मानव IKK1 के उत्पादन, क्रिस्टलीकरण, और संरचना निर्धारण के लिए एक गाइड α/
Summary
IκB कळेनासे 1/α (IKK1/α CHUK) एक Ser/… प्रोटीन कळेनासे कि मुख्य रूप से NF-κB प्रतिलेखन कारकों के सक्रियकरण के माध्यम से सेलुलर गतिविधियों के असंख्य में शामिल है । यहां, हम मुख्य उत्पादन और इस प्रोटीन के क्रिस्टल संरचना निर्धारण के लिए आवश्यक कदम का वर्णन ।
Abstract
extracellular उत्तेजनाओं के एक वर्ग के IKK1/α के एक NF-κB उपइकाई, p52, इसके अग्रदूत p100 के प्रसंस्करण के माध्यम से की पीढ़ी को प्रेरित करने के लिए सक्रियण की आवश्यकता है । p52 एक homodimer या heterodimer के साथ एक अंय NF-κB उपइकाई, RelB के रूप में कार्य करता है । बारी में इन dimers सूजन में शामिल जीन के सैकड़ों की अभिव्यक्ति को विनियमित, कोशिका अस्तित्व, और कोशिका चक्र. IKK1/α मुख्य रूप से एक त्रिगुट परिसर के रूप में IKK2/β और निमो के साथ जुड़े रहता है । हालांकि, यह एक छोटा सा पूल भी एक कम आणविक वजन जटिल (es) के रूप में मनाया जाता है । यह अज्ञात है यदि p100 संसाधन गतिविधि IKK1/α के बड़े या छोटे जटिल पूल के भीतर सक्रियण द्वारा ट्रिगर किया गया है । IKK1/α के गठन गतिविधि कई कैंसर और भड़काऊ रोगों में पाया गया है । IKK1/α के सक्रियण के तंत्र को समझने के लिए, और एक दवा लक्ष्य के रूप में इसके उपयोग को सक्षम, हम विभिंन मेजबान प्रणालियों में रिकॉमबिनेंट IKK1/α, जैसे ई. कोलाई, कीट और स्तनधारी कोशिकाओं के रूप में व्यक्त की । हम baculovirus संक्रमित कीट कोशिकाओं में घुलनशील IKK1/α व्यक्त करने में सफल रहा, अत्यधिक शुद्ध प्रोटीन की मिलीग्राम मात्रा प्राप्त करने, यह अवरोधकों की उपस्थिति में सघन, और अपने एक्स-रे क्रिस्टल संरचना का निर्धारण । यहां, हम विस्तृत चरणों का वर्णन करने के लिए रिकॉमबिनेंट प्रोटीन, इसके क्रिस्टलीकरण, और उसके एक्स-रे क्रिस्टल संरचना निर्धारण का उत्पादन ।
Introduction
dimeric प्रतिलेखन कारकों की NF-κB परिवार के Transcriptional गतिविधियों विविध सेलुलर सूजन और प्रतिरक्षा से बचने और मौत के लिए कार्यों को लेकर कार्य के लिए आवश्यक हैं । इन गतिविधियों को इसरो कोशिकाओं में नियंत्रित कर रहे हैं और विनियमन की हानि विभिन्न रोग की स्थिति की ओर जाता है, स्व-प्रतिरक्षित विकारों सहित, और कैंसर1,2,3. एक उत्तेजना के अभाव में, NF-κB की गतिविधियों IκB द्वारा बाधित रखा जाता है (अवरोध करनेवाला-κB) प्रोटीन4. IκB प्रोटीन पर विशिष्ट Ser अवशेषों के फास्फारिलीकरण उन्हें ubiquitination और बाद में proteasomal क्षरण या चुनिंदा प्रोसेसिंग5के लिए चिह्नित करता है । दो अत्यधिक मुताबिक़ Ser/kinases, IKK2/β और IKK1/α, NF-κB गतिविधियों के केंद्रीय नियामकों के रूप में कार्य इन फास्फारिलीकरण घटनाओं6,7ले जाकर ।
एक ligand और एक रिसेप्टर के बीच बातचीत NF के सक्रियण के लिए अग्रणी मध्यस्थों की एक श्रृंखला के माध्यम से एक संकेत transduces-κB कारकों. NF-κB संकेत प्रक्रिया मोटे तौर पर दो अलग रास्ते में वर्गीकृत किया जा सकता है – विहित और गैर-विहित (वैकल्पिक)8. IKK2/β की गतिविधि मुख्य रूप से विनियमित NF-κB संकेत विहित मार्ग है कि भड़काऊ और जंमजात प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं9के लिए आवश्यक है । इस मार्ग की एक