Una guía para la producción, cristalización y determinación de la estructura de IKK1/α humano
Summary
IκB cinasa 1/α (CHUK IKK1/α) es una Ser/Thr quinasa que participa en un sinnúmero de actividades celulares principalmente a través de la activación de factores de transcripción NF-κB. Aquí, describimos los principales pasos necesarios para la producción y determinación de estructura cristalina de esta proteína.
Abstract
Una clase de estímulos extracelulares requiere activación de IKK1/α para inducir la generación de una subunidad de NF-κB, p52, por medio del procesamiento de su precursor p100. p52 funciona como un homodímero o un heterodímero con otra subunidad de NF-κB, RelB. Estos dímeros a su vez regulan la expresión de cientos de genes implicados en la inflamación, la supervivencia de la célula y ciclo celular. IKK1/α permanece principalmente asociado con IKK2/β y NEMO como un complejo ternario. Sin embargo, una pequeña piscina de la también se observa como un complex(es) de bajo peso molecular. Se desconoce si la actividad de procesamiento de la p100 es desencadenada por la activación de IKK1/α dentro del más grande o la más pequeña piscina complejo. Actividad constitutiva de IKK1/α se ha detectado en varios tipos de cáncer y enfermedades inflamatorias. Para entender el mecanismo de activación de IKK1/α y permiten su uso como una diana farmacológica, expresamos IKK1/α recombinante en diferentes hosts, como e. coli, insectos y células de mamíferos. Hemos logrado expresar IKK1/α soluble en baculovirus infectan células de los insectos, obtener cantidades de mg de proteína de alta pureza, cristalización en presencia de inhibidores y determinar su estructura de cristal de rayos x. Aquí, describimos los pasos detallados para producir la proteína recombinante, su cristalización y su determinación de estructura cristalina por rayos x.
Introduction
Actividades transcripcionales de la familia del NF-κB de factores de transcripción dimérico son necesarias para diversas funciones celulares que van desde la inflamación y la inmunidad a la supervivencia y muerte. Estas actividades son rigurosamente controladas en las células y una pérdida de regulación conduce a diversas condiciones patológicas, incluyendo enfermedades autoinmunes y cáncer1,2,3. En la ausencia de un estímulo, la actividad de NF-κB se mantiene inhibida de proteínas IκB (inhibidor de – KB)4. La fosforilación de residuos de Ser específicos en proteínas IκB marca por ubiquitinación y degradación proteasomal posterior o procesamiento selectivo5. Dos quinasas Ser/Thr altamente homólogas, IKK2/β y IKK1/α, actúan como reguladores de la central de actividades de NF-κB por llevar a cabo estos eventos de fosforilación6,7.
Interacción entre un ligando y un receptor transmite una señal a través de una serie de mediadores que conducen a la activación de factores NF-κB. El proceso de señalización de NF-κB se puede clasificar ampliamente en dos distintas vías – canónico y no canónico (alternativa)8. La actividad de IKK2/β regula principalmente la señalización de NF-κB de la vía canónica que es esencial para la respuesta inmune inflamatoria y naturales9. Una característica distintiva de esta vía es una activación rápida y de corta duración de IKK2/β10 dentro de un complejo de IKK desacostumbrado hasta entonces bioquímicamente — se presume para ser compuesto de IKK1 IKK2, como un componente regulatorio, NEMO (modulador esencial de NF-κB )11,12,13. Entre las dos subunidades catalíticas de IKK del complejo IKK, IKK2 es sobre todo responsable14 para la fosforilación de los residuos específicos del prototipo IκBs (α, – β y γ-) unido a NF-κB y también una proteína anormal de IκB, NF-κB1/p105, que es un precursor de la de subunidad p50 de NF-κB5. La fosforilación inducida por ubiquitinación y degradación proteasomal de IκB (o procesamiento de p105) conduce a la liberación y activación de un conjunto específico de NF-κB dímeros15. Actividad de NF-κB aberrante debido a función mal regulada de IKK2 se ha observado en muchos tipos de cáncer, así como en trastornos autoinmunitarios2,3,16.
