O c. elegans intestino como um modelo para intercelular Lumen morfogênese e In Vivo biogênese de membrana polarizada no nível de célula única: rotulagem por anticorpos, RNAi perda--função de análise e de imagem

A geração de celulares e subcellular assimetrias, tais como a formação dos domínios de membrana polarizada, é crucial para a função de células, tecidos e órgãos¹e morfogênese. Estudos sobre biogênese de membrana polarizada em epitélios permanecem um desafio técnico, uma vez que mudanças direcionais na alocação de componentes subcelulares dependem de múltiplos consecutivos e coincidentes extracelulares e intracelulares sinais que são é difícil separar na maioria de modelos e fortemente dependem do sistema de modelo. O modelo apresentado aqui – a camada única Caenorhabditis elegans intestino – é um tecido de requintada simplicidade. Junto com o single-cell c. elegans excretor canal (veja papel de acompanhamento na biogênese de membrana polarizada no canal excretor c. elegans )², fornece várias vantagens exclusivas para a identificação e caracterização de moléculas necessárias para a biogênese de membrana polarizada. A conservação das indicações de polaridade molecular de leveduras ao homem fazer este órgão invertebrado simples um excelente“em vivo câmara de tecido” para responder a perguntas sobre polaridade epitelial que são de relevância directa para o sistema humano, que é ainda demasiado complexo para permitir a dissecação visual desses eventos no single cell nível em vivo.

Apesar de várias pistas de polaridade conservada da matrix (1) extracelluar, (2) a membrana plasmática e suas junções e tráfico vesicular (3) intracelular foram identificados³, os princípios subjacentes da sua integração no processo de polarizada biogênese de membrana e tecido epitelial é mal compreendido⁴. Os modelos clássica célula única na vivo (e.g.S. cerevisiae e o zigoto de c. elegans ) têm sido fundamentais para definir os princípios da divisão de células polarizada e polaridade ântero-posterior e identificaram críticos polaridade de membrana associada determinantes (pequenas GTPases/CDC-42, PARs os particionamento com defeito)^5,6, mas eles dependem da simetria única pistas (cicatriz de broto, entrada de esperma) e à faltam de junção-protegido domínios de membrana apicobasal e, presumivelmente, o correspondente apicobasal intracelular, máquinas de classificação. Nosso conhecimento atual sobre a organização do tráfico polarizada de epitélios, no entanto, principalmente se baseia em mamíferos monoculturas 2D⁷, que falta fisiológicas pistas extracelulares e do desenvolvimento que podem mudar as posições da membrana domínios e direções de trajetórias de tráfico (um interruptor de 2D para 3D em vitro cultura sistemas sozinhos é suficiente para inverter a polaridade da membrana nas células MDCK (rim canino de Madin-Darby))⁸. Na vivo do desenvolvimento estudos sobre polaridade epitelial em organismos invertebrados modelo realizaram-se inicialmente em epitélios simples, por exemplo na epiderme Drosophila melanogaster , onde identificaram a contribuição crítica da dinâmica de junção para a migração de células polarizadas e célula folha movimento⁹e de tráfico endocítica para polaridade manutenção¹⁰. O 3D in vitro e em vivo análise da morfogênese lúmen em epitélios tubulares em células MDCK e no intestino c. elegans , respectivamente, recentemente identificaram a exigência de tráfico intracelular para de novo domínio (apical) e a biogênese de lúmen e posicionamento^11,12,13. A espessura de tubular (em vez de plana) células epiteliais é uma vantagem para a análise 3D de assimetrias subcellular desde que permite uma distinção visual superior da membrana apical-lumenal, entroncamentos ápico-lateral, a membrana lateral e o posições das organelas intracelulares. A estas vantagens visuais, o modelo de c. elegans adiciona a configuração vivo em eixo do desenvolvimento, transparência, simplicidade do plano do corpo, linhagem de células definidas e invariável, analítica (genética) e vantagens adicionais descritas abaixo.

