الأمعاء C. ايليجانس "كنموذج" ل Morphogenesis التجويف بين الخلايا و في فيفو الاستقطاب نشوء غشاء حيوي على مستوى الخلايا المفردة: وضع العلامات تلطيخ جسم والخسارة [رني] من وظيفة تحليل وتصوير

الجيل الاختلالات الخلوية وسوبسيلولار، مثل تشكيل المجالات غشاء الاستقطاب، أهمية حاسمة في morphogenesis والوظيفة ل الخلايا والأنسجة والأعضاء¹. دراسات بشأن نشوء الاستقطاب غشاء حيوي في epithelia تبقى تحديا تقنيا، نظراً للتغييرات الاتجاه في توزيع مكونات سوبسيلولار تعتمد على متعددة متتالية وتزامنت خارج الخلية وداخل الخلية الإشارات التي من الصعب فصل في معظم النماذج وتعتمد بشدة على النظام النموذجي. النموذج المعروضة هنا-مفردة الطبقات الأمعاء ايليجانس كاينورهابديتيس -نسيج بساطة الرائعة. جنبا إلى جنب مع خلية واحدة قناة C. ايليجانس مطرح (انظر المصاحبة للورق في نشوء الاستقطاب غشاء حيوي في القناة مطرح C. ايليجانس )²، فإنه يوفر العديد من المزايا الفريدة لتحديد هوية و توصيف الجزيئات اللازمة لنشوء الاستقطاب غشاء حيوي. حفظ العظة الأقطاب الجزيئية من الخميرة لرجل جعل هذا الجهاز اللافقارية بسيطة ممتازة “في فيفو الأنسجة الدائرة” لمعالجة مسائل على قطبية الظهارية التي ذات صلة مباشرة بالنظام البشري، الذي لا يزال بعيد مجمع للسماح بتشريح المرئية لهذه الأحداث في الواحد الخلية المستوى في فيفو.

على الرغم من أن كانت متعددة الأقطاب المصانة العظة من مصفوفة اكستراسيلوار (1)، (2) غشاء البلازما وتقاطعات والاتجار حويصلية (3) داخل الخلايا المحددة³، المبادئ الأساسية لإدماجها في عملية نشوء حيوي الأغشية والأنسجة الظهارية الاستقطاب هو غير مفهومة⁴. نماذج خلية واحدة الكلاسيكية في فيفو (e.g.S. cerevisiae واقحه C. ايليجانس ) حددت الحرجة وكان لها دور أساسي في تحديد مبادئ انقسام الخلية الاستقطاب والاستقطاب الأمامي الخلفي قطبية المرتبطة بغشاء المحددات (جتباسيس/مركز السيطرة على الأمراض-42 الصغيرة، بارس معيبة التقسيم)^5،6، ولكنها تعتمد على التماثل الفريد كسر العظة (ندبة برعم، دخول الحيوانات المنوية) وتفتقر إلى المضمون مفرق المجالات غشاء أبيكوباسال، ويفترض أن أبيكوباسال داخل الخلايا المناظرة الفرز الآلية. معرفتنا الحالية المنظمة للاتجار بالاستقطاب في ابيثيليا، ولكن أساسا يعتمد على الزراعات الأحادية الثدييات في 2D⁷، التي تفتقر إلى الرموز خارج الخلية وإنمائية الفسيولوجية التي يمكن تغيير مواقف غشاء مجالات واتجاهات مسارات الاتجار (بتبديل من 2D إلى 3D في المختبر نظم الثقافة وحدها تكفي لعكس قطبية الغشاء في الخلايا مدكك (مدين-داربي الكلي الناب))⁸. في فيفو الدراسات الإنمائية في قطبية الظهارية في الكائنات اللافقارية نموذج أجريت في البداية في شقة ابيثيليا، على سبيل المثال في البشرة melanogaster المورفولوجية ، حيث أنها حددت مساهمة حاسمة من مفرق ديناميات الهجرة الخلية الاستقطاب وخلية ورقة حركة⁹، والاتجار بالأشخاص اندوسيتيك للأقطاب صيانة¹⁰. 3D في المختبر و في فيفو تحليل morphogenesis التجويف في epithelia أنبوبي في الخلايا مدكك والأمعاء C. ايليجانس ، حددت على التوالي، مؤخرا شرط الاتجار داخل الخلايا دي نوفو المجال (قمي) ونشوء حيوي التجويف وتحديد المواقع^11،،من¹²¹³. السمك من أنبوبي (مقابل مسطحة) الخلايا الظهارية ميزة لتحليل أوجه عدم التماثل سوبسيلولار 3D نظراً لأنه يسمح بتمييز بصرية متفوقة من غشاء قمي لومينال، وتقاطعات أبيكو الجانبية، والغشاء الجانبي، مواقف العضيات داخل الخلية. لهذه المزايا البصرية، يضيف الطراز C. ايليجانس فيفو في الإعداد والمحور التنموي، الشفافية والبساطة في خطة الهيئة، خلية ثابتة ومحددة بالنسب، التحليلي (الجينية) والمزايا الإضافية المبينة أدناه.

