הערכה של דופאמין הומאוסטזיס בעכברים באמצעות ניתוח ביצועים גבוהים כרומטוגרפיה נוזלית, דופמין Synaptosomal ספיגת
Summary
ספיגת דופמין synaptosomal ו כרומטוגרפיה נוזלית ביצועים גבוהים ניתוח מייצגים ניסוי כלים לחקור דופמין הומאוסטזיס בעכברים על-ידי הערכת את הפונקציה של המשגר דופמין, רמות הדופמין ברקמת striatal, בהתאמה. כאן אנו מציגים פרוטוקולים למדוד דופמין רקמות תוכן, להעריך את הפונקציונליות של המשגר דופמין.
Abstract
דופמין (DA) הוא נוירוטרנסמיטור modulatory שליטה פעילות מוטורית, תהליכים גמול ועל התפקוד הקוגניטיבי. ירידת ערך של דופאמין (DAergic) עצבית הוא קשור מאוד עם מספר מחלות הקשורות במערכת העצבים המרכזית כגון מחלת פרקינסון, תשומת לב-קשב-היפראקטיביות וסמים התמכרות1,2 3, ,4. בהתוויית מנגנוני המחלה מעורבים דה איזון תלויה באופן ביקורתי מודלים בעלי חיים כדי לחקות את ההיבטים של המחלות, ובכך פרוטוקולים של להעריך חלקים ספציפיים של הומאוסטזיס DA חשובים לספק תובנות הרומן האפשר טיפולית מטרות עבור מחלות אלו.
כאן, אנו מציגים שני פרוטוקולים ניסיוני שימושי זה בשילוב לספק read-out תפקודית של מערכת DAergic בעכברים. פרמטרים ביוכימיים ופונקציונליים על הומאוסטזיס DA מתקבלים באמצעות הערכה של DA רמות דופמין טרנספורטר (. DAT) פונקציונליות5. כאשר חוקרים את מערכת DA, היכולת למדוד באופן מהימן רמות אנדוגני של DA מהמוח למבוגרים הוא חיוני. לכן, אנו מציגים כיצד לבצע ביצועים גבוהים כרומטוגרפיה נוזלית (HPLC) על רקמת המוח של עכברים כדי לקבוע רמות של המחוזי. אנו מבצעים את הניסוי על רקמות הגבי סטריאטום (dStr), גרעין האקומבנס (NAc), אך השיטה מתאים גם באזורים אחרים במוח דה-innervated.
DAT הוא חיוני עבור ספיגה חוזרת של DA בטרמינל presynaptic, ובכך שולט הפעילות הגיאופוליטיות והמרחביות הטמפורלי של המחוזי שפורסמו לדעת את רמות והפונקציונליות של DAT ב סטריאטום זה חשיבות רבה בעת הערכת DA הומאוסטזיס. כאן, אנו מספקים פרוטוקול המאפשר להסיק מידע על פני רמות ותפקוד שימוש assay ספיגת של synaptosomal6 DA בו זמנית.
שיטות בשילוב עם פרוטוקולים סטנדרטיים immunoblotting מספקים החוקר עם כלים רלוונטיים כדי לאפיין את המערכת DAergic.
Introduction
דופמין (DA) הוא נוירוטרנסמיטור modulatory קריטי עבור התנהגות מוטורית, פרס, התפקוד הקוגניטיבי1,7,8,9. חוסר איזון ב- DA הומאוסטזיס הם מעורבים מספר מחלות מנוטלי כמו הפרעת קשב-קשב, התמכרות לסמים, דיכאון, מחלת פרקינסון1. DA משוחרר מן הנוירון presynaptic לתוך החריץ סינפטית, איפה זה נקשר ומפעילה רצפטורים על קרום קדם ו postsynaptic, ובכך נוסף העברת האות. הרמה דה ב הסינפסה לאחר שחרור במרחב של חנותם נשלטת על ידי DAT3,10. המשגר מרחיק דא מן המרחב חוץ-תאית, ובכך ומקיימת פיזיולוגיים DA רמות3,11. הסרת גנטי של DAT בעכברים גורמת פנוטיפ hyperdopaminergic מאופיין על ידי רמות גבוהות DA סינפטית, דלדול של בריכות DA תאיים ושינויים עמוקה DAergic postsynaptic איתות10,12.
