생산, 결정 화, 및 인간 IKK1/α의 구조 결정에 대 한 안내
Summary
IκB 키 1/α (IKK1/α CHUK)는 Ser/Thr 단백질 키 니 아 NF κB 녹음 방송 요인의 활성화를 통해 주로 세포 활동의 무수 한에 관련 된 이다. 여기, 우리가 생산 및이 단백질의 크리스탈 구조 결정에 필요한 주요 단계를 설명합니다.
Abstract
세포 외 자극의 클래스는 NF-κB 소 단위, p52의 선구자 p100의 처리를 통해의 생성을 유도 하 IKK1/α의 활성화를 필요 합니다. p52는 homodimer 또는 heterodimer 다른 NF-κB 소 단위, RelB와 함께 작동합니다. 이러한 이합체 차례로 염증, 세포 생존, 및 세포 주기 관련된 유전자의 수백의 표정을 통제 한다. IKK1/α 주로 삼항 복합물으로 니 모 IKK2/β와 관련 된 남아 있습니다. 그러나, 그것의 작은 수영장은 또한 낮은 분자량 complex(es)로 관찰 된다. 그것은 p100 처리 작업 내의 더 큰 IKK1/α의 활성화 또는 작은 복잡 한 수영장에 의해 트리거되는 경우 불명 하다. IKK1/α의 제정 활동 여러 암 및 염증 성 질환에서 발견 되었습니다. IKK1/α의 활성화의 메커니즘을 이해 하 고 약물 표적으로 그것의 사용을 가능 하 게, 우리는 대장균, 다른 호스트 시스템에 재조합 IKK1/α를 표현, 곤충 및 포유류 세포. 에 성공 하는 우리 곤충 세포, 밀리 그램 양의 매우 순수한 단백질을 얻기, 억제제, 존재 crystallizing 및 그것의 x 선 결정 구조를 결정 감염 성 IKK1/α 잠재에 표현. 여기, 우리는 재조합 단백질, 그것의 결정 화 및 그것의 x 선 결정 구조 결정 하는 자세한 단계를 설명 합니다.
Introduction
Dimeric 녹음 방송 요인 NF-κB 가족의 transcriptional 활동은 염증과 면역에서 생존과 죽음에 이르기까지 다양 한 세포 기능에 필요 합니다. 이러한 활동은 세포와 자가 면역 질환, 그리고 암1,2,3를 포함 하 여 다양 한 병 적인 조건에 규제 리드의 손실에 엄격 하 게 제어 됩니다. 자극의 부재에서 NF-κB의 활동 저해 IκB (-κB의 억제제) 단백질4에 의해 유지 됩니다. IκB 단백질에 특정 Ser 잔류물 인 산화 ubiquitination 및 후속 proteasomal 저하 또는 선택적 처리5에 대 한 그들을 표시합니다. 두 개의 높은 동종 Ser/Thr kinases, IKK2/β와 IKK1/α, NF-κB 활동의 중앙 레 귤 레이 터가 인 산화 이벤트6,7을 수행 하 여 역할.
ligand와 수용 체 간의 상호 작용 transduces NF κB 요인의 활성화를 선도 하는 중재자의 시리즈를 통해 신호. NF-κB 신호 과정은 광범위 하 게 두 가지 경로-정규 및 비정규 (대체)8로 나눌 수 있다. IKK2/β의 활동은 주로 염증 성 및 타고 난 면역 반응9필수적인 정식 통로의 NF-κB 신호 통제 한다. 이 통로의 뚜렷한 특징은 지금까지 화학적 새롭거나 IKK 복잡 한 내 IKK2/β10 의 신속 하 고 단기 활성화-IKK1 및 IKK2, 뿐만 아니라 규제 구성 요소, 니 모를 찾아서 (NF κB 필수 변조기의 구성 될 것으로 추정 )11,,1213. 2 개의 촉매 IKK subunits IKK 복합물의, 사이 IKK2는 주로 책임14 원형 IκBs (α-β,-γ)의 특정 잔류물의 인 산화에 대 한 NF-κB, 그리고 또한 비정형 IκB 단백질에 바인딩된은 NF-κB1/p105는 NF-κB p50 소 단위5의 전조 인 산화 유도 ubiquitination 그리고 proteasomal IκB (또는 p105의 처리)의 저하 리드 릴리스 및 NF κB 이합체15의 특정 집합의 활성화. IKK2의 미 규제 기능 때문에 탈 선 NF κB 활동 면역 질환2,,316에서 뿐만 아니라 많은 암에 관찰 되었습니다.
IKK2/β, 달리 IKK1/α의 활동 NF κB 개발 및 내성에 대 한 필수적입니다 정식이 아닌 통로의 신호 조절. IKK1 phosphorylates의 처리, p52의 세대의 C-터미널 IκBδ 세그먼트에 NF-κB2/p100의 특정 잔류물. Transcriptionally 활성 p52:RelB heterodimer 형성 발달 신호7,17,18,,1920느리고 지속적인 응답을 시작합니다. 흥미롭게도,이 통로의 중앙 NF κB 요소 p52의 세대는 또 다른 요인은, NF-κB 유도 니 (닉)21,22에 IKK2 또는 니 비판적으로 의존 합니다. 휴식 셀에 닉의 수준 때문에 상수 프로테아좀 종속 저하23,,2425낮은 남아 있습니다. ‘ 비정규 ‘ ligands에 의해 그리고 특정 악성 세포에서 세포의 자극, 시 닉 모집을 활성화 하 고 IKK1 안정 된다/α. 닉의 IKK1 키 니 아 제 활동 p527에 p100의 효율적인 처리를 위해 필수적인. IKK1와 닉 phosphorylate 처리 및 p52의 세대의 C-터미널 IκBδ 세그먼트에 NF-κB2/p100의 3 serines (Ser866, 870, 872). 비정규 통로의 탈 선 활성화 여러 myeloma26,,2728를 포함 하 여 많은 악성 종양에 연루 되었습니다.