विशिष्ट सुविधा एक तेजी से और कम रहता है IKK2 के सक्रियकरण/β10 एक अब तक जैव रासायनिक विलक्षण मतान्ध परिसर के भीतर — माना IKK1 और IKK2 से बना होना करने के लिए, साथ ही एक विनियामक घटक, निमो (NF-κB आवश्यक मॉडुलन )11,12,13. मतान्ध परिसर के दो उत्प्रेरक मतान्ध उपइकाईयों के बीच, IKK2 prototypical IκBs के विशिष्ट अवशेषों के फास्फारिलीकरण के लिए मुख्य रूप से14 जिंमेदार है (α,-β, &-γ) nf-κB करने के लिए बाध्य, और यह भी एक असामान्य IκB प्रोटीन, nf-κB1/p105, जो एक है NF-κB p50 उपइकाई5के प्रणेता । फास्फारिलीकरण प्रेरित ubiquitination और IκB के proteasomal क्षरण (या p105 के प्रसंस्करण) जारी है और NF के एक विशिष्ट सेट के सक्रियकरण की ओर जाता है-κB dimers15। ंयायपालिका NF-κB IKK2 के एमआईएस विनियमित समारोह के कारण गतिविधि कई कैंसर में मनाया गया है के रूप में के रूप में अच्छी तरह से स्व-प्रतिरक्षित विकारों2,3,16।
IKK2/β, IKK1/α की गतिविधि के विपरीत NF-κB संकेत के गैर-विहित मार्ग है, जो विकास और प्रतिरक्षा के लिए आवश्यक है को नियंत्रित करता है । IKK1 phosphorylates के विशिष्ट अवशेषों NF-κB2/p100 पर अपने सी-टर्मिनल IκBδ खंड है, जो इसके प्रसंस्करण और p52 की पीढ़ी की ओर जाता है । transcriptionally सक्रिय p52 का गठन: RelB heterodimer विकास संकेतों के लिए एक धीमी और निरंतर प्रतिक्रिया शुरू7,17,18,19,20। दिलचस्प है, इस मार्ग के केंद्रीय nf-κB कारक p52 की पीढ़ी गंभीर रूप से एक और कारक पर निर्भर है, nf-κB उत्प्रेरण कळेनासे (NIK)21,22, लेकिन IKK2 या निमो पर नहीं । शेष कोशिकाओं में, NIK का स्तर अपने निरंतर proteasome-निर्भर क्षरण23,24,25के कारण कम रहता है । ‘ गैर ‘ विहित लाइगैंडों द्वारा कोशिकाओं की उत्तेजना पर, और कुछ घातक कोशिकाओं में, NIK को भर्ती करने के लिए स्थिर हो जाता है और IKK1/α. कळेनासे गतिविधियों दोनों NIK और IKK1 के p1007में p52 के कुशल प्रसंस्करण के लिए आवश्यक है सक्रिय । IKK1 और NIK phosphorylate के तीन serines (Ser866, ८७० और ८७२) NF-κB2/p100 अपने C-टर्मिनल IκBδ खंड पर अपने प्रसंस्करण और p52 की पीढ़ी के लिए अग्रणी । गैर विहित मार्ग के ंयायपालिका सक्रियण एकाधिक मायलोमा26,27,28सहित कई द्रोह में फंसाया गया है ।
कई अत्यधिक कुशल और विशिष्ट अवरोधकों IKK2/β के लिए जाना जाता है, हालांकि कोई भी अब तक निकला है एक प्रभावी दवा है । इसके विपरीत, IKK1/α-विशिष्ट अवरोधकों विरल हैं । यह आंशिक रूप से IKK1 पर संरचनात्मक और जैव रासायनिक जानकारी की हमारी कमी से स्टेम कर सकते हैं/α, जो NF के सक्रियकरण के यंत्रवत आधार की हमारी समझ सीमा-κB कोशिकाओं में IKK1 द्वारा, और तर्कसंगत दवा डिजाइन । IKK2/β के एक्स-रे संरचनाओं IKK2/β29के सक्रियकरण तंत्र में अंतर्दृष्टि के साथ हमें प्रदान की; हालांकि, इन संरचनाओं पता चलता है कि कैसे अलग ऊपर उत्तेजनाओं IKK1/α या IKK2 के सक्रियकरण को ट्रिगर नहीं कर सकता/β NF-κB गतिविधियों के विभिन्न सेट को विनियमित करने के लिए 30,31. यंत्रवत IKK1/α के विशिष्ट संकेत समारोह अंतर्निहित आधार को समझने के लिए, और तर्कसंगत दवा डिजाइन के लिए एक मंच स्थापित करने के लिए, हम IKK1/α की संरचना का निर्धारण करने पर ध्यान केंद्रित किया ।
Protocol
Representative Results
Discussion