C. elegans em si é uma lombriga de estrutura tubular, cuja transparência e arquitetura simples disponibilizar seus órgãos internos da mesma forma tubulares diretamente para a análise visual da morfogênese tubo e lúmen. As vinte células de seu intestino (21 ou 22 células na ocasião)¹⁴ são derivadas de uma célula progenitora único (E) e desenvolver a partir de um dupla camada de epitélio a um passo de intercalação para um tubo bilateralmente simétrico dos nove anéis INT (em quatro células a primeiro anel; Figura 1 esquema)^14,15,16. Análise de linhagem e tecido do intestino, determinada inicialmente por óptica Nomarski através de de identidades nuclear¹⁷e posteriormente por microscopia de fluorescência através de membranas rotuladas, forneceu insights críticos sobre sua morfogênese, em particular os requisitos autónoma-célula e célula-não-autónomos para seu direcionais divisões celulares e movimentos (por exemplo, intercalação, as assimetrias de direita-esquerda, rotação anterior e posterior do tubo)^14,18 . Especificação de endodermal celular precoce e a rede reguladora de gene controlando o desenvolvimento do órgão modelo clonal são bem caracterizadas^19,20. O foco aqui, no entanto, é na análise da membrana polarizada e biogênese de lúmen único células tubulares e das assimetrias intracelulares de endomembranes, estruturas do citoesqueleto e organelas que acompanham este processo. A análise é facilitada pela simplicidade deste tubo, onde todas as membranas apicais (no nível ultraestrutural distinto por microvilli) enfrentam o lúmen, e a todas as membranas basais face a superfície exterior do tubo, com membranas laterais contactar uns aos outros, separados da membrana apical por junções (Figura 1 esquema; Veja referências (^16,21) para o c. elegans-organização específica de apertado e componentes de junção aderente). Biogênese da membrana apical, portanto, é coincidente com a morfogênese do lúmen. Além disso, o tamanho das células intestinais adultos – as maiores células deste pequeno animal (com exceção da célula excretor) – aproximado do tamanho de uma pilha mamífera, permitindo na vivo rastreamento visual dos elementos subcelulares, por exemplo trajetórias de vesículas, que geralmente é tentaram em vitro em um prato de cultura.

Para efeitos desta análise celular e subcellular, rotulagem adequada é fundamental. Domínios de membrana plasmática ou endo intestinal, junções, do citoesqueletoestruturas, núcleos e outras organelas subcelulares podem ser visualizadas através da marcação de seus componentes moleculares específicos. Muitos desses componentes foram caracterizados e continuar a ser descoberto (atabela 1 dá alguns exemplos e refere-se aos recursos). Por exemplo, várias moléculas, distinguindo os compartimentos tubulares e/ou vesiculares do sistema endomembranoso intestinal, da emergência para o Golgi através de vesículas de Golgi-post para a membrana plasmática, foram identificadas²². O específicas proteínas (como lipídios e açúcares) podem também ser rotulados directamente, ou indirectamente através de proteínas de ligação. Este protocolo enfoca em situ mancha do anticorpo de espécimes fixos, uma das duas técnicas padrão de rotulagem (consulte o documento que acompanha no canal excretor tubulogenesis para obter uma descrição dos outros técnica² – em vivo rotulagem através de fusões de proteína fluorescente – que é directamente aplicável para o intestino; Tabela 2 fornece exemplos de promotores específicos do intestino que podem ser usados para dirigir a expressão de tais proteínas de fusão para o intestino). Duplo – ou múltiplos de rotulagem com qualquer abordagem, ou com uma combinação de ambos mais adicionais químicas de coloração, permite maior resolução visual em profundidade e o exame das mudanças espaciais e temporais na localização co e recrutamento de específicos moléculas ou de componentes subcelulares (Figura 2). A fixação e procedimentos descritos nessa preservação do suporte de protocolo de proteína verde fluorescente (GFP) rotulagem durante procedimentos de imunocoloração de coloração. Para a imagem latente, principais pontos de detecção e caracterização de tubulogenesis fenótipos através de procedimentos padrão microscópicos (microscopia de fluorescência confocal e dissecação) são descritos (Figura 3, 4). Estes podem ser estendidos para a maior resolução de imagem de abordagens, para instância superresolution microscopia e transmissão microscopia eletrônica (não descrito aqui).