비록 아무도 지금까지 것으로 밝혀졌다는 효과적인 약 IKK2/β에 대 한 몇 가지 매우 효율적이 고 구체적인 억제제 알려져 있습니다. 반면, IKK1/α-특정 억제제 스파스 있습니다. 이 일부 IKK1/α, 셀, 및 합리적인 약 디자인에 IKK1에 의해 NF-κB의 활성화의 기계 기초의 우리의 이해를 제한에 대 한 구조 및 생 화 확 적인 정보의 부족에서에서 줄기 수 있습니다. IKK2/β의 엑스레이 구조 IKK2/β29;의 인증 메커니즘에 대 한 통찰력 제공 그러나, 이러한 구조는 어떻게 다른 업스트림 자극 공개 하지 수 IKK1/α 또는 IKK2/β NF κB 활동 30,31의 명료한 세트를 규제의 활성화를 방 아 쇠. 기계적으로 IKK1/α의 뚜렷한 신호 기능을 기본을 이해 하 고 합리적인 약 디자인을 위한 플랫폼을 구축, 우리 IKK1/α의 구조 결정에 집중 했다.
Protocol
Representative Results
Discussion
두 개의 관련된 IKK 단백질의 구조, 결정 화 및 생산 솔루션
우리 개념 그것은 비교적 간단한 운동 IKK2/β 단백질 생산, 결정 화, 및 구조 결정 우리의 경험을 주어진 것으로 IKK1/α의 x 선 결정 구조를 결정 하기 위해 밖으로 설정 합니다. 그러나, 우리가이 두 가지 관련된 단백질 결정의 용이성에 관한 매우 다르게 행동 매우 놀 랐 다. 여러 높은 프로 파일 실험실에서 노력에도 불구 하 ?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
우리 직원을 beamlines 19ID, 24ID, 및 다양 한 결정에는 데이터 수집 중 지원에 대 한 고급 광자 소스, Lemont, 일리노이에서 13ID에 감사합니다. 우리는 우리 안에 지도/모델의 구축, 초기 IKK1 분자 대체 검색 모델을 구축 하는 데 사용 된 초기 단계에서 낮은 해상도 cryo-EM 지도 인출 하기 위한 드미트리 Lyumkis, 솔 크 연구소에 감사. 이러한 결과 연구 GG에 NIH 교부 금 AI064326, CA141722, 및 GM071862에서에서 자금 지원을 받고 있다. SP는 현재 Wellcome 신뢰 DBT 인도 중간 동료.
Materials
| Cellfectin/Cellfectin II | Thermo Fisher Scientific | 10362100 | Cellfectin is now discontinued, replaced by Cellfectin II |
| Sf900 III Insect cell medium | Thermo Fisher Scientific | 12658-027 | |
| SF9 cells | Thermo Fisher Scientific | 12659017 | |
| anti-IKK1 antibody | Novus Biologicals | NB100-56704 | Previously sold by Imgenex |
| anti-PentaHis antibody | Qiagen | 34460 | |
| PVDF membrane | Millipore | IPVH00010 | Nitrocellulose can also be used |
| Ni-NTA agarose | Qiagen | 30210 | |
| Bradford assay reagent | BioRad | 500001 | |
| Superdex 200 column | GE Healthcare | 28989335 | |
| Amicon concentrator | Millipore | UFC801008, UFC803008, UFC201024, UFC203024 | |
| Compound A | Bayer | ||
| Calbiochem IKK-inhibitor XII | Calbiochem | 401491 | |
| Staurosporine | SIGMA | S4400 | |
| MLN120B | Millenium | Gift item | |
| AMPPNP | SIGMA | A2647 | |
| Dextran sulfate | SIGMA | 51227, 42867, 31404, | |
| Dextran sulfate | Alfa Aesar | J62101 | |
| PEG | SIGMA | 93593, 81210, 88276, 95904, 81255, 89510, 92897, 81285, 95172 | Some of them are new Cat # on SIGMA catalogue. What we had was originally from Fluka that had different Cat #. |
| Crystallization Screens | |||
| Crystal Screen I and II (Crystal Screen HT) | Hampton Research | HR2-130 | |
| Index HT | Hampton Research | HR2-134 | |
| PEG/Ion and PEG/Ion2 (PEG/Ion HT) | Hampton Research | HR2-139 | |
| PEGRX 1 and PEGRx 2 (PEGRx HT) | Hampton Research | HR2-086 | |
| SaltRx 1 and SaltRx 2 (SaltRx HT) | Hampton Research | HR2-136 | |
| Crystal mounts | Hampton Research | HR8-188, 190, 192, 194 | |
| Synchrotron | The Advanced Photon Source (APS) at the U.S. Department of Energy’s Argonne National Laboratory | Beamline 19 ID | The Advanced Photon Source (APS) at the U.S. Department of Energy’s Argonne National Laboratory provides ultra-bright, high-energy storage ring-generated X-ray beams for research in almost all scientific disciplines. |
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