. הנה, שני פרוטוקולים נפרדים מוצגים, שיטה אחת מדד דה רקמות התוכן של אחר כדי להעריך את הפונקציונליות של במבטאו משולבים עם וזמינותו biotinylation פני השטח המתואר על ידי גבריאל ואח13 שתי שיטות אלו מספקים מידע אודות DA תוכני ופונקציונאלי רמות של DAT הערכה יסודית של DA הומאוסטזיס. באמצעות שיטות אלה DA הומאוסטזיס של העכברים הטרנסגניים או מחלת מודלים שונים יכול להיות מאופיין, תיאר. כלים אלו מיושמות, מותאם הן שימוש רגיל במעבדות שלנו. מבחני הנוכחי שמשו לחקור את ההשלכות על הומאוסטזיס DA של שינוי על C-הטרמינל DAT14 ולהבעת Cre recombinase תחת טירוזין hydroxylase (ה) יזם 5.
Protocol
Representative Results
Discussion
כתב יד זה מתאר שימושי פרוטוקולים ניסיוני ניסחו DA הומאוסטזיס כל דגם העכבר של בחירה. אנו מספקים פרוטוקולים מפורט עבור מדידת רמות של DA ברקמת המוח של עכברים באמצעות HPLC ספיגת DA synaptosomal כדי להעריך פונקציונלי DA התחבורה באמצעות ידיים למעלה הנהלים, הפרוטוקולים ואת מגבלות עבור ניסוי HPLC ו synaptosomal assay ס…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי המצוינות של התוכנית 2016 (U.G., ע. ר, K.J.) UCPH, קרן לונדבק (M.R.) קרן לונדבק המרכז Biomembranes של ננו-רפואה (U.G.), לאומי המכון של בריאות מענקים P01 התובע 12408 (U.G.), הדנית המועצה מחקר עצמאי – מדעי הרפואה (U.G.).
Materials
| COMT inhibitor | Sigma Aldrich, Germany | RO-41-0960 | For synaptosomal DA uptake protocol |
| [3H]-Dopamine | Perkin-Elmer Life Sciences, Boston, MA, USA | NET67-3001MC | For synaptosomal DA uptake protocol |
| Glass microfiber filters | GF/C Whatman, GE Healthcare Life Sciences, Buckinghamshire | 1822-024 | For synaptosomal DA uptake protocol |
| HiSafe Scintillation fluid | Perkin Elmer | 1200-437 | For synaptosomal DA uptake protocol |
| MicroBeta2 | Perkin Elmer | For synaptosomal DA uptake protocol | |
| BCA Protein Assay kit | Thermo Scientific Pierce | 23225 | For synaptosomal DA uptake protocol |
| HEPES | Sigma Life Science | H3375 | For synaptosomal DA uptake protocol |
| Sucrose | Sigma Life Science | S7903 | For synaptosomal DA uptake protocol |
| NaCl | Sigma Life Science | S3014 | For synaptosomal DA uptake protocol |
| KCl | Sigma Life Science | P9541 | For synaptosomal DA uptake protocol |
| CaCl2 | Merck KGaA | 10043-52-4 | For synaptosomal DA uptake protocol |
| MgSO4 | Sigma Life Science | 63065 | For synaptosomal DA uptake protocol |
| Ascorbic Acid | Sigma Life Science | A0278 | For synaptosomal DA uptake protocol |
| D-Glucose | Sigma Life Science | G7021 | For synaptosomal DA uptake protocol |
| Pargyline | Sigma Aldrich | P-8013 | For synaptosomal DA uptake protocol |
| Desipramine | Sigma Aldrich | D3900 | For synaptosomal DA uptake protocol |
| Dopamine | Sigma Life Science | H8502 | For synaptosomal DA uptake protocol |
| Cocaine | Sigma Life Science | C5776 | For synaptosomal DA uptake protocol |
| Brain matrix | ASI instruments | RBM2000C | For synaptosomal DA uptake protocol |
| Cafano mechanical teflon disrupter | Buch & Holm | Discontinued | For synaptosomal DA uptake protocol (homogenization) |
| Antec Decade (Amperometric detector) | Antec, Leiden, The Netherlands | Discontinued: new model DECADE Elite / Lite™ Electrochemical Detector type 175 and 176 | For HPLC protocol |
| Avantec 0.22 μm glass filter | Frisenette ApS, Denmark | 13CP020AS | For HPLC protocol |
| Column: Prodigy 3 μ ODS-3 C18 | Phenomenex, YMC Europe, Chermbeck, Germany | Part Number:00A-3300-E0 | For HPLC protocol |
| LC solution software | Shimadzu | LabSolutions Series Workstation | For HPLC protocol |
| Perchlor acid 0.1M | Fluka Analytical | 35418-500ml | For HPLC protocol (Tissue preparation) |
| EDTA | Sigma | E5134-50g | For HPLC protocol |
| Natriumdihydrogenphosphar | Bie&Berntsen | 1.06346 1000g | For HPLC protocol |
| Sodium 1-octanesulfonate monohydrate | Aldrich | 74885 -10g | For HPLC protocol |
| Acetonitrile, isocratic HPLC grade | Scharlau | AC03402500 | For HPLC protocol |
| Filtre 0.22um | Frisenette ApS, Denmark | Avantec 13CP020AS | For HPLC protocol (Tissue preparation) |
| ortho-Phosphoric acid 85% | Merck | 1.00563. 1000ml | For HPLC protocol |
| Electrode | Antec, Leiden, The Netherlands | AN1161300 | For HPLC protocol (see manual online) |
| Detector program on DECADE II electrochemical detector | Antec, Leiden, The Netherlands | Lite™ Electrochemical Detector type 175 and 176 | For HPLC protocol |
Referências
- Tritsch, N. X., Sabatini, B. L. Dopaminergic modulation of synaptic transmission in cortex and striatum. Neuron. 76, 33-50 (2012).