C. ايليجانس نفسها هي الدودة هيكل أنبوبي الشفافية والهندسة المعمارية البسيطة التي جعل أجهزتها الداخلية وبالمثل أنبوبي يمكن الوصول مباشرة إلى تحليل البصرية morphogenesis الأنبوبة والتجويف. العشرين خلايا الأمعاء (الخلايا 21 أو 22 في بعض الأحيان) في¹⁴ مشتقة من خلية واحدة السلف (ه) ووضع من ظهارة مزدوج الطبقات الالكترود خطوة واحدة، في أنبوب متناظرة ثنائيا من تسع حلقات INT (أربع خلايا في الحلقة الأولى؛ 1 الشكل التخطيطي)^14،،من¹⁵¹⁶. وقدم تحليل النسب والأنسجة في الأمعاء، يحدد في البداية البصريات نومارسكي عبر الهويات النووية¹⁷وفي وقت لاحق مجهرية الأسفار عبر أغشية المسمى، الحرجة ثاقبة في morphogenesis، في خاصة متطلبات خلية مستقلة والخلية غير ذاتية لاتجاهي خلية الانقسامات وحركات (مثلاً، الالكترود، عدم التماثل اليمين واليسار، وتناوب الأنبوب الأمامي والخلفي)^14،18 . مواصفات الخلية اندوديرمال المبكر وشبكة تنظيمية الجينات السيطرة على تطوير هذا الجهاز النموذجي الاستنساخ هي كذلك تتسم^19،20. هنا، ومع ذلك، ينصب التركيز على تحليل الغشاء الاستقطاب ونشوء حيوي التجويف في خلايا أنبوبية واحدة، والتباينات داخل الخلايا اندوميمبرانيس وبني سيتوسكيليتال والعضيات التي تصاحب هذه العملية. تيسير التحليل ببساطة هذا الأنبوب، حيث تواجه جميع الأغشية قمي (على مستوى ultrastructural الموقر قبل زغيبات) التجويف وتواجه جميع الأغشية القاعدية على سطح الأنبوب الخارجي، مع الأغشية الجانبية الاتصال ببعضها البعض، يفصل غشاء قمي بالوصلات (1 الشكل التخطيطي؛ وانظر المراجع (²¹من^16،) C. ايليجانس-منظمة معينة من ضيق ومكونات مفرق أدهيرينس). ومن ثم نشوء حيوي غشاء قمي المصادف morphogenesis التجويف. وعلاوة على ذلك، تقريب حجم الخلايا المعوية الكبار-الخلايا أكبر من هذه الحيوانات الصغيرة (باستثناء الخلية مطرح)-حجم خلية الثدييات، سمحت في فيفو البصرية تتبع العناصر سوبسيلولار، مثل حاول مسارات حويصلة، الذي عادة في المختبر في صحن ثقافة.

