세포내 루멘 Morphogenesis 그리고 Vivo에서 편광 막 속 단일 셀에 대 한 모델로 선 충 C. Excretory 운하: GFP 융해, RNAi 상호 작용 화면 및 이미징 라벨

모든 내부 장기의 튜브, 전송 및 가스, 액체 및 영양분의 교환 및 변화 낭비의 배설물 같은 그들의 여러 가지 기능에 대 한 중요 한 구성 됩니다. 그들의 편광된 캐릭터, 독특한 꼭대기와 lumenal 멤브레인과 이러한 특정 기능, 적응 하 고 결함 그들의 엔도-및 플라즈마 멤브레인 시스템의 속에는 인간의 질병^1,2의 빈번한 원인이. 튜브는 맥 관 구조와 내부 장기의 대부분은 다세포 이며 intercellularly;는 루멘을 형성 그러나, 침 루멘을 형성, 단 세포 관, 수 예, 나타낼 만큼 인간의 모 세관 침대²의 30-50%. 비록 그들의 microdomains 튜브의 특정 기능 (예를 들어, 꼬마 장 microvilli 대 배설 운하 canaliculi에 따라 다를 수 있습니다 멀티-및 단 세포 튜브의 편광된 막 구성 면에서 유사 하다 선 충; C. 선 충 장 tubulogenesis 종이 동반 참조)³. 편광된 막 속 및 tubulogenesis의 원리는, metazoans 중 보존 하 고 유사한 분자 기계는 그들에 지시^1,,24.

C. 선 충 배설 시스템 이루어져 5: 배설 셀 (EC), 덕트 세포 (DC), 셀 (PC)와 두 개의 선 셀 기 공. EC, DC 또는 PC의 절제는 바디 구멍에 한 초기 애벌레 단계⁵에서 동물 다 액체 축적을 발생합니다. 이 3 단 세포 관 글, 세 가지 방법으로 그들의 루멘을 만들: (EC)를 공동 화; 세포에 의해 셀 포장 결합 autocellular 접합 형성 (PC); 그리고 셀 배치 하 여 결합 autofusion (DC); 다른 메커니즘의 루멘 morphogenesis 모든 phylogenetically 보존된^6,7입니다. EC, 후부 인 두 전구의 측면 왼쪽에 있는 밖으로 보내는 두 측면 확장 4 운하 anteriorly 확장 하는 확장에서 그리고 뒤로 (둘 다 오른쪽과 왼쪽 측면) 벌레의 코 및 꼬리의 끝에 각각 (그림 1)^5,,68. EC에서에서 확장 약 1 µ m 2 x 1000 µ m, 동물에서 가장 큰 셀을 만들기. Subcellular 수준에 배설 채널 pseudocoelom, 향해 이동 하 고 lumenal 막 (endotube)에 의해 터널링 기저 막에서 생성 된 간단한 튜브입니다. 그것의 유일한 세포 접합;에서 덕트 lumenal 막에 연결 하는 운하 lumenal 막 운하는 그렇지 않으면 그들의 길이 (그림 1)에 따라 junctionless. 배설 운하 lumenal 막 및 그것의 submembraneous 골격 꼭대기 막의 조성과 소장, 같은 다세포 튜브의 submembraneous 골격 유사한 그들의 분자 구성에 의해 정의 된 꼭대기는 그리고 다른 (예를 들어, 평면) epithelia의. 세포질 세포, endosomal 나노미터 및 기타 (예, 골) endomembranes는 운하의 길이 따라 배포를 포함 하 여 또한, 여러 canalicular 소포-중 lumenal 막에 연결 된 상호 또는 절연-운하 세포질^{7,,89,10 통해 스레드는} . 이 동적 플라즈마 멤브레인/canalicular 연결 추가 채널의 막 시스템을 확장 하 고 모두 루멘 morphogenesis 및 osmoregulation¹⁰에 기여. 배설도 따라서 엔도-와 편광된 막 속의 분석 및 엔도-플라즈마 멤브레인 인터페이스의 규제에 대 한 훌륭한 모델을 제공 하는 플라즈마 세포 막의 거의 전적으로 구성 되어 있습니다. 이 단일 셀 시스템-루멘 확장명이 일치에서 운하 morphogenesis-동안 꼭대기 막의 극적인 확장 하실 수 있습니다을 안정 시키고 세포내 lumenal 막 센터는 필요에 의해 발생 하는 건축 문제를 분석 하 . 이 프로토콜에 초점을 맞추고 보다 직접 셀 움직임에서 EC의 위치를 생성 하는 신호 채널 튜브와 루멘의 구조 morphogenesis 및이 프로세스에 필요한 세포내 막 역동성의 분석에는 배설 체계 다른 세포 요소 (^6에서검토) 그것의 복잡 한 연결을 구성 하 고.