A diferencia de IKK2/β, actividad de IKK1/α regula la señalización de NF-κB de la vía no canónica, que es esencial para el desarrollo y la inmunidad. IKK1 fosforila residuos específicos de NF-κB2/p100 en su segmento terminal C IκBδ, que conduce a su transformación y la generación de p52. La formación del heterodímero p52:RelB transcripcionalmente activo inicia una lenta y sostenida ante las señales del desarrollo7,17,18,19,20. Curiosamente, la generación de la central p52 de factor NF-κB de esta vía es críticamente dependiente de otro factor, cinasa de la inducción de NF-κB (NIK)21,22, pero no en IKK2 o NEMO. En las células de reclinación, el NIK sigue siendo bajo debido a su constante degradación dependiente del proteosoma23,24,25. Sobre el estímulo de las células por ligandos ‘no canónico’ y en ciertas células malignas, NIK se convierte estabilizado para reclutar y activar IKK1 / α. actividades quinasa de NIK y IKK1 son esenciales para la transformación eficiente de p100 en p527. IKK1 y NIK fosforilan tres serinas (Ser866, 870 y 872) de NF-κB2/p100 en su segmento terminal C IκBδ a su procesamiento y la generación de p52. Activación aberrante de la vía no canónica se ha implicado en muchas neoplasias como mieloma múltiple26,27,28.
Se conocen varios inhibidores altamente eficientes y específicos de IKK2/β, aunque ninguno hasta ahora han resultado para ser un fármaco efectivo. Por el contrario, los inhibidores específicos de IKK1/α son escasos. Esto puede deberse en parte a la falta de información estructural y bioquímica de IKK1/α, que limita nuestra comprensión de la base mecanicista de la activación de NF-κB por IKK1 en las células y el diseño racional de medicamentos. Las estructuras de rayos x de IKK2/β nos proporcionan penetraciones en el mecanismo de activación de IKK2/β29; sin embargo, estas estructuras no podían revelar cómo los diferentes estímulos arriba activar activación de IKK1/α o β/IKK2 regular conjuntos distintos de NF-κB actividades 30,31. Entender las bases mecanicistas subyacentes a la función de señalización distintiva de IKK1/α y para establecer una plataforma para el diseño racional de medicamentos, nos enfocamos en determinar la estructura de IKK1/α.
Protocol
Representative Results
Discussion
Solución de producción, estructura y cristalización de dos proteínas relacionadas de IKK
Nos propusimos para determinar la estructura de cristal de rayos x de IKK1/α con la idea de que sería un ejercicio relativamente sencillo dado nuestra experiencia con la producción de proteínas, cristalización y determinación estructural de IKK2/β. Sin embargo, nos quedamos muy sorprendidos que estas dos proteínas relacionadas se comportaron muy diferentemente con respecto a la facilidad de cristalizac…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos al personal de las líneas 19ID, 24ID y 13ID en avanzada fuente de fotones, Lemont, Illinois, para apoyo en la recopilación de datos sobre varios cristales. Agradecemos a Dmitry Lyumkis, Salk Institute para nosotros obtener el mapa de cryo-EM de baja resolución en las primeras etapas del EM mapa/modelo del edificio, que fue utilizado para construir el modelo inicial de búsqueda de recambio molecular de IKK1. La investigación conduce a estos resultados ha recibido financiación de subvenciones de NIH AI064326, CA141722 y GM071862 a GG. SP es actualmente un Wellcome Trust DBT India intermedio.
Materials
| Cellfectin/Cellfectin II | Thermo Fisher Scientific | 10362100 | Cellfectin is now discontinued, replaced by Cellfectin II |
| Sf900 III Insect cell medium | Thermo Fisher Scientific | 12658-027 | |
| SF9 cells | Thermo Fisher Scientific | 12659017 | |
| anti-IKK1 antibody | Novus Biologicals | NB100-56704 | Previously sold by Imgenex |
| anti-PentaHis antibody | Qiagen | 34460 | |
| PVDF membrane | Millipore | IPVH00010 | Nitrocellulose can also be used |
| Ni-NTA agarose | Qiagen | 30210 | |
| Bradford assay reagent | BioRad | 500001 | |
| Superdex 200 column | GE Healthcare | 28989335 | |
| Amicon concentrator | Millipore | UFC801008, UFC803008, UFC201024, UFC203024 | |
| Compound A | Bayer | ||
| Calbiochem IKK-inhibitor XII | Calbiochem | 401491 | |
| Staurosporine | SIGMA | S4400 | |
| MLN120B | Millenium | Gift item | |
| AMPPNP | SIGMA | A2647 | |
| Dextran sulfate | SIGMA | 51227, 42867, 31404, | |
| Dextran sulfate | Alfa Aesar | J62101 | |
| PEG | SIGMA | 93593, 81210, 88276, 95904, 81255, 89510, 92897, 81285, 95172 | Some of them are new Cat # on SIGMA catalogue. What we had was originally from Fluka that had different Cat #. |
| Crystallization Screens | |||
| Crystal Screen I and II (Crystal Screen HT) | Hampton Research | HR2-130 | |
| Index HT | Hampton Research | HR2-134 | |
| PEG/Ion and PEG/Ion2 (PEG/Ion HT) | Hampton Research | HR2-139 | |
| PEGRX 1 and PEGRx 2 (PEGRx HT) | Hampton Research | HR2-086 | |
| SaltRx 1 and SaltRx 2 (SaltRx HT) | Hampton Research | HR2-136 | |
| Crystal mounts | Hampton Research | HR8-188, 190, 192, 194 | |
| Synchrotron | The Advanced Photon Source (APS) at the U.S. Department of Energy’s Argonne National Laboratory | Beamline 19 ID | The Advanced Photon Source (APS) at the U.S. Department of Energy’s Argonne National Laboratory provides ultra-bright, high-energy storage ring-generated X-ray beams for research in almost all scientific disciplines. |
Referências
- Xia, Y., Shen, S., Verma, I. M. NF-kappaB, an active player in human cancers. Cancer immunology research. 2 (9), 823-830 (2014).
