K., Albert, P. S., Riddle, D. L. Fine structure of the Caenorhabditis elegans secretory-excretory system. J. Ultrastruct. Res. 82 (2), 156-171 (1983).
  6. Sundaram, M. V., Buechner, M. The Caenorhabditis elegans Excretory System: A Model for Tubulogenesis, Cell Fate Specification, and Plasticity. Genética. 203 (1), 35 (2016).
  7. Altun, Z. F., Hall, D. H. Excretory system. WormAtlas. , (2009).
  8. Buechner, M. Tubes and the single C. elegans excretory cell. Trends Cell Biol. 12 (10), 479-484 (2002).
  9. Khan, L. A. Intracellular lumen extension requires ERM-1-dependent apical membrane expansion and AQP-8-mediated flux. Nat. Cell Biol. 15 (2), 143-156 (2013).
  10. Kolotuev, I., Hyenne, V., Schwab, Y., Rodriguez, D., Labouesse, M. A pathway for unicellular tube extension depending on the lymphatic vessel determinant Prox1 and on osmoregulation. Nat. Cell Biol. 15 (2), 157-168 (2013).
  11. Buechner, M., Hall, D. H., Bhatt, H., Hedgecock, E. M. Cystic canal mutants in Caenorhabditis elegans are defective in the apical membrane domain of the renal (excretory) cell. Dev. Biol. 214 (1), 227-241 (1999).
  12. Fehon, R. G., McClatchey, A. I., Bretscher, A. Organizing the cell cortex: the role of ERM proteins. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 11 (4), 276-287 (2010).
  13. Gobel, V., Barrett, P. L., Hall, D. H., Fleming, J. T. Lumen morphogenesis in C. elegans requires the membrane-cytoskeleton linker erm-1. Dev. Cell. 6 (6), 865-873 (2004).
  14. Sambrook, J., Sambrook, J., DW, R. u. s. s. e. l. l. . Molecular cloning: a laboratory manual. , (2006).
  15. Fire, A., Harrison, S. W., Dixon, D. A modular set of lacZ fusion vectors for studying gene expression in Caenorhabditis elegans. Gene. 93 (2), 189-198 (1990).
  16. Kamath, R. S., Ahringer, J. Genome-wide RNAi screening in Caenorhabditis elegans. Methods. 30 (4), 313-321 (2003).
  17. Timmons, L., Court, D. L., Fire, A. Ingestion of bacterially expressed dsRNAs can produce specific and potent genetic interference in Caenorhabditis elegans. Gene. 263 (1-2), 103-112 (2001).
  18. Pawley, J. B. . Handbook of Biological Confocal Microscopy. , (2006).
  19. Hibbs, A. R. . Confocal Microscopy for Biologists. , (2004).
  20. Bankhead, P. . Analyzing fluorescence microscopy images with ImageJ. , (2014).
  21. Praitis, V., Casey, E., Collar, D., Austin, J. Creation of low-copy integrated transgenic lines in Caenorhabditis elegans. Genética. 157 (3), 1217-1226 (2001).
  22. Frøkjaer-Jensen, C. Single-copy insertion of transgenes in Caenorhabditis elegans. Nat. Genet. 40 (11), 1375-1383 (2008).
  23. Mello, C. C., Kramer, J. M., Stinchcomb, D., Ambros, V. Efficient gene transfer in C. elegans: extrachromosomal maintenance and integration of transforming sequences. EMBO J. 10 (12), 3959-3970 (1991).
  24. Barrangou, R. Cas9 Targeting and the CRISPR Revolution. Science. 344 (6185), 707-708 (2014).
  25. Dickinson, D. J., Goldstein, B. CRISPR-Based Methods for Caenorhabditis elegans Genome Engineering. Genética. 202 (3), 885-901 (2016).
  26. Esposito, D., Garvey, L. A., Chakiath, C. S. Gateway cloning for protein expression. Methods Mol. Biol. 498, 31-54 (2009).
  27. Gibson, D. G. Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases. Nat. Methods. 6 (5), 343-345 (2009).
  28. Hobert, O. PCR fusion-based approach to create reporter gene constructs for expression analysis in transgenic C. elegans. Biotechniques. 32 (4), 728-730 (2002).
