En Guide till produktion, kristallisering och strukturbestämning av mänskliga IKK1/α
Summary
IκB Kinase 1/α (IKK1/α CHUK) är en Ser/Thr proteinkinas som är inblandad i en myriad av cellulära aktiviteter främst genom aktivering av NF-κB transkriptionsfaktorer. Här beskriver vi de viktigaste stegen som krävs för produktion och crystal strukturbestämning av detta protein.
Abstract
En klass av extracellulära stimuli kräver aktivering av IKK1/α att inducera generation av en NF-κB subenhet, p52, genom bearbetning av dess föregångare p100. P52 fungerar som en homodimer eller en heterodimer med en annan NF-κB subenhet, RelB. Dessa dimerer reglerar i sin tur uttrycket av hundratals gener involverade i inflammation, cellöverlevnad och cellcykeln. IKK1/α återstår primärt associerade med IKK2/β och NEMO som en ternär komplex. Dock har en liten pool av det också observerats som en låg molekylvikt complex(es). Det är okänt om p100 bearbetning aktiviteten utlöses av aktivering av IKK1/α inom den större eller mindre komplexa poolen. Konstituerande aktiviteten av IKK1/α har upptäckts i flera cancer och inflammatoriska sjukdomar. För att förstå mekanismen för aktivering av IKK1/α och aktivera dess användning som drog mål, vi uttryckte rekombinant IKK1/α i olika värdsystem, exempelvis E. coli, insekt, och däggdjursceller. Vi lyckats uttrycka lösliga IKK1/α i baculoviridae infekterade insekt celler, att erhålla mg mängder mycket rent protein, utkristalliseras det i närvaro av hämmare och bestämma dess röntgen kristallstruktur. Här beskriver vi de detaljerade anvisningarna för att producera rekombinant protein, dess kristallisering och dess röntgen kristall struktur beslutsamhet.
Introduction
Transkriptionell aktiviteter i familjen NF-κB dimeriskt transkriptionsfaktorer som krävs för olika cellulära funktioner alltifrån inflammation och immunitet till överlevnad och död. Dessa aktiviteter är strikt kontrollerade i celler och en förlust av förordning leder till olika sjukdomstillstånd, inklusive autoimmuna sjukdomar och cancer1,2,3. I avsaknad av ett stimulus hålls NF-κB verksamhet hämmade av IκB (hämmare av – κB) proteiner4. Fosforyleringen av specifika Ser rester på IκB proteiner markerar dem för ubikvitinering och efterföljande proteasomen nedbrytning eller selektiv bearbetning5. Två mycket homologa Ser/Thr kinaser, IKK2/β och IKK1/α, fungera som central regulatorer av NF-κB aktiviteter genom att utföra dessa fosforylering händelser6,7.
Interaktioner mellan en ligand och en receptor transduces en signal genom en serie av mediatorer som leder till aktivering av NF-κB faktorer. NF-κB signalering processen kan i huvudsak delas in i två distinkta vägar – kanoniska och icke-kanoniska (alternativa)8. Aktiviteten av IKK2/β reglerar främst NF-κB signaleringen av canonical-vägen som är väsentlig för inflammatoriska och medfödda immunsvar9. Ett distinkt inslag i denna väg är en snabb och kortvarig aktivering av IKK2/β10 inom en hittills biokemiskt uncharacterized IKK komplexa — förmodas vara sammansatt av IKK1 och IKK2, samt en reglerande komponent, NEMO (NF-κB viktig Modulator )11,12,13. Mellan två katalytisk IKK subunitsna av komplexet IKK, IKK2 är primärt ansvarig14 för fosforyleringen av specifika rester av prototypiska IκBs (α, – β, & -γ) bundna till NF-κB och också en atypisk IκB protein, NF-κB1/p105, vilket är en föregångare av NF-κB p50 subenhet5. Fosforylering inducerad ubikvitinering och proteasomen nedbrytning av IκB (eller bearbetning av p105) leder till frigörande och aktivering av en specifik uppsättning av NF-κB dimerer15. Avvikande NF-κB aktivitet på grund av mis reglerad funktion av IKK2 har observerats i många cancerformer samt som autoimmuna sjukdomar2,3,16.