- Grivennikov, S. I., Greten, F. R., Karin, M. Immunity, inflammation, and cancer. Cell. 140 (6), 883-899 (2010).
- Ben-Neriah, Y., Karin, M. Inflammation meets cancer, with NF-kappaB as the matchmaker. Nature immunology. 12 (8), 715-723 (2011).
- Hinz, M., Scheidereit, C. The IkappaB kinase complex in NF-kappaB regulation and beyond. EMBO reports. 15 (1), 46-61 (2014).
- Karin, M., Ben-Neriah, Y. Phosphorylation meets ubiquitination: the control of NF-[kappa]B activity. Annu Rev Immunol. 18, 621-663 (2000).
- Ghosh, S., Karin, M. Missing pieces in the NF-kappaB puzzle. Cell. 109, S81-S96 (2002).
- Sun, S. C. The noncanonical NF-kappaB pathway. Immunol Rev. 246 (1), 125-140 (2012).
- Bonizzi, G., Karin, M. The two NF-kappaB activation pathways and their role in innate and adaptive immunity. Trends Immunol. 25 (6), 280-288 (2004).
- DiDonato, J. A., Hayakawa, M., Rothwarf, D. M., Zandi, E., Karin, M. A cytokine-responsive IkappaB kinase that activates the transcription factor NF-kappaB. Nature. 388 (6642), 548-554 (1997).
- Werner, S. L., Barken, D., Hoffmann, A. Stimulus specificity of gene expression programs determined by temporal control of IKK activity. Science. 309 (5742), 1857-1861 (2005).
- Zandi, E., Rothwarf, D. M., Delhase, M., Hayakawa, M., Karin, M. The IkappaB kinase complex (IKK) contains two kinase subunits, IKKalpha and IKKbeta, necessary for IkappaB phosphorylation and NF-kappaB activation. Cell. 91 (2), 243-252 (1997).
- Rothwarf, D. M., Zandi, E., Natoli, G., Karin, M. IKK-gamma is an essential regulatory subunit of the IkappaB kinase complex. Nature. 395 (6699), 297-300 (1998).
- Yamaoka, S., et al. Complementation cloning of NEMO, a component of the IkappaB kinase complex essential for NF-kappaB activation. Cell. 93 (7), 1231-1240 (1998).
- Li, Z. W., et al. The IKKbeta subunit of IkappaB kinase (IKK) is essential for nuclear factor kappaB activation and prevention of apoptosis. J Exp Med. 189 (11), 1839-1845 (1999).
- Hayden, M. S., Ghosh, S. Shared principles in NF-kappaB signaling. Cell. 132 (3), 344-362 (2008).
- Sun, S. C., Chang, J. H., Jin, J. Regulation of nuclear factor-kappaB in autoimmunity. Trends Immunol. 34 (6), 282-289 (2013).
- Claudio, E., Brown, K., Park, S., Wang, H., Siebenlist, U. BAFF-induced NEMO-independent processing of NF-kappa B2 in maturing B cells. Nat Immunol. 3 (10), 958-965 (2002).
- Senftleben, U., et al. Activation by IKKalpha of a second, evolutionary conserved, NF-kappa B signaling pathway. Science. 293 (5534), 1495-1499 (2001).
- Coope, H. J., et al. CD40 regulates the processing of NF-kappaB2 p100 to p52. EMBO J. 21 (20), 5375-5385 (2002).
- Dejardin, E., et al. The lymphotoxin-beta receptor induces different patterns of gene expression via two NF-kappaB pathways. Immunity. 17 (4), 525-535 (2002).
- Xiao, G., Fong, A., Sun, S. C. Induction of p100 processing by NF-kappaB-inducing kinase involves docking IkappaB kinase alpha (IKKalpha) to p100 and IKKalpha-mediated phosphorylation. The Journal of biological chemistry. 279 (29), 30099-30105 (2004).
