O Canal de Excretory c. elegans como modelo para intracelular Lumen morfogênese e Vivo na biogênese de membrana polarizada em uma única célula: rotulagem por GFP-fusões, tela de interação de RNAi e Imaging

Todos os órgãos internos são compostos de tubos, cruciais para suas muitas funções diferentes, tais como o transporte e a troca de gases, líquidos e nutrientes e a excreção de resíduos metabólicos. Seu caráter polarizado, com distintas membranas apicais e lumenal, é adaptado para essas funções específicas, e defeitos na biogênese dos seus sistemas de endo – e membrana plasmática são uma causa frequente de doença humana^1,2. A maioria dos tubos da vasculatura e dos órgãos internos é pluricelulares e forma um lúmen intercellularly; no entanto, tubos unicelulares, que formam o lúmen intracelular, podem, por exemplo, representar tanto quanto 30 – 50% dos leitos de capilares humano². As membranas polarizadas de multi – e tubos unicelulares são similares na composição, embora seus microdomains podem variar com base na função específica do tubo (por exemplo, canalículos canal excretor contra microvilli intestinal em Caenorhabditis elegans; Veja que acompanham o papel de c. elegans tubulogenesis intestinal)³. Os princípios da biogênese de membrana polarizada e tubulogenesis são conservados entre metazoários, e uma máquina molecular semelhante direciona-los^1,2,4.

O sistema excretor de c. elegans consiste de cinco células: a célula excretor (CE), célula de duto (DC), pore celular (PC) e duas células da glândula. Ablação do CE, DC ou PC faz com que o acúmulo de líquido na cavidade do corpo e os animais morrem em um início de fase larval⁵. Curiosamente, estes três tubos unicelulares criar seus lúmens de três maneiras diferentes: por célula esvaziamento (CE); envolvimento de célula juntamente com formação de junção autocellular (PC); e pelo envolvimento da célula, juntamente com autofusion (DC); diferentes mecanismos da morfogênese lúmen que são todas conservadas filogeneticamente^6,7. O CE, localizado na lateral esquerda do bulbo posterior da faringe, envia duas extensões laterais do que os quatro canais ramificam-se para estender-se anteriormente e posteriormente (ambos do lado direito e esquerdo) para a ponta do nariz do worm e cauda , respectivamente (Figura 1)^5,6,8. O CE estende-se desde aproximadamente 1 µm a 2 x 1.000 µm, tornando-se a célula maior no animal. Em um nível subcelular, o canal excretor é um tubo simples, gerado a partir de uma membrana basal, dirigida para a Trochozoa e um túnel por uma membrana lumenal (endotube). A membrana lumenal canal conecta-se à membrana lumenal adesiva em sua junção só intercelular; os canais são outra forma junctionless ao longo de seu comprimento (Figura 1). A membrana lumenal canal excretor e sua submembraneous citoesqueleto são apicais, definido por sua composição molecular que se assemelha a composição da membrana apical e submembraneous citoesqueleto de tubos multicelulares, tais como o intestino, e de outros epitélios (por exemplo, plana). Organelas citoplasmáticas, incluindo CDDP vesicular e outro (por exemplo, Golgi) endomembranes são distribuídos ao longo do comprimento do canal. Além disso, várias vesículas canaliculares – ligado à membrana lumenal, e/ou interligados ou isolada – são rosqueadas através do canal citoplasma^7,8,9,10 . Esta conexão de plasma-membrana/canaliculares dinâmico mais expande sistema de membrana do canal e contribui para ambos lúmen morfogênese e osmoregulação¹⁰. O canal excretor assim consiste quase inteiramente de endo – e membranas de plasma, proporcionando um excelente modelo para a análise de biogênese de membrana polarizada e o Regulamento do endo-a interface da membrana plasmática. A dramática expansão da membrana apical durante a morfogênese do canal – neste sistema de célula única coincidente com extensão de lúmen – também permite analisar os problemas arquitectónicos decorrentes da necessidade de estabilizar e centralizar uma membrana lumenal intracelular . Este protocolo centra-se na análise da morfogênese estrutural do tubo canal e do lúmen e a dinâmica da membrana intracelular necessária para este processo, em vez dos sinais que dirigem o movimento da célula que geram a posição da CE na sistema excretor e construir suas intrincadas conexões com outros elementos celulares (revistos em⁶).

Uma vantagem adicional do sistema de célula única canal c. elegans para a análise da membrana polarizada e biogênese intracelular lúmen é sua capacidade de separar, no tempo do desenvolvimento, a geração de diferentes componentes de suas membranas e entroncamentos. A CE é nascida no momento do encerramento ventral e resolve ventro-lateral da faringe durante meados embriogênese^5,6,8, durante o qual a extensão de tempo canal lateral e ramificação ocorrerem. Isto é seguido pela extensão do canal ântero-posterior durante a embriogênese atrasado, um processo que continua para o estágio larval de L1 (Figura 1). Em uma larva recém-eclodidos, a ponta do canal posterior atinge aproximadamente no meio do worm, totalmente estendendo-se até a cauda no final da fase L1, após o que o canal se alonga juntamente com o worm⁸. Crescimento do canal ativo a uma velocidade superior do crescimento do animal assim termina a primeira fase larval, no entanto, ainda mais o crescimento ocorre em paralelo com o crescimento do animal inteiro durante os estágios larvas adicionais (L2 – 4). Essa configuração fornece a oportunidade de analisar as diferentes etapas da biogênese de membrana de novo polarizada independente da divisão de células polarizada ou migração. Além disso, permite a separação deste processo da Assembleia dos cruzamentos (que ocorrem no embrião antes do início do lúmen); sua exigência exata na polarização de membrana é ainda uma questão em aberto no campo de polaridade. Finalmente, excepcionalmente separa apical de expansão de membrana basal, o último processo precede o anterior nos canais excretores¹⁰. O modelo de canal excretor de c. elegans , portanto, é um complemento particularmente informativo para o modelo intestinal que compartilha um número dessas vantagens para a análise de biogênese de membrana polarizada, mas executa-lo em uma configuração multicelular (ver o livro acompanhando sobre a tubulogenesis intestinal³).