I motsats till IKK2/β reglerar aktiviteten av IKK1/α NF-κB signalering av icke-kanoniska väg, vilket är nödvändigt för utveckling och immunitet. IKK1 phosphorylates specifika rester av NF-κB2/p100 på sitt C-terminal IκBδ segment, vilket leder till dess bearbetning och generering av p52. Bildandet av transcriptionally aktiva p52:RelB heterodimer initierar en långsam och ihållande svar till utvecklingsmässiga signaler7,17,18,19,20. Intressant, är generering av den centrala NF-κB faktor p52 av denna väg kritiskt beroende av en annan faktor, NF-κB inducerande Kinase (NIK)21,22, men inte på IKK2 eller NEMO. I vilande celler, NIK är fortsatt låg på grund av dess konstant proteasom-beroende nedbrytning23,24,25. Vid stimulering av celler av ‘icke-kanoniska’ ligander och i vissa maligna celler, NIK blir stabiliserad för att rekrytera och aktivera IKK1 / α. Kinas verksamheter av både NIK och IKK1 är avgörande för effektiv bearbetning av p100 till p527. IKK1 och NIK fosforylera tre serines (Ser866, 870 och 872) av NF-κB2/p100 på sitt C-terminal IκBδ segment leder till dess bearbetning och generering av p52. Avvikande aktivering av den icke-kanoniska vägen har varit inblandad i många maligniteter inklusive multipelt myelom26,27,28.
Flera mycket effektiv och specifika hämmare för IKK2/β är kända, även om ingen har hittills visat sig vara ett effektivt läkemedel. Däremot är IKK1/α-specifika hämmare gles. Detta kan bero dels från vår brist på strukturella och biokemiska information på IKK1/α, som begränsar vår förståelse av den mekanistiska grunden för aktivering av NF-κB av IKK1 i celler och rationell läkemedelsdesign. Röntga strukturerar av IKK2/β gett oss insikter om aktiveringsmekanismen av IKK2/β29; dessa strukturer kan dock inte avslöja hur olika uppströms stimuli utlösa aktivering av IKK1/α eller IKK2/β för att reglera olika uppsättningar av NF-κB verksamhet 30,31. Att förstå den mekanistiska grunden underliggande funktionen distinct signalering av IKK1/α, och att inrätta en plattform för rationell läkemedelsdesign, fokuserade vi på att bestämma strukturen av IKK1/α.
Protocol
Representative Results
Discussion
Produktion, kristallisering och struktur lösning av två relaterade IKK proteiner
Vi fastställde för att bestämma röntgen kristallstrukturen av IKK1/α med uppfattningen att det skulle vara en relativt enkel övning som gett vår erfarenhet med IKK2/β proteinproduktion, kristallisering och strukturbestämning. Vi var dock mycket förvånad över att dessa två relaterade proteiner betett sig mycket annorlunda när det gäller användarvänlighet kristallisering. Trots ansträngningar från flera…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi vill tacka Personalen på de linjer 19ID, 24ID och 13ID på Advanced Photon Source, Lemont, IL, för stöd under datainsamlingen på olika kristaller. Vi är tacksamma mot Dmitry Lyumkis, Salk Institute för att hämta oss låg upplösning cryo-EM karta i tidiga skeden av EM karta/modellbygge, som användes till att bygga den första IKK1 molekylära ersättning Sök modellen. Den forskning som leder till dessa resultat har fått finansiering från NIH grants AI064326, CA141722 och GM071862 till GG. SP är för närvarande en Wellcome Trust DBT Indien mellanliggande Karl.
Materials
| Cellfectin/Cellfectin II | Thermo Fisher Scientific | 10362100 | Cellfectin is now discontinued, replaced by Cellfectin II |
| Sf900 III Insect cell medium | Thermo Fisher Scientific | 12658-027 | |
| SF9 cells | Thermo Fisher Scientific | 12659017 | |
| anti-IKK1 antibody | Novus Biologicals | NB100-56704 | Previously sold by Imgenex |
| anti-PentaHis antibody | Qiagen | 34460 | |
| PVDF membrane | Millipore | IPVH00010 | Nitrocellulose can also be used |
| Ni-NTA agarose | Qiagen | 30210 | |
| Bradford assay reagent | BioRad | 500001 | |
| Superdex 200 column | GE Healthcare | 28989335 | |
| Amicon concentrator | Millipore | UFC801008, UFC803008, UFC201024, UFC203024 | |
| Compound A | Bayer | ||
| Calbiochem IKK-inhibitor XII | Calbiochem | 401491 | |
| Staurosporine | SIGMA | S4400 | |
| MLN120B | Millenium | Gift item | |
| AMPPNP | SIGMA | A2647 | |
| Dextran sulfate | SIGMA | 51227, 42867, 31404, | |
| Dextran sulfate | Alfa Aesar | J62101 | |
| PEG | SIGMA | 93593, 81210, 88276, 95904, 81255, 89510, 92897, 81285, 95172 | Some of them are new Cat # on SIGMA catalogue. What we had was originally from Fluka that had different Cat #. |
| Crystallization Screens | |||
| Crystal Screen I and II (Crystal Screen HT) | Hampton Research | HR2-130 | |
| Index HT | Hampton Research | HR2-134 | |
| PEG/Ion and PEG/Ion2 (PEG/Ion HT) | Hampton Research | HR2-139 | |
| PEGRX 1 and PEGRx 2 (PEGRx HT) | Hampton Research | HR2-086 | |
| SaltRx 1 and SaltRx 2 (SaltRx HT) | Hampton Research | HR2-136 | |
| Crystal mounts | Hampton Research | HR8-188, 190, 192, 194 | |
| Synchrotron | The Advanced Photon Source (APS) at the U.S. Department of Energy’s Argonne National Laboratory | Beamline 19 ID | The Advanced Photon Source (APS) at the U.S. Department of Energy’s Argonne National Laboratory provides ultra-bright, high-energy storage ring-generated X-ray beams for research in almost all scientific disciplines. |
Referências
- Xia, Y., Shen, S., Verma, I. M. NF-kappaB, an active player in human cancers. Cancer immunology research. 2 (9), 823-830 (2014).