  29. Jorgensen, E. M., Mango, S. E. The art and design of genetic screens: caenorhabditis elegans. Nat. Rev. Genet. 3 (5), 356-369 (2002).
  30. Berry, K. L., Bulow, H. E., Hall, D. H., Hobert, O. A. C. elegans CLIC-like protein required for intracellular tube formation and maintenance. Science. 302 (5653), 2134-2137 (2003).
  31. Mattingly, B. C., Buechner, M. The FGD homologue EXC-5 regulates apical trafficking in C. elegans tubules. Dev. Biol. 359 (1), 59-72 (2011).
  32. Shaye, D. D., Greenwald, I. The disease-associated formin INF2/EXC-6 organizes lumen and cell outgrowth during tubulogenesis by regulating F-actin and microtubule cytoskeletons. Dev. Cell. 32 (6), 743-755 (2015).
  33. Lant, B. CCM-3/STRIPAK promotes seamless tube extension through endocytic recycling. Nat. Commun. 6 (6), 6449 (2015).
  34. Paupard, M. C., Miller, A., Grant, B., Hirsh, D., Hall, D. H. Immuno-EM localization of GFP-tagged yolk proteins in C. elegans using microwave fixation. J. Histochem. Cytochem. 49 (8), 949-956 (2001).
  35. Lukyanov, K. A., Chudakov, D. M., Lukyanov, S., Verkhusha, V. V. Photoactivatable fluorescent proteins. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 6 (11), 885-891 (2005).
  36. Bates, M., Huang, B., Dempsey, G. T., Zhuang, X. Multicolor super-resolution imaging with photo-switchable fluorescent probes. Science. 317 (5845), 1749-1753 (2007).
  37. Sherman, T. The abts and sulp families of anion transporters from Caenorhabditis elegans. Am. J. Physiol. Cell Physiol. 289 (2), C341-C351 (2005).
  38. . Transgeneome website Available from: https://transgeneome.mpi-cbg.de/transgeneomics/index.html (2017)
  39. . National BioResource Project (NBRP)::C. elegans Available from: https://shigen.nig.ac.jp/c.elegans/ (2017)
  40. Heppert, J. K. Comparative assessment of fluorescent proteins for in vivo imaging in an animal model system. Mol. Biol. Cell. 27 (22), 3385-3394 (2016).
  41. Shaner, N. C., Steinbach, P. A., Tsien, R. Y. A guide to choosing fluorescent proteins. Nat Methods. 2 (12), 905-909 (2005).
  42. . BLAST Available from: https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi (2017)
  43. Kamath, R. S., Martinezcampos, M., Zipperlen, P., Fraser, A. G., Ahringer, J. Effectiveness of specific RNA-mediated interference through ingested double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Genome Biol. 2 (1), RESEARCH0002 (2001).
  44. Kamath, R. S. Systematic functional analysis of the Caenorhabditis elegans genome using RNAi. Nature. 421 (6920), 231-237 (2003).
  45. Rual, J. F. Toward improving Caenorhabditis elegans phenome mapping with an ORFeome-based RNAi library. Genome research. 14 (10B), 2162-2168 (2004).

Tags

C. ElegansExcretory CanalIntracellular LumenPolarized Membrane BiogenesisTubulogenesisPolarityGFP FusionRNAiLive ImagingMembrane MarkersOrganelle MarkersPromotersERM-1Cystic Canal PhenotypeModifier Screen

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citar este artigo
Zhang, N., Membreno, E., Raj, S., Zhang, H., Khan, L. A., Gobel, V. The C. elegans Excretory Canal as a Model for Intracellular Lumen Morphogenesis and In Vivo Polarized Membrane Biogenesis in a Single Cell: labeling by GFP-fusions, RNAi Interaction Screen and Imaging. J. Vis. Exp. (128), e56101, doi:10.3791/56101 (2017).
Baixar citação
Reimpressões e Permissões

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image