Vurdering av Dopaminergic homeostase i mus ved bruk av høytytende flytende kromatografi analyse og Synaptosomal dopamin opptak
Summary
Synaptosomal dopamin opptak og høy ytelse flytende kromatografi representerer eksperimentelle verktøy undersøke dopamin homeostase i mus ved å vurdere funksjon av dopamin transporter og nivåer av dopamin i striatal vev, henholdsvis. Her presenterer vi for å måle dopamin vev innhold og vurdere funksjonaliteten til den dopamin transporter.
Abstract
Dopamin (DA) er en modulatory nevrotransmitter kontrollere motorisk aktivitet, belønningen prosesser og kognitiv funksjon. Nedskrivning av dopaminergic (DAergic) neurotransmission er sterkt assosiert med adskillige sentralnervesystemet-assosiert sykdomer slik som Parkinson’s sykdom, oppmerksomhet underskudd hyperaktivitet lidelse og narkotika avhengighet1,2 ,3,4. Skildre sykdom mekanismer som involverer DA ubalanse er kritisk avhengig dyremodeller å etterligne aspekter av sykdommer, og dermed protokoller som vurdere bestemte deler av DA homeostase er viktig å gi ny innsikt og mulig terapeutiske mål for disse sykdommene.
Her presenterer vi to nyttige eksperimentelle protokoller som sammen gir en funksjonell avlesing av DAergic systemet i mus. Biokjemiske og funksjonelle parametere for DA homeostase er innhentet gjennom vurdering av DA nivåer og dopamin transporter (DAT) funksjonaliteten5. Når du undersøker DA systemet, er muligheten til å måle pålitelig endogene av DA fra voksen hjernen avgjørende. Derfor presenterer vi utføre høy ytelse flytende kromatografi (HPLC) på hjernevev fra mus til å bestemme nivåer av DA. Vi utføre eksperimentet på vev fra dorsal striatum (dStr) og nucleus accumbens (NAc), men metoden er også egnet for andre DA-innerveres hjernen områder.
DAT er avgjørende for reopptak av DA inn i presynaptic terminalen, og dermed kontrollerer timelige og romlig aktiviteten til utgitt DA. Knowing nivåer og funksjonaliteten til DAT i striatum er svært viktig når du vurderer DA homeostase. Her gir vi en protokoll som tillater samtidig utlede informasjon om overflaten nivåer og funksjon med en synaptosomal6 DA opptaksanalyse.
Gjeldende metoder kombinert med standard immunoblotting protokoller gir de forsker med relevante verktøy betegner DAergic systemet.
Introduction
Dopamin (DA) er en modulatory nevrotransmitter kritiske motor, belønning og kognitiv funksjon1,7,8,9. Ubalanser i DA homeostase er innblandet i flere nevropsykiatriske sykdommer som oppmerksomhet underskudd hyperaktivitet disorder, narkotikaavhengighet, depresjon og Parkinsons sykdom1. DA er løslatt fra presynaptic Nevron i den synaptiske kløften, hvor det binder seg til og aktiverer reseptorer på membranen pre- og postsynaptic, og dermed ytterligere formidle signalet. Nivået av DA i synapse etter utgivelsen romlig og timelig styres av DAT3,10. Transporter sequesters DA fra ekstracellulære plass, og således opprettholder fysiologiske DA nivåer3,11. Genetisk fjerning av DAT i mus forårsaker en hyperdopaminergic fenotypen preget av synaptic DA forhøyde, uttømming intracellulær DA og dyptgripende endringer i postsynaptic DAergic signalisere10,12.
Her presenteres to separate protokoller, én metode for å måle DA vev innhold og en annen for å vurdere funksjonaliteten til DAT. kombinert med overflaten biotinylation analysen beskrevet av Gabriel et al.13 disse to metodene gir informasjon om DA innhold og funksjonelle nivåer av DAT for en grundig vurdering av DA homeostase. Med disse kan DA homeostase av ulike transgene mus eller sykdom modeller være preget og beskrevet. Disse verktøyene er implementert og optimalisert og vanlig bruk i våre laboratorier. Gjeldende analyser har tjent å undersøke konsekvensene på DA homeostase av endre C-terminalen DAT14 eller uttrykke grobunn recombinase under tyrosin hydroksylase (TH) promoter 5.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dette manuskriptet beskriver nyttig eksperimentelle protokoller for å avgrense DA homeostase i en musemodell av valget. Vi gir detaljert protokoller for måling nivåer av DA i hjernevevet fra mus bruker mye HPLC og synaptosomal DA opptak for å vurdere funksjonelle DA transport gjennom DAT. Prosedyrer, protokoller og grenser for HPLC eksperiment og synaptosomal DA opptaksanalyse vil utdypes under.