- Grivennikov, S. I., Greten, F. R., Karin, M. Immunity, inflammation, and cancer. Cell. 140 (6), 883-899 (2010).
- Ben-Neriah, Y., Karin, M. Inflammation meets cancer, with NF-kappaB as the matchmaker. Nature immunology. 12 (8), 715-723 (2011).
- Hinz, M., Scheidereit, C. The IkappaB kinase complex in NF-kappaB regulation and beyond. EMBO reports. 15 (1), 46-61 (2014).
- Karin, M., Ben-Neriah, Y. Phosphorylation meets ubiquitination: the control of NF-[kappa]B activity. Annu Rev Immunol. 18, 621-663 (2000).
- Ghosh, S., Karin, M. Missing pieces in the NF-kappaB puzzle. Cell. 109, S81-S96 (2002).
- Sun, S. C. The noncanonical NF-kappaB pathway. Immunol Rev. 246 (1), 125-140 (2012).
- Bonizzi, G., Karin, M. The two NF-kappaB activation pathways and their role in innate and adaptive immunity. Trends Immunol. 25 (6), 280-288 (2004).
- DiDonato, J. A., Hayakawa, M., Rothwarf, D. M., Zandi, E., Karin, M. A cytokine-responsive IkappaB kinase that activates the transcription factor NF-kappaB. Nature. 388 (6642), 548-554 (1997).
- Werner, S. L., Barken, D., Hoffmann, A. Stimulus specificity of gene expression programs determined by temporal control of IKK activity. Science. 309 (5742), 1857-1861 (2005).
- Zandi, E., Rothwarf, D. M., Delhase, M., Hayakawa, M., Karin, M. The IkappaB kinase complex (IKK) contains two kinase subunits, IKKalpha and IKKbeta, necessary for IkappaB phosphorylation and NF-kappaB activation. Cell. 91 (2), 243-252 (1997).
- Rothwarf, D. M., Zandi, E., Natoli, G., Karin, M. IKK-gamma is an essential regulatory subunit of the IkappaB kinase complex. Nature. 395 (6699), 297-300 (1998).
- Yamaoka, S., et al. Complementation cloning of NEMO, a component of the IkappaB kinase complex essential for NF-kappaB activation. Cell. 93 (7), 1231-1240 (1998).
- Li, Z. W., et al. The IKKbeta subunit of IkappaB kinase (IKK) is essential for nuclear factor kappaB activation and prevention of apoptosis. J Exp Med. 189 (11), 1839-1845 (1999).
- Hayden, M. S., Ghosh, S. Shared principles in NF-kappaB signaling. Cell. 132 (3), 344-362 (2008).
- Sun, S. C., Chang, J. H., Jin, J. Regulation of nuclear factor-kappaB in autoimmunity. Trends Immunol. 34 (6), 282-289 (2013).
- Claudio, E., Brown, K., Park, S., Wang, H., Siebenlist, U. BAFF-induced NEMO-independent processing of NF-kappa B2 in maturing B cells. Nat Immunol. 3 (10), 958-965 (2002).
- Senftleben, U., et al. Activation by IKKalpha of a second, evolutionary conserved, NF-kappa B signaling pathway. Science. 293 (5534), 1495-1499 (2001).
- Coope, H. J., et al. CD40 regulates the processing of NF-kappaB2 p100 to p52. EMBO J. 21 (20), 5375-5385 (2002).
- Dejardin, E., et al. The lymphotoxin-beta receptor induces different patterns of gene expression via two NF-kappaB pathways. Immunity. 17 (4), 525-535 (2002).
- Xiao, G., Fong, A., Sun, S. C. Induction of p100 processing by NF-kappaB-inducing kinase involves docking IkappaB kinase alpha (IKKalpha) to p100 and IKKalpha-mediated phosphorylation. The Journal of biological chemistry. 279 (29), 30099-30105 (2004).