- Cartier, E. A., et al. A biochemical and functional protein complex involving dopamine synthesis and transport into synaptic vesicles. J Biol Chem. 285, 1957-1966 (2010).
- Kristensen, A. S., et al. SLC6 neurotransmitter transporters: structure, function, and regulation. Pharmacol Rev. 63, 585-640 (2011).
- Gainetdinov, R. R., Caron, M. G. Monoamine transporters: from genes to behavior. Annu Rev Pharmacol Toxicol. 43, 261-284 (2003).
- Runegaard, A. H., et al. Preserved dopaminergic homeostasis and dopamine-related behaviour in hemizygous TH-Cre mice. Eur J Neurosci. 45, 121-128 (2017).
- Whittaker, V. P., Michaelson, I. A., Kirkland, R. J. The separation of synaptic vesicles from nerve-ending particles (‘synaptosomes’). Biochem J. 90, 293-303 (1964).
- Hornykiewicz, O. Dopamine (3-hydroxytyramine) and brain function. Pharmacol Rev. 18, 925-964 (1966).
- Schultz, W. Behavioral dopamine signals. Trends Neurosci. 30, 203-210 (2007).
- Beaulieu, J. M., Gainetdinov, R. R. The physiology, signaling, and pharmacology of dopamine receptors. Pharmacol Rev. 63, 182-217 (2011).
- Giros, B., Jaber, M., Jones, S. R., Wightman, R. M., Caron, M. G. Hyperlocomotion and indifference to cocaine and amphetamine in mice lacking the dopamine transporter. Nature. 379, 606-612 (1996).
- Torres, G. E., Amara, S. G. Glutamate and monoamine transporters: new visions of form and function. Curr Opin Neurobiol. 17, 304-312 (2007).
- Jones, S. R., et al. Profound neuronal plasticity in response to inactivation of the dopamine transporter. Proc Natl Acad Sci U S A. 95, 4029-4034 (1998).
- Gabriel, L. R., Wu, S., Melikian, H. E. Brain slice biotinylation: an ex vivo approach to measure region-specific plasma membrane protein trafficking in adult neurons. J Vis Exp. , (2014).
- Rickhag, M., et al. A C-terminal PDZ domain-binding sequence is required for striatal distribution of the dopamine transporter. Nat Commun. 4, 1580 (2013).
- Dunkley, P. R., Jarvie, P. E., Robinson, P. J. A rapid Percoll gradient procedure for preparation of synaptosomes. Nat Protoc. 3, 1718-1728 (2008).
- Whittaker, V. P. Thirty years of synaptosome research. J Neurocytol. 22, 735-742 (1993).
- Schmitz, Y., Benoit-Marand, M., Gonon, F., Sulzer, D. Presynaptic regulation of dopaminergic neurotransmission. J Neurochem. 87, 273-289 (2003).
- Yang, L., Beal, M. F. Determination of neurotransmitter levels in models of Parkinson’s disease by HPLC-ECD. Methods Mol Biol. 793, 401-415 (2011).
- Earles, C., Schenk, J. O. Rotating disk electrode voltammetric measurements of dopamine transporter activity: an analytical evaluation. Anal Biochem. 264, 191-198 (1998).