편광된 막과 세포내 루멘 속의 분석에 대 한 선 충 C. 단일 셀 운하 시스템의 추가 이용은 개발 시간을 통해 그것의 막의 다른 구성 요소의 세대를 분리 하는 기능 그리고 접속점입니다. EC와 복 부 폐쇄의 시간에 태어난 ventro 옆 인 두의 중간 embryogenesis^5,6,8, 동안 시간 측면 운하 확장 하 고 분기 발생 동안 침전. 이것은 늦은 embryogenesis, (그림 1) L1 애벌레 단계에 계속 하는 과정 동안 앞쪽 후부 운하 확장에 의해 선행 된다. 새로 부 화 애벌레, 후부 운하 끝에 도달 하면 벌레의 중간 약, 벌레⁸함께 elongates 완전히 확장 꼬리에 L1 무대의 끝에 어느 시간 후 운하. 그러나 따라서 동물의 성장을의 그것을 초과 하는 속도에서 활성 채널 성장 종료 첫 번째 애벌레 단계에서, 추가 성장 추가 애벌레 단계 (L2-4) 전체 동물의 성장과 동시에 발생 합니다. 이 설정은 드 노 보 편광 막 속의 편광된 세포 분열 또는 마이그레이션 독립의 다른 단계를 분석할 기회를 제공 한다. 또한, 접속점 (에서 발생 하는 루멘 개시 전에 배아);의 어셈블리에서이 프로세스의 분리 허용 막 분극에 그들의 정확한 요구 사항을 여전히 극성 필드에 오픈 질문 이다. 마지막으로, 그것은 고유 하 게 꼭대기 기저 막 확장, 배설 운하¹⁰전 앞 후자의 프로세스에서에서 분리 합니다. C. 선 충 배설 채널 모델은 따라서 편광된 막 속의 분석에 대 한 이러한 장점의 번호를 공유 하지만 다세포 설정 (참조 실행 장 모델에 특히 유익한 보완 함께 종이 장 tubulogenesis³에).

야생-타입 운하는이 작은 벌레의 ultrathin tubules, 비록 그들의 루멘 6 수 있습니다.이 투명 한 동물에 Nomarski 광학에 의해 직접 sualized. 사실, 돌연변이 낭 성 운하 형태학 레이블이 없는 동물 해 부 현미경, tubulogenesis¹¹에 관련 된 유전자를 식별 하기 위해 앞으로 유전 스크린에 큰 효과를 사용 하는 낮은 확대를 사용 하 여 특징 수 있습니다. 그러나 향상 된 시각화 운하의 형태와 그들의 편광된 막, cytoskeletal 구성 요소, 다른 세포내 세포 및 다른 subcellular 구조의 구별의, 라벨링 요구 하 고 높은 형광등을 전원 해 고 confocal 현미경 검사 법입니다. 비록 운하 미세 구조 포즈 다양 한 라벨 및 현미경 검사 법에 대 한 어려움, 막 및 subcellular 구성 요소는 각 구획에 고유한 특정 분자를 통해 구별 될 수 있다 및 동물 안전 하 게 장착할 수 현미경에 대 한 경우 특정 아티팩트 ( 프로토콜 및 토론참조) 소개를 피하기 위해 주의. 라벨 immunohistochemistry 고정된 표본에 의해 또는 그들의 자신의 통제 형광 성 융해 단백질을 표현 하는 유전자 변형 벌레를 생성 하 여 수행할 수 있습니다 또는 vivo에서 화상 진 찰에 대 한 배설 운하 관련 발기인. 이 프로토콜 설명는 후자의 라벨 (동반 종이³를 얼룩이 지는 항 체에 대 한 장 tubulogenesis 참조).