Synaptosomal opptak protokollen kan gi nyttig innsikt i funksjonaliteten for DAT. kombinert med…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbeidet ble støttet av UCPH 2016 Program of Excellence (UG, AR, K.J.), Lundbeck Foundation (Mr) Lundbeck Stiftelsen Center for cellemembraner i Nanomedicine (UG), National Institute for Health tilskudd P01 DA 12408 (UG), danske Rådet for uavhengig forskning – Medical Sciences (UG).
Materials
| COMT inhibitor | Sigma Aldrich, Germany | RO-41-0960 | For synaptosomal DA uptake protocol |
| [3H]-Dopamine | Perkin-Elmer Life Sciences, Boston, MA, USA | NET67-3001MC | For synaptosomal DA uptake protocol |
| Glass microfiber filters | GF/C Whatman, GE Healthcare Life Sciences, Buckinghamshire | 1822-024 | For synaptosomal DA uptake protocol |
| HiSafe Scintillation fluid | Perkin Elmer | 1200-437 | For synaptosomal DA uptake protocol |
| MicroBeta2 | Perkin Elmer | For synaptosomal DA uptake protocol | |
| BCA Protein Assay kit | Thermo Scientific Pierce | 23225 | For synaptosomal DA uptake protocol |
| HEPES | Sigma Life Science | H3375 | For synaptosomal DA uptake protocol |
| Sucrose | Sigma Life Science | S7903 | For synaptosomal DA uptake protocol |
| NaCl | Sigma Life Science | S3014 | For synaptosomal DA uptake protocol |
| KCl | Sigma Life Science | P9541 | For synaptosomal DA uptake protocol |
| CaCl2 | Merck KGaA | 10043-52-4 | For synaptosomal DA uptake protocol |
| MgSO4 | Sigma Life Science | 63065 | For synaptosomal DA uptake protocol |
| Ascorbic Acid | Sigma Life Science | A0278 | For synaptosomal DA uptake protocol |
| D-Glucose | Sigma Life Science | G7021 | For synaptosomal DA uptake protocol |
| Pargyline | Sigma Aldrich | P-8013 | For synaptosomal DA uptake protocol |
| Desipramine | Sigma Aldrich | D3900 | For synaptosomal DA uptake protocol |
| Dopamine | Sigma Life Science | H8502 | For synaptosomal DA uptake protocol |
| Cocaine | Sigma Life Science | C5776 | For synaptosomal DA uptake protocol |
| Brain matrix | ASI instruments | RBM2000C | For synaptosomal DA uptake protocol |
| Cafano mechanical teflon disrupter | Buch & Holm | Discontinued | For synaptosomal DA uptake protocol (homogenization) |
| Antec Decade (Amperometric detector) | Antec, Leiden, The Netherlands | Discontinued: new model DECADE Elite / Lite™ Electrochemical Detector type 175 and 176 | For HPLC protocol |
| Avantec 0.22 μm glass filter | Frisenette ApS, Denmark | 13CP020AS | For HPLC protocol |
| Column: Prodigy 3 μ ODS-3 C18 | Phenomenex, YMC Europe, Chermbeck, Germany | Part Number:00A-3300-E0 | For HPLC protocol |
| LC solution software | Shimadzu | LabSolutions Series Workstation | For HPLC protocol |
| Perchlor acid 0.1M | Fluka Analytical | 35418-500ml | For HPLC protocol (Tissue preparation) |
| EDTA | Sigma | E5134-50g | For HPLC protocol |
| Natriumdihydrogenphosphar | Bie&Berntsen | 1.06346 1000g | For HPLC protocol |
| Sodium 1-octanesulfonate monohydrate | Aldrich | 74885 -10g | For HPLC protocol |
| Acetonitrile, isocratic HPLC grade | Scharlau | AC03402500 | For HPLC protocol |
| Filtre 0.22um | Frisenette ApS, Denmark | Avantec 13CP020AS | For HPLC protocol (Tissue preparation) |
| ortho-Phosphoric acid 85% | Merck | 1.00563. 1000ml | For HPLC protocol |
| Electrode | Antec, Leiden, The Netherlands | AN1161300 | For HPLC protocol (see manual online) |
| Detector program on DECADE II electrochemical detector | Antec, Leiden, The Netherlands | Lite™ Electrochemical Detector type 175 and 176 | For HPLC protocol |
Referências
- Tritsch, N. X., Sabatini, B. L. Dopaminergic modulation of synaptic transmission in cortex and striatum. Neuron. 76, 33-50 (2012).