- Xiao, G., Harhaj, E. W., Sun, S. C. NF-kappaB-inducing kinase regulates the processing of NF-kappaB2 p100. Molecular cell. 7 (2), 401-409 (2001).
- Qing, G., Qu, Z., Xiao, G. Stabilization of basally translated NF-kappaB-inducing kinase (NIK) protein functions as a molecular switch of processing of NF-kappaB2 p100. J Biol Chem. 280 (49), 40578-40582 (2005).
- Zarnegar, B. J., et al. Noncanonical NF-kappaB activation requires coordinated assembly of a regulatory complex of the adaptors cIAP1, cIAP2, TRAF2 and TRAF3 and the kinase NIK. Nat Immunol. 9 (12), 1371-1378 (2008).
- Vallabhapurapu, S., et al. Nonredundant and complementary functions of TRAF2 and TRAF3 in a ubiquitination cascade that activates NIK-dependent alternative NF-kappaB signaling. Nat Immunol. 9 (12), 1364-1370 (2008).
- Annunziata, C. M., et al. Frequent engagement of the classical and alternative NF-kappaB pathways by diverse genetic abnormalities in multiple myeloma. Cancer cell. 12 (2), 115-130 (2007).
- Keats, J. J., et al. Promiscuous mutations activate the noncanonical NF-kappaB pathway in multiple myeloma. Cancer cell. 12 (2), 131-144 (2007).
- Staudt, L. M. Oncogenic activation of NF-kappaB. Cold Spring Harbor perspectives in biology. 2 (6), a000109 (2010).
- Polley, S., et al. A structural basis for IkappaB kinase 2 activation via oligomerization-dependent trans auto-phosphorylation. PLoS Biol. 11 (6), e1001581 (2013).
- Hinz, M., Scheidereit, C. The IkappaB kinase complex in NF-kappaB regulation and beyond. EMBO Rep. 15 (1), 46-61 (2014).
- Scheidereit, C. IkappaB kinase complexes: gateways to NF-kappaB activation and transcription. Oncogene. 25 (51), 6685-6705 (2006).
- Luckow, V. A., Lee, S. C., Barry, G. F., Olins, P. O. Efficient generation of infectious recombinant baculoviruses by site-specific transposon-mediated insertion of foreign genes into a baculovirus genome propagated in Escherichia coli. J Virol. 67 (8), 4566-4579 (1993).
- Polley, S., et al. Structural Basis for the Activation of IKK1/alpha. Cell reports. 17 (8), 1907-1914 (2016).
- Otwinowski, Z. a. M., W, Processing of X-ray Diffraction Data Collected in Oscillation Mode. Methods in Enzymology. 276 (Macromolecular Crystallography, part A), 307-326 (1997).
- Liu, S., et al. Crystal structure of a human IkappaB kinase beta asymmetric dimer. J Biol Chem. 288 (31), 22758-22767 (2013).
- Emsley, P., Lohkamp, B., Scott, W. G., Cowtan, K. Features and development of Coot. Acta crystallographica. Section D, Biological crystallography. 66 (Pt 4), 486-501 (2010).
- McCoy, A. J., et al. Phaser crystallographic software. Journal of applied crystallography. 40 (Pt 4), 658-674 (2007).
- Vagin, A. T., Teplyakov, A. MOLREP: an automated program for molecular replacement. J. Appl. Cryst. 30, 1022-1025 (1997).
- Brunger, A. T. Version 1.2 of the Crystallography and NMR system. Nature protocols. 2 (11), 2728-2733 (2007).
- Brunger, A. T., et al. Crystallography & NMR system: A new software suite for macromolecular structure determination. Acta crystallographica. Section D, Biological. 54 (Pt 5), 905-921 (1998).
- McRee, D. E. XtalView: a visual protein crystallographic software system for X11/Xview. J. Mol Graph. 10, 44-47 (1992).
- Schroder, G. F., Levitt, M., Brunger, A. T. Super-resolution biomolecular crystallography with low-resolution data. Nature. 464 (7292), 1218-1222 (2010).
- Polley, S., et al. A structural basis for IkappaB kinase 2 activation via oligomerization-dependent trans auto-phosphorylation. PLoS biology. 11 (6), e1001581 (2013).
- Christopher, J. A., et al. The discovery of 2-amino-3,5-diarylbenzamide inhibitors of IKK-alpha and IKK-beta kinases. Bioorganic & medicinal chemistry letters. 17 (14), 3972-3977 (2007).
- Karplus, P. A., Diederichs, K. Linking crystallographic model and data quality. Science. 336 (6084), 1030-1033 (2012).
- Chen, V. B., et al. MolProbity: all-atom structure validation for macromolecular crystallography. Acta crystallographica. Section D, Biological crystallography. 66 (Pt 1), 12-21 (2010).