결합 손실 또는 이득-의-기능 학문 vivo에서 vivo에서 이미징 단일 셀에서 분석 하는 능력 개발은 전체 선 충 C. 배설 운하는 분자에 대 한 특히 강한 모델 레벨 및 단 세포 tubulogenesis의 세포 분석입니다. 정방향 또는 역방향 유전 스크린 운하 morphogenesis 고기 (예를 들어, cysts)을 식별 하는 야생-타입 또는 레이블이 유전자 변형 동물 시작 수행할 수 있습니다 그리고 그들의 기본 유전자 결함. 또는, 이러한 화면 돌연변이 표현 형 (예, 낭 성 운하)로 시작 하 고 진압 또는 증강이이 형의 유전자 돌연변이 표현 형을 일으키는 기능적으로 상호 작용 하는 유전자를 식별 식별 수 있습니다. 돌연변이 체 표현 형을 일으키는 유전적 결함 (예를들면, 유전자 삭제 통해 ) 손실 또는 이득 일으킬 수 있다 (예를 들어,를 통해 활성화 돌연변이 또는 초과 유전자의 도입을 통해) 조사 기능. 앞으로 mutagenesis 또는 체계적인 RNAi 스크린 유전자 기능에 편견 없이 고 관심의 기능에 관련 된 유전자의 편견된 식별을 허용. 라이브러리를 수 유 하는 게놈 넓은 RNAi의 가용성을 감안할 때 거의 모든 유전자 수 수 쉽게 뜨 RNAi C. 선 충에 의해 그런 관심사의 어떤 단일 유전자 또는 유전자 (예를 들어, 대상된 화면에서)의 어떤 그룹 수 있습니다 또한 신속 하 게 찾는 것 대 한 반전 유전학 접근에 그들의 효과. 접근의 가능한 조합을 보여, 우리 여기 설명 대상된 RNAi 상호 작용 화면 기능 이득 낭 성 배설 운하 돌연변이로 시작 세포질 운하 녹색 형광 단백질 (GFP)으로 표시. 돌연변이 형 음-1, 높은 보존된 C. 선 충 의 overexpression에 의해 생성 된 막 걸 링커 가족 Ezrin-Radixin-Moesin (ERM), 루멘 morphogenesis 및 막에 연루 되어 있는의 ortholog 많은 종¹²조직입니다. C. 선 충 음 1 배설 운하 등 소장, 내부 장기의 lumenal 막 localizes 및 두¹³루멘 형성에 대 한 필요 합니다. 음-1 overexpression 초과 말라와 루멘에 플럭스를 증가 하 고 짧은 낭 운하와 두꺼워 말라 undercoat⁹방해 lumenal 막 생성의 운하 lumenal 막에 소포를 보충 한다. 프로토콜 융합 단백질 (또는 다른 단백질); 운하 표현 배설와 유전자 변형 종자를 생성 하는 방법을 설명 합니다. 타겟된 RNAi 스크린 운하 형;의 한정자를 식별 하기 위해 이러한 긴장 시작을 수행 하는 방법 그리고 시각적으로 형광 해 고 confocal 현미경 검사 법, 유익한 tubulogenesis 고기를 계량 하는 간단한 방법을 포함 하 여 이러한 스크린의 결과 분석 하는 방법. 대체 기술 및 RNAi, 종종 치명적인 tubulogenesis 유전자 조정의 세부 사항 라벨 장 tubulogenesis³에 동반 종이에서 찾을 수 있습니다. 모든 메서드는 채널 tubulogenesis에 다른 질문의 조사에 대 한 다양 한 조합에 사용할 수 있습니다.