दो संबंधित मतान्ध प्रोटीन का उत्पादन, सघनकरण और संरचना समाधान
हम बाहर सेट करने के लिए एक्स-रे क्रिस्टल संरचना IKK1/α की धारणा है कि यह एक अपेक्षाकृत सरल IKK2 के साथ हमारे अनुभव दिया जाएगा/β प्रोटीन उत्?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम विभिंन क्रिस्टल पर डेटा संग्रह के दौरान समर्थन के लिए उंनत फोटॉन स्रोत, Lemont, आईएल पर beamlines 19ID, 24ID, और 13ID में कर्मचारियों को धंयवाद । हम दिमित्री Lyumkis, सॉल्क संस्थान के लिए आभारी है उंहें कम संकल्प क्रायो em मानचित्र के प्रारंभिक दौर में उंहें मानचित्र/मॉडल निर्माण, जो प्रारंभिक IKK1 आणविक प्रतिस्थापन खोज मॉडल बनाने के लिए इस्तेमाल किया गया था । इन परिणामों के लिए अग्रणी अनुसंधान NIH अनुदान AI064326, CA141722, और GM071862 से जीजी को धन प्राप्त हुआ है । एसपी का फिलहाल वेलकम ट्रस्ट डीबीटी इंडिया इंटरमीडिएट फेलो है ।
Materials
| Cellfectin/Cellfectin II | Thermo Fisher Scientific | 10362100 | Cellfectin is now discontinued, replaced by Cellfectin II |
| Sf900 III Insect cell medium | Thermo Fisher Scientific | 12658-027 | |
| SF9 cells | Thermo Fisher Scientific | 12659017 | |
| anti-IKK1 antibody | Novus Biologicals | NB100-56704 | Previously sold by Imgenex |
| anti-PentaHis antibody | Qiagen | 34460 | |
| PVDF membrane | Millipore | IPVH00010 | Nitrocellulose can also be used |
| Ni-NTA agarose | Qiagen | 30210 | |
| Bradford assay reagent | BioRad | 500001 | |
| Superdex 200 column | GE Healthcare | 28989335 | |
| Amicon concentrator | Millipore | UFC801008, UFC803008, UFC201024, UFC203024 | |
| Compound A | Bayer | ||
| Calbiochem IKK-inhibitor XII | Calbiochem | 401491 | |
| Staurosporine | SIGMA | S4400 | |
| MLN120B | Millenium | Gift item | |
| AMPPNP | SIGMA | A2647 | |
| Dextran sulfate | SIGMA | 51227, 42867, 31404, | |
| Dextran sulfate | Alfa Aesar | J62101 | |
| PEG | SIGMA | 93593, 81210, 88276, 95904, 81255, 89510, 92897, 81285, 95172 | Some of them are new Cat # on SIGMA catalogue. What we had was originally from Fluka that had different Cat #. |
| Crystallization Screens | |||
| Crystal Screen I and II (Crystal Screen HT) | Hampton Research | HR2-130 | |
| Index HT | Hampton Research | HR2-134 | |
| PEG/Ion and PEG/Ion2 (PEG/Ion HT) | Hampton Research | HR2-139 | |
| PEGRX 1 and PEGRx 2 (PEGRx HT) | Hampton Research | HR2-086 | |
| SaltRx 1 and SaltRx 2 (SaltRx HT) | Hampton Research | HR2-136 | |
| Crystal mounts | Hampton Research | HR8-188, 190, 192, 194 | |
| Synchrotron | The Advanced Photon Source (APS) at the U.S. Department of Energy’s Argonne National Laboratory | Beamline 19 ID | The Advanced Photon Source (APS) at the U.S. Department of Energy’s Argonne National Laboratory provides ultra-bright, high-energy storage ring-generated X-ray beams for research in almost all scientific disciplines. |
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