Uma força chave deste sistema é a capacidade de analisar a polaridade nas células individuais em diferentes estádios de desenvolvimento, de embriogênese através da vida adulta. Por exemplo, biogênese de domínio e o lúmen da membrana apical pode ser rastreado ao longo do desenvolvimento a nível de célula única através de rotulagem com MTC-1, um vinculador de membrana altamente conservadas-actina da Yasmim-Radixin-Moesin família^23,24 . MTC-1 visualiza a biogênese de membrana apical (1) durante a morfogênese tubo embrionário, quando ocorre concomitantemente com a divisão celular polarizada e migração (movimento de células apicalmente ao redor do lúmen durante a intercalação)¹⁵; (2) durante a tarde extensão de tubo embrionário e larvar que procede na ausência de divisão celular ou migração; e (3) no intestino adulto, onde a membrana polarizada domínios são mantidos (Figura 1). No epitélio pós mitótico larval em expansão, de novo polarizada membrana biogênese, portanto, pode ser separado da morfogênese tecido polarizada, que não é possível na maioria dos modelos de polaridade epitelial in vivo e in vitro , incluindo aqueles com resolução de célula única (por exemplo, o 3D MDCK cisto modelo⁸). Com rotulagem para outros componentes, essa configuração fornece a oportunidade (particularmente na L1 larval fase quando as células têm uma maior relação citoplasma/núcleo) distinguir essas alterações intracelulares que são específicas para polarizada (biogênese de membrana por exemplo, a reorientação das trajetórias de tráfico) daqueles concomitantemente necessários para migração e divisão de células polarizada.

A versatilidade genética de c. elegans é conhecido²⁵e torna um sistema poderoso modelo para a análise molecular de qualquer questão biológica. Um estudo sobre a morfogênese, por exemplo, pode começar com uma estirpe de tipo selvagem, uma cepa transgênica onde a estrutura de interesse (por exemplo, uma membrana) é rotulada com um marcador fluorescente, ou com um mutante de perda ou ganho-de-função com um defeito no presente estrutura. Um estudo de genético reverso típico pode gerar um mutante onde o gene de interesse é excluído no germline (por exemplo, por uma deleção específica), modificado por mutagênese (tipicamente produzir mutações pontuais, com consequente perda, redução ou ganho de função do gene), ou onde a sua transcrição é reduzida por RNAi. A facilidade de RNAi, alimentando em c. elegans²⁶ também presta-se ao design de telas específicas que examinar um grupo maior de genes de interesse. Indiscutivelmente a maior força do organismo modelo genético é a capacidade de realizar na vivo frente telas (por exemplo, mutagênese, telas de RNAi sistemáticas ou todo o genoma) que permitem uma investigação imparcial sobre a causa molecular para um fenótipo de interesse. Por exemplo, um visual imparcial c. elegans RNAi tubulogenesis tela, começando com um animal geneticamente modificado com membranas apicais ERM-1-rotulados, descobriu um intrigante conversão reversível de polaridade intestinal e fenótipo lúmen ectópica, usado aqui como um exemplo para este tipo de análise. Esta tela identificou o esgotamento de glycosphingolipids (GSLs; lipídios de membrana obrigatórios, identificados através de suas enzimas biossintéticas-GLS) e componentes de Clatrina de casaco a vesícula e sua AP-1 adaptador como os defeitos moleculares específicos causando essa polaridade fenótipo de conversão, desse modo, caracterizar estes tráfico de moléculas como in vivo sugestões para a polaridade da membrana apical e lúmen posicionamento^12,13. Ao iniciar com um fenótipo específico mutação genética/morfogênese, tais telas (ou experimentos simples interação genética/RNAi) também podem examinar interações funcionais entre dois ou vários genes de interesse (veja papel de acompanhamento sobre o excretor canal para obter um exemplo de tal análise)². Este protocolo centra-se na RNAi que, além de sua capacidade de identificar diretamente o gene cuja perda faz com que o fenótipo em telas para a frente, oferece vantagens específicas para a análise da morfogênese. Desde produtos de genes direcionando morfogênese muitas vezes trabalham de uma forma dose-dependente, RNAi é geralmente bem sucedido em gerar um espectro de fenótipos. A capacidade de gerar informativos parcial-perda-de-função fenótipos também ajuda a resolver o problema que a maioria dos genes tubulogenesis importantes é essencial e que suas perdas causam esterilidade e mortalidade embrionária precoce. Este protocolo inclui estratégias de RNAi condicionais para superar esta dificuldade e sugere maneiras de otimizar a geração de um amplo espectro de fenótipos, tais como uma série alélica produzido por mutagénese.