Embora o selvagem-tipo canais são túbulos ultrafinos neste pequeno verme, seus lúmens podem ser visualized diretamente pela óptica Nomarski neste animal transparente. Na verdade, morfologias mutante canal cístico podem ser caracterizadas em animais sem rótulo usando baixa ampliação dissecando microscopia, que tem sido usada com grande efeito nas telas de genéticas para a frente para identificar genes envolvidos na tubulogenesis¹¹. Melhor visualização da morfologia dos canais e distinção de suas membranas polarizadas, componentes do citoesqueleto, diferentes organelas intracelulares e outras estruturas subcelulares, no entanto, exige a rotulagem e superior de energia fluorescente microscopia confocal e dissecação. Embora a estrutura de fina dos canais coloca uma série de dificuldades para a rotulagem e microscopia, membranas e componentes subcelulares podem ser distinguidos através das moléculas específicas exclusivas para cada compartimento, e animais podem ser montados com segurança para microscopia, por se certas precauções para evitar a introdução de artefatos (ver protocolo e discussão). Rotulagem pode ser feito por imuno-histoquímica em amostras fixas, ou através da geração de vermes transgênicos expressando proteínas da fusão fluorescente sob o controle de suas próprias ou excretoras promotores de canal específico para a imagem latente na vivo . Este protocolo descreve a última técnica de rotulagem (tubulogenesis intestinal para anticorpo que mancha³ver o papel de acompanhamento).

A habilidade de combinar estudos de perda ou ganho-de-função na vivo com na vivo de imagem análise na célula única nível ao longo do desenvolvimento faz o canal excretor de c. elegans um modelo particularmente forte para o molecular e análise celular de tubulogenesis unicelulares. Avanço ou retrocesso telas genéticas podem ser executadas iniciando com um animal transgénico selvagem-tipo ou etiquetado para identificar fenótipos de morfogênese de canal (por exemplo, cistos) e seus defeitos genéticos subjacentes. Alternativamente, tais telas podem começar com um fenótipo mutante (por exemplo, um canal cístico) e identificar supressores ou potenciadores deste fenótipo para identificar genes que interagem funcionalmente com o gene causando o fenótipo mutante. O defeito genético causando o fenótipo mutante pode induzir uma perda (por exemplo, através do apagamento do gene) ou um ganho (por exemplo, através de uma mutação de ativação ou através da introdução de cópias do gene em excesso) da função investigada. Encaminhar mutagênese ou RNAi sistemática telas são sem preconceitos em função dos genes e permitirem a identificação imparcial de genes envolvidos na função de interesse. Tendo em conta a disponibilidade de todo o genoma de RNAi alimentação bibliotecas, quase cada gene pode ser facilmente derrubado por RNAi em c. elegans, tal que qualquer único gene de interesse ou qualquer grupo de genes (por exemplo, em telas de alvo) pode também ser rapidamente analisado por seu efeito em uma abordagem genética reversa. Para demonstrar uma possível combinação de abordagens, aqui descrevemos uma tela de interação alvo RNAi, começando com um mutante de ganho-de-função cística canal excretor, rotulado com proteína de canal citoplasmática verde fluorescente (GFP). O fenótipo mutante foi gerado pela superexpressão de erm-1, um altamente conservadas c. elegans ortholog da família de vinculador de membrana-actina Ezrin-Radixin-Moesin (ERM), que tem sido implicados na morfogênese do lúmen e membrana organização em muitas espécies¹². C. elegans ERM-1 localiza-se às membranas lumenal dos órgãos internos, tais como o canal excretor e intestino e é necessário para a formação do lúmen em ambos¹³. MTC-1 superexpressão recrutas excesso actina e vesículas para a membrana lumenal canal, aumentando o fluxo no lúmen e gerando um curto canal cístico e uma membrana lumenal frisada com actina espessada subpêlo⁹. O protocolo descreve como gerar cepas transgênicas com canal excretor-expressa rotulado fusão proteínas (ou outras proteínas); como executar alvo RNAi telas começando com essas estirpes, para identificar os modificadores de um fenótipo de canal; e como analisar visualmente os resultados de tais telas por dissecação e confocal a microscopia de fluorescência, incluindo maneiras simples de quantificar fenótipos tubulogenesis informativo. Alternativa de rotulagem técnicas e detalhes de RNAi, ajustado para os genes tubulogenesis frequentemente letal, encontram-se no livro de acompanhamento sobre tubulogenesis intestinal³. Todos os métodos podem ser usados em várias combinações para a investigação de outras perguntas no canal tubulogenesis.