غرض هذا التحليل الخلوي وسوبسيلولار، وضع العلامات المناسبة أمر بالغ الأهمية. غشاء إندو أو البلازما المعوية المجالات، تقاطعات، سيتوسكيليتاليمكن تصور الهياكل ونوى وغيرها العضيات سوبسيلولار بوصفها مكوناتها الجزيئية المحددة. العديد من مكونات هذه تميزت ولا تزال تكتشف (الجدول 1 أمثلة قليلة ويشير إلى الموارد). على سبيل المثال، كانت جزيئات مختلفة التمييز بين المقصورات أنبوبي و/أو حويصلية من النظام اندوميمبراني المعوية، ولائحة غولجي عبر حويصلات غولجي وظيفة لغشاء البلازما، حددت²². المحددة البروتينات (فضلا عن الدهون والسكريات) يمكن أما أن المسمى مباشرة أو غير مباشرة عن طريق ربط البروتينات. ويركز هذا البروتوكول في الموقع الضد تلطيخ عينات ثابت، واحد من اثنين من تقنيات وضع العلامات القياسية (انظر الورقة المرفقة على توبولوجينيسيس قناة مطرح لوصف تقنية أخرى² – في فيفو وسم عن طريق اندماج بروتين فلوري-الذي يطبق مباشرة إلى الأمعاء؛ الجدول 2 يقدم أمثلة من المروجين الأمعاء الخاصة التي يمكن استخدامها لمحرك التعبير عن هذه البروتينات الانصهار للامعاء). مزدوجة أو متعددة العلامات مع أي نهج أو بمزيج من كلا زائد إضافية الكيميائية تلطيخ، يسمح القرار البصرية متعمقة أكبر ودراسة التغيرات المكانية والزمانية في التعريب المشارك وتوظيف محددة الجزيئات أو مكونات سوبسيلولار (الشكل 2). تثبيت البرنامج وتلطيخ الإجراءات الموضحة في الحفاظ على دعم البروتوكول هذا البروتين الفلورية الخضراء (بروتينات فلورية خضراء) وسم أثناء إجراءات إيمونوستينينج. للتصوير، مفتاح النقاط للكشف عن ووصف وصف توبولوجينيسيس تعمل عن طريق الإجراءات القياسية مجهرية (الأسفار [كنفوكل] وتشريح مجهرية) (، منالشكل 3 4). ويمكن تمديد هذه بدقة أعلى التصوير النهج، لمثيل سوبيريسولوشن المجهري وانتقال الميكروسكوب الإلكتروني (غير المذكورة هنا).

أن نقطة قوة رئيسية لهذا النظام هو القدرة على تحليل الأقطاب في الخلايا الفردية في مراحل إنمائية مختلفة، من امبريوجينيسيس من خلال مرحلة البلوغ. على سبيل المثال، يمكن تتبع نشوء حيوي المجال والتجويف غشاء قمي طوال التنمية على مستوى خلية واحدة عن طريق وضع العلامات مع إدارة مخاطر المؤسسات-1، رابط عاليا يحافظ غشاء-أكتين Ezrin-راديكسين-موسين الأسرة^23،24 . 1-إدارة مخاطر المؤسسات يتصور غشاء قمي نشوء حيوي (1) خلال أنبوب الجنينية morphogenesis، عندما يحدث متزامنا مع انقسام الخلية الاستقطاب والهجرة (نقل الخلايا من حولها التجويف خلال الالكترود)¹⁵؛ (2) خلال أواخر تمديد أنبوب الجنينية واليرقات التي تشرع في غياب انقسام الخلية أو الهجرة؛ و (3) في الأمعاء الكبار، حيث يتم الاحتفاظ بمجالات استقطاب غشاء (الشكل 1). في ظهارة اليرقات بعد الانقسامية الآخذة في التوسع، نوفو دي استقطاب الغشاء وبالتالي يمكن فصل نشوء حيوي من الأنسجة الاستقطاب morphogenesis، وغير ممكن في معظم النماذج قطبية الظهارية في الجسم الحي وفي المختبر ، بما في ذلك مع القرار خلية واحدة (مثل 3D مدكك كيسه نموذج⁸). مع وضع العلامات للمكونات الأخرى، يوفر هذا الإعداد الفرصة (لا سيما في المرحلة L1 اليرقات عندما يكون أعلى نسبة السيتوبلازم/نواة الخلايا) لتمييز تلك التغييرات داخل الخلايا الخاصة باستقطاب الغشاء نشوء حيوي ( مثل إعادة توجيه مسارات الاتجار) من تلك المطلوبة في الوقت ذاته لانقسام الخلية الاستقطاب والهجرة.