- Wu, Q., Reith, M. E., Kuhar, M. J., Carroll, F. I., Garris, P. A. Preferential increases in nucleus accumbens dopamine after systemic cocaine administration are caused by unique characteristics of dopamine neurotransmission. J Neurosci. 21, 6338-6347 (2001).
- Schonfuss, D., Reum, T., Olshausen, P., Fischer, T., Morgenstern, R. Modelling constant potential amperometry for investigations of dopaminergic neurotransmission kinetics in vivo. J Neurosci Methods. 112, 163-172 (2001).
- Hoover, B. R., Everett, C. V., Sorkin, A., Zahniser, N. R. Rapid regulation of dopamine transporters by tyrosine kinases in rat neuronal preparations. J Neurochem. 101, 1258-1271 (2007).
- Hansen, F. H., et al. Missense dopamine transporter mutations associate with adult parkinsonism and ADHD. J Clin Invest. 124, 3107-3120 (2014).
- Damier, P., Hirsch, E. C., Agid, Y., Graybiel, A. M. The substantia nigra of the human brain. II. Patterns of loss of dopamine-containing neurons in Parkinson’s disease. Brain. 122 (Pt 8), 1437-1448 (1999).
- Atack, C. V. The determination of dopamine by a modification of the dihydroxyindole fluorimetric assay. Br J Pharmacol. 48, 699-714 (1973).
- Yoshitake, T., et al. High-sensitive liquid chromatographic method for determination of neuronal release of serotonin, noradrenaline and dopamine monitored by microdialysis in the rat prefrontal cortex. J Neurosci Methods. 140, 163-168 (2004).
- Decressac, M., Mattsson, B., Lundblad, M., Weikop, P., Bjorklund, A. Progressive neurodegenerative and behavioural changes induced by AAV-mediated overexpression of alpha-synuclein in midbrain dopamine neurons. Neurobiol Dis. 45, 939-953 (2012).
- Huot, P., Johnston, T. H., Koprich, J. B., Fox, S. H., Brotchie, J. M. L-DOPA pharmacokinetics in the MPTP-lesioned macaque model of Parkinson’s disease. Neuropharmacology. 63, 829-836 (2012).
- Mikkelsen, M., et al. MPTP-induced Parkinsonism in minipigs: A behavioral, biochemical, and histological study. Neurotoxicol Teratol. 21, 169-175 (1999).
- Salvatore, M. F., Pruett, B. S., Dempsey, C., Fields, V. Comprehensive profiling of dopamine regulation in substantia nigra and ventral tegmental area. J Vis Exp. , (2012).
- Van Dam, D., et al. Regional distribution of biogenic amines, amino acids and cholinergic markers in the CNS of the C57BL/6 strain. Amino Acids. 28, 377-387 (2005).
- Barth, C., Villringer, A., Sacher, J. Sex hormones affect neurotransmitters and shape the adult female brain during hormonal transition periods. Front Neurosci. 9 (37), (2015).
- Corthell, J. T., Stathopoulos, A. M., Watson, C. C., Bertram, R., Trombley, P. Q. Olfactory bulb monoamine concentrations vary with time of day. Neurociência. 247, 234-241 (2013).
- Zhuang, X., et al. Hyperactivity and impaired response habituation in hyperdopaminergic mice. Proc Natl Acad Sci U S A. 98, 1982-1987 (2001).
- Ungerstedt, U., Pycock, C. Functional correlates of dopamine neurotransmission. Bull Schweiz Akad Med Wiss. 30, 44-55 (1974).
- Wickham, R. J., Park, J., Nunes, E. J., Addy, N. A. Examination of Rapid Dopamine Dynamics with Fast Scan Cyclic Voltammetry During Intra-oral Tastant Administration in Awake Rats. J Vis Exp. , e52468 (2015).
- Phillips, P. E., Robinson, D. L., Stuber, G. D., Carelli, R. M., Wightman, R. M. Real-time measurements of phasic changes in extracellular dopamine concentration in freely moving rats by fast-scan cyclic voltammetry. Methods Mol Med. 79, 443-464 (2003).
- Callaghan, P. D., Irvine, R. J., Daws, L. C. Differences in the in vivo dynamics of neurotransmitter release and serotonin uptake after acute para-methoxyamphetamine and 3,4-methylenedioxymethamphetamine revealed by chronoamperometry. Neurochem Int. 47, 350-361 (2005).