- Cartier, E. A., et al. A biochemical and functional protein complex involving dopamine synthesis and transport into synaptic vesicles. J Biol Chem. 285, 1957-1966 (2010).
- Kristensen, A. S., et al. SLC6 neurotransmitter transporters: structure, function, and regulation. Pharmacol Rev. 63, 585-640 (2011).
- Gainetdinov, R. R., Caron, M. G. Monoamine transporters: from genes to behavior. Annu Rev Pharmacol Toxicol. 43, 261-284 (2003).
- Runegaard, A. H., et al. Preserved dopaminergic homeostasis and dopamine-related behaviour in hemizygous TH-Cre mice. Eur J Neurosci. 45, 121-128 (2017).
- Whittaker, V. P., Michaelson, I. A., Kirkland, R. J. The separation of synaptic vesicles from nerve-ending particles (‘synaptosomes’). Biochem J. 90, 293-303 (1964).
- Hornykiewicz, O. Dopamine (3-hydroxytyramine) and brain function. Pharmacol Rev. 18, 925-964 (1966).
- Schultz, W. Behavioral dopamine signals. Trends Neurosci. 30, 203-210 (2007).
- Beaulieu, J. M., Gainetdinov, R. R. The physiology, signaling, and pharmacology of dopamine receptors. Pharmacol Rev. 63, 182-217 (2011).
- Giros, B., Jaber, M., Jones, S. R., Wightman, R. M., Caron, M. G. Hyperlocomotion and indifference to cocaine and amphetamine in mice lacking the dopamine transporter. Nature. 379, 606-612 (1996).
- Torres, G. E., Amara, S. G. Glutamate and monoamine transporters: new visions of form and function. Curr Opin Neurobiol. 17, 304-312 (2007).
- Jones, S. R., et al. Profound neuronal plasticity in response to inactivation of the dopamine transporter. Proc Natl Acad Sci U S A. 95, 4029-4034 (1998).
- Gabriel, L. R., Wu, S., Melikian, H. E. Brain slice biotinylation: an ex vivo approach to measure region-specific plasma membrane protein trafficking in adult neurons. J Vis Exp. , (2014).
- Rickhag, M., et al. A C-terminal PDZ domain-binding sequence is required for striatal distribution of the dopamine transporter. Nat Commun. 4, 1580 (2013).
- Dunkley, P. R., Jarvie, P. E., Robinson, P. J. A rapid Percoll gradient procedure for preparation of synaptosomes. Nat Protoc. 3, 1718-1728 (2008).
- Whittaker, V. P. Thirty years of synaptosome research. J Neurocytol. 22, 735-742 (1993).
- Schmitz, Y., Benoit-Marand, M., Gonon, F., Sulzer, D. Presynaptic regulation of dopaminergic neurotransmission. J Neurochem. 87, 273-289 (2003).
- Yang, L., Beal, M. F. Determination of neurotransmitter levels in models of Parkinson’s disease by HPLC-ECD. Methods Mol Biol. 793, 401-415 (2011).
- Earles, C., Schenk, J. O. Rotating disk electrode voltammetric measurements of dopamine transporter activity: an analytical evaluation. Anal Biochem. 264, 191-198 (1998).
- Wu, Q., Reith, M. E., Kuhar, M. J., Carroll, F. I., Garris, P. A. Preferential increases in nucleus accumbens dopamine after systemic cocaine administration are caused by unique characteristics of dopamine neurotransmission. J Neurosci. 21, 6338-6347 (2001).