براعة الوراثية C. ايليجانس معروف²⁵ويجعل من نظام نموذج قوية للتحليل الجزيئي لأي مسألة بيولوجية. دراسة بشأن morphogenesis، على سبيل المثال، يمكن أن تبدأ مع سلالة البرية من نوع، سلالة محوره وراثيا حيث يسمى هيكل مصلحة (مثل غشاء) مع علامة مضيئة أو بخسارة أو الربح-من-وظيفة متحولة مع وجود خلل في هذا الهيكل. دراسة وراثية عكس نموذجية قد تولد متحولة حيث يتم حذف الجينات للفائدة في germline (مثلاً قبل حذف مستهدفة)، تعديل بواسطة الطفرات (عادة ما تنتج الطفرات مع ما يترتب عليه من خسائر أو الحد من مكاسب في الدالة من الجينات)، أو حيث ينخفض نسخة من [رني]. السهولة [رني] عن طريق تغذية في C. ايليجانس²⁶ كما يفسح لتصميم شاشات المستهدفة التي تدرس مجموعة أكبر من الجينات للفائدة. يمكن القول أن أعظم قوة كائن الطراز الوراثي هي القدرة على إجراء في فيفو الأمام شاشات (مثل الطفرات، شاشات [رني] منتظمة أو على نطاق الجينوم) التي تسمح بتحقيق غير منحازة في سبب الجزيئية النمط الظاهري الفائدة. على سبيل المثال، البصرية غير متحيزة [رني] C. ايليجانس توبولوجينيسيس الشاشة، بدءاً الحيوانات المحورة وراثيا مع إدارة مخاطر المؤسسات-1-المسمى الأغشية قمي، اكتشفت فضول قطبية المعوية عكسها التحويل والنمط الظاهري التجويف حمل خارج الرحم، تستخدم هنا كمثال لهذا النوع من التحليل. هذه الشاشة تحديد استنفاد جليكوسفينجوليبيدس (جسلس؛ الدهون غشاء تلزم، حددت عن طريق هذه الإنزيمات GLS-السكروز) ومكونات كلاثرين معطف حويصلة وبه محول AP-1 كالعيوب الجزيئية المحددة تسبب هذه الأقطاب وبذلك تميز هذه الاتجار الجزيئات في فيفو العظة تحويل النمط الظاهري، قطبية غشاء قمي والتجويف^12،13لتحديد المواقع. عندما بدءاً النمط الظاهري الطفرات وراثية محددة/morphogenesis، مثل شاشات (أو تجارب التفاعل الوراثية/[رني] مرة واحدة) يمكن أيضا دراسة التفاعلات الوظيفية بين اثنين أو متعددة الجينات للفائدة (انظر المصاحبة للورقة على مطرح قناة للحصول على مثال لمثل هذا التحليل)². ويركز هذا البروتوكول على [رني] الذي، بالإضافة إلى قدرتها على تحديد الجينات الخسارة التي يتسبب النمط الظاهري في الشاشات إلى الأمام، مباشرة ويوفر مزايا محددة لتحليل morphogenesis. منذ منتجات الجينات توجيه morphogenesis غالباً ما تعمل بطريقة تعتمد على الجرعة، عادة ما تكون ناجحة في توليد طائفة تعمل [رني]. القدرة على توليد المعلومات فقدان جزئي للدالة تعمل كما يساعد على معالجة هذه المشكلة أن غالبية الجينات توبولوجينيسيس مهمة ضرورية وأن خسائرهم تسبب العقم والفتك الجنينية المبكرة. هذا البروتوكول يتضمن الشرطي [رني] استراتيجيات للتغلب على هذه الصعوبة ويقترح سبلاً لتحسين توليد طائفة أوسع من تعمل، مثل سلسلة الاليلي الطفرات التي تنتجها.