- Xiao, G., Harhaj, E. W., Sun, S. C. NF-kappaB-inducing kinase regulates the processing of NF-kappaB2 p100. Molecular cell. 7 (2), 401-409 (2001).
- Qing, G., Qu, Z., Xiao, G. Stabilization of basally translated NF-kappaB-inducing kinase (NIK) protein functions as a molecular switch of processing of NF-kappaB2 p100. J Biol Chem. 280 (49), 40578-40582 (2005).
- Zarnegar, B. J., et al. Noncanonical NF-kappaB activation requires coordinated assembly of a regulatory complex of the adaptors cIAP1, cIAP2, TRAF2 and TRAF3 and the kinase NIK. Nat Immunol. 9 (12), 1371-1378 (2008).
- Vallabhapurapu, S., et al. Nonredundant and complementary functions of TRAF2 and TRAF3 in a ubiquitination cascade that activates NIK-dependent alternative NF-kappaB signaling. Nat Immunol. 9 (12), 1364-1370 (2008).
- Annunziata, C. M., et al. Frequent engagement of the classical and alternative NF-kappaB pathways by diverse genetic abnormalities in multiple myeloma. Cancer cell. 12 (2), 115-130 (2007).
- Keats, J. J., et al. Promiscuous mutations activate the noncanonical NF-kappaB pathway in multiple myeloma. Cancer cell. 12 (2), 131-144 (2007).
- Staudt, L. M. Oncogenic activation of NF-kappaB. Cold Spring Harbor perspectives in biology. 2 (6), a000109 (2010).
- Polley, S., et al. A structural basis for IkappaB kinase 2 activation via oligomerization-dependent trans auto-phosphorylation. PLoS Biol. 11 (6), e1001581 (2013).
- Hinz, M., Scheidereit, C. The IkappaB kinase complex in NF-kappaB regulation and beyond. EMBO Rep. 15 (1), 46-61 (2014).
- Scheidereit, C. IkappaB kinase complexes: gateways to NF-kappaB activation and transcription. Oncogene. 25 (51), 6685-6705 (2006).
- Luckow, V. A., Lee, S. C., Barry, G. F., Olins, P. O. Efficient generation of infectious recombinant baculoviruses by site-specific transposon-mediated insertion of foreign genes into a baculovirus genome propagated in Escherichia coli. J Virol. 67 (8), 4566-4579 (1993).
- Polley, S., et al. Structural Basis for the Activation of IKK1/alpha. Cell reports. 17 (8), 1907-1914 (2016).
- Otwinowski, Z. a. M., W, Processing of X-ray Diffraction Data Collected in Oscillation Mode. Methods in Enzymology. 276 (Macromolecular Crystallography, part A), 307-326 (1997).
- Liu, S., et al. Crystal structure of a human IkappaB kinase beta asymmetric dimer. J Biol Chem. 288 (31), 22758-22767 (2013).
- Emsley, P., Lohkamp, B., Scott, W. G., Cowtan, K. Features and development of Coot. Acta crystallographica. Section D, Biological crystallography. 66 (Pt 4), 486-501 (2010).
- McCoy, A. J., et al. Phaser crystallographic software. Journal of applied crystallography. 40 (Pt 4), 658-674 (2007).
- Vagin, A. T., Teplyakov, A. MOLREP: an automated program for molecular replacement. J. Appl. Cryst. 30, 1022-1025 (1997).
- Brunger, A. T. Version 1.2 of the Crystallography and NMR system. Nature protocols. 2 (11), 2728-2733 (2007).
- Brunger, A. T., et al. Crystallography & NMR system: A new software suite for macromolecular structure determination. Acta crystallographica. Section D, Biological. 54 (Pt 5), 905-921 (1998).
- McRee, D. E. XtalView: a visual protein crystallographic software system for X11/Xview. J. Mol Graph. 10, 44-47 (1992).
- Schroder, G. F., Levitt, M., Brunger, A. T. Super-resolution biomolecular crystallography with low-resolution data. Nature. 464 (7292), 1218-1222 (2010).
- Polley, S., et al. A structural basis for IkappaB kinase 2 activation via oligomerization-dependent trans auto-phosphorylation. PLoS biology. 11 (6), e1001581 (2013).
- Christopher, J. A., et al. The discovery of 2-amino-3,5-diarylbenzamide inhibitors of IKK-alpha and IKK-beta kinases. Bioorganic & medicinal chemistry letters. 17 (14), 3972-3977 (2007).
- Karplus, P. A., Diederichs, K. Linking crystallographic model and data quality. Science. 336 (6084), 1030-1033 (2012).
- Chen, V. B., et al. MolProbity: all-atom structure validation for macromolecular crystallography. Acta crystallographica. Section D, Biological crystallography. 66 (Pt 1), 12-21 (2010).