- Schonfuss, D., Reum, T., Olshausen, P., Fischer, T., Morgenstern, R. Modelling constant potential amperometry for investigations of dopaminergic neurotransmission kinetics in vivo. J Neurosci Methods. 112, 163-172 (2001).
- Hoover, B. R., Everett, C. V., Sorkin, A., Zahniser, N. R. Rapid regulation of dopamine transporters by tyrosine kinases in rat neuronal preparations. J Neurochem. 101, 1258-1271 (2007).
- Hansen, F. H., et al. Missense dopamine transporter mutations associate with adult parkinsonism and ADHD. J Clin Invest. 124, 3107-3120 (2014).
- Damier, P., Hirsch, E. C., Agid, Y., Graybiel, A. M. The substantia nigra of the human brain. II. Patterns of loss of dopamine-containing neurons in Parkinson’s disease. Brain. 122 (Pt 8), 1437-1448 (1999).
- Atack, C. V. The determination of dopamine by a modification of the dihydroxyindole fluorimetric assay. Br J Pharmacol. 48, 699-714 (1973).
- Yoshitake, T., et al. High-sensitive liquid chromatographic method for determination of neuronal release of serotonin, noradrenaline and dopamine monitored by microdialysis in the rat prefrontal cortex. J Neurosci Methods. 140, 163-168 (2004).
- Decressac, M., Mattsson, B., Lundblad, M., Weikop, P., Bjorklund, A. Progressive neurodegenerative and behavioural changes induced by AAV-mediated overexpression of alpha-synuclein in midbrain dopamine neurons. Neurobiol Dis. 45, 939-953 (2012).
- Huot, P., Johnston, T. H., Koprich, J. B., Fox, S. H., Brotchie, J. M. L-DOPA pharmacokinetics in the MPTP-lesioned macaque model of Parkinson’s disease. Neuropharmacology. 63, 829-836 (2012).
- Mikkelsen, M., et al. MPTP-induced Parkinsonism in minipigs: A behavioral, biochemical, and histological study. Neurotoxicol Teratol. 21, 169-175 (1999).
- Salvatore, M. F., Pruett, B. S., Dempsey, C., Fields, V. Comprehensive profiling of dopamine regulation in substantia nigra and ventral tegmental area. J Vis Exp. , (2012).
- Van Dam, D., et al. Regional distribution of biogenic amines, amino acids and cholinergic markers in the CNS of the C57BL/6 strain. Amino Acids. 28, 377-387 (2005).
- Barth, C., Villringer, A., Sacher, J. Sex hormones affect neurotransmitters and shape the adult female brain during hormonal transition periods. Front Neurosci. 9 (37), (2015).
- Corthell, J. T., Stathopoulos, A. M., Watson, C. C., Bertram, R., Trombley, P. Q. Olfactory bulb monoamine concentrations vary with time of day. Neurociência. 247, 234-241 (2013).
- Zhuang, X., et al. Hyperactivity and impaired response habituation in hyperdopaminergic mice. Proc Natl Acad Sci U S A. 98, 1982-1987 (2001).
- Ungerstedt, U., Pycock, C. Functional correlates of dopamine neurotransmission. Bull Schweiz Akad Med Wiss. 30, 44-55 (1974).
- Wickham, R. J., Park, J., Nunes, E. J., Addy, N. A. Examination of Rapid Dopamine Dynamics with Fast Scan Cyclic Voltammetry During Intra-oral Tastant Administration in Awake Rats. J Vis Exp. , e52468 (2015).
- Phillips, P. E., Robinson, D. L., Stuber, G. D., Carelli, R. M., Wightman, R. M. Real-time measurements of phasic changes in extracellular dopamine concentration in freely moving rats by fast-scan cyclic voltammetry. Methods Mol Med. 79, 443-464 (2003).
- Callaghan, P. D., Irvine, R. J., Daws, L. C. Differences in the in vivo dynamics of neurotransmitter release and serotonin uptake after acute para-methoxyamphetamine and 3,4-methylenedioxymethamphetamine revealed by chronoamperometry. Neurochem Int. 47, 350-361